人源间充质干细胞（MSCs）免疫调节特性的评估

本实验的总体目标是评估人源间充质干细胞（msc）的免疫调节特性。该方法有助于阐明人源间充质干细胞免疫调节过程中所涉及的机制，这一过程可能具有治疗意义。该技术的主要优势在于，既可评估效应性白细胞增殖的发生情况，也可测定细胞分裂次数，从而证明该实验方案的可行性。

我实验室的一名技术人员在分离PBMC时，首先将25毫升肝素抗凝的全血样本与25毫升PBS在50毫升锥形管中混匀稀释。接着，向另一支新的50毫升离心管中加入15毫升菲可-帕克（Ficoll-Paque）密度梯度液。然后将离心管倾斜，缓慢地将稀释后的细胞悬液叠加在密度梯度液上方。

做到这一点后，各层之间不会发生混合。本实验中最关键的步骤之一是在不扰动密度梯度的情况下将血液小心分层。这是为了确保所分离的外周血单个核细胞（PBMC）具有高纯度和低红细胞污染。

现在通过离心分离细胞，应可见三个 distinct 层：上层的血浆层、下层的菲科尔密度梯度层，以及中间一层较薄的外周血单个核细胞（PBMC）层。

使用 PE 移液器小心移除上层液体，注意不要吸到中间相层。然后使用 10 毫升移液器将 PBMC 轻柔转移至 50 毫升锥形管中。用 20 毫升 PBS 重悬细胞，随后离心以去除密度梯度液的残留痕迹。

然后用另外20毫升PBS洗涤沉淀，以去除血小板。将第二次获得的沉淀重悬于完全白细胞培养基中，浓度为每毫升1×10⁷个细胞。为建立间充质干细胞（MSC）与白细胞的共培养体系，将完全MSC培养基预热至37摄氏度，加热时间不超过30分钟。

然后将5 × 10⁴个MSC接种于24孔板中，每孔加入1 mL完全MSC培养基，在37°C培养过夜，使细胞贴壁并达到80%融合度。次日早晨，吸除培养基，并在1 mL完全白细胞培养基中加入适量CFSE标记的外周血单个核细胞（PBMC）与MSC共培养。MSC与PBMC的比例为1:10，并在完全白细胞培养基中加入10 µg/mL植物血凝素（PHA）以激活细胞。

然后在共培养的第3天和第5天，将适量的共培养物转移至圆底离心管中，并通过流式细胞术分析CFSE标记的白细胞增殖情况，以进行效应细胞抑制实验。首先建立MSC-PBMC共培养体系，具体方法如前所述：将2.5 × 10⁶个PBMC与250,000个MSC共培养，以确保有足够的MSC共培养PBMC用于亚群筛选。

在37摄氏度培养48至72小时后，使用适当的磁珠分选目标MSC诱导的免疫调节性白细胞。然后，在每孔1毫升完全白细胞培养基中加入CFSE标记的同种异体CD4阳性T细胞，按不同的实验比例进行共培养。接着，加入抗CD3/CD28偶联微珠，按微珠与细胞1:1的比例刺激CD4阳性T细胞。

共培养第三天，通过流式细胞术评估CFSE标记的CD4阳性T细胞的增殖情况。间充质干细胞（MSCs）为贴壁细胞，呈成纤维细胞样梭形形态；而外周血单个核细胞（PBMC）和白细胞为体积较小、圆形、非贴壁细胞，因此可清晰区分这两种细胞群体。在共培养体系中，若无细胞增殖发生，CFSE标记的细胞表现为一个高度阳性且荧光信号锐利的单峰；当细胞被激活后，则出现荧光强度递减的多个子代峰。

增殖表现为多个较小的峰，当增殖受到抑制时，荧光强度降低并向左偏移。例如，在间充质干细胞（MSC）共培养中，随着峰向右移动且最右侧峰的尖锐程度增加，多个较小峰的数量减少，同时荧光强度相应增加，这表明效应细胞抑制实验中未分裂细胞的比例上升。间充质干细胞对CD4阳性T细胞增殖的抑制作用还可通过剂量依赖的方式进一步评估。

观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何评估人源间充质干细胞的免疫调节作用。请务必注意，操作人源细胞可能存在生物安全风险，因此必须始终采取适当的防护措施。