利用荧光标记纳米颗粒检测小鼠、人类和猪源性活细胞内的基因表达

本实验的总体目标是通过应用基因特异性的荧光纳米颗粒，直接在活细胞内分析基因表达。该目标的实现首先需要确定目标基因中的合适靶序列；第二步是制备带有特异性捕获链和报告链的纳米颗粒。

接下来，将纳米颗粒直接加入活细胞的培养基中。最后一步是在37摄氏度、5% CO2的湿润环境中孵育细胞与纳米颗粒过夜。最终，利用荧光显微镜观察活的目标细胞中基因特异性的荧光信号，同时通过流式细胞术分析定量荧光阳性细胞的数量。

与现有的免疫组织化学、分子信标或PCR分析等方法相比，该技术的主要优势在于无需对细胞培养物进行任何操作，即可在活细胞中直观地观察基因表达。接下来由我们实验室的生物学家、博士生玛蒂娜·特蕾莎（Martina Teresa）演示实验操作步骤，流式细胞术部分由林内特·亨克尔（Lynette Henkel）完成。在确定靶序列后，从商业来源订购冻干的金纳米颗粒。

这些颗粒由一个中心金颗粒组成，该金颗粒通过共价键连接一条捕获链，而捕获链又与一条报告链结合。当目标 mRNA 与捕获链结合后，报告链及其连接的荧光团被释放到溶液中，从而使 Fluor four 发出荧光。在重建之前。

纳米颗粒应避光保存于纸板箱中，置于4°C环境下。为重组金纳米颗粒，加入20微升双蒸水，最终浓度为100纳摩尔。重组后的纳米颗粒可在避光条件下室温保存至少一年。

在使用当天，将金纳米颗粒的储备液用PBS稀释成20倍工作液，从细胞培养箱中取出含有HEK 293细胞的24孔板，吸除培养基，每孔加入237.5 µL新鲜培养基，再向各孔中加入12.5 µL纳米颗粒工作液，轻轻摇动培养板以确保纳米颗粒均匀分布。将细胞置于37°C、5% CO₂的湿润环境中过夜培养。第二天。

使用标准荧光显微镜分析细胞培养物中基因特异性位点三的荧光，以准备进行流式细胞术。用 PBS 洗涤一次显示位点三诱导荧光的 HEK 293 细胞，加入 1 毫升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA，在 37 摄氏度和 5% CO2 条件下孵育细胞 3 分钟。孵育结束后，加入 0.5 毫升 CO 培养基，上下吹打混匀。

然后将细胞转移至15毫升离心管中，加入3毫升培养基，以300 × g离心5分钟。接着弃去上清液，将细胞重悬于200微升预冷的FACS缓冲液中。将细胞转移至1.5毫升离心管中，置于冰上避光保存，直至分析。

进行传真分析之前，需将细胞通过30微米滤器，以防止细胞聚集。然后向细胞中加入碘化丙啶，终浓度为每毫升2微克，孵育至少2分钟，将细胞混匀后转移至流式细胞仪，并将样品管加载到仪器中。用于检测SI3阳性细胞。

使用未经处理的对照细胞，在前向散射（FSC）面积与侧向散射（SSC）面积的散点图上设置层级门控，以及在FSC高度与FSC宽度、SSE高度与SSE宽度的子集中进行门控，以排除细胞碎片和未充分散射的细胞。根据碘化丙啶染色结果，通过展示PE通道与PE Texas Red通道排除死细胞，然后在第三检测位点对PE阳性细胞进行最终分选门控。检测GA脱氢酶。

在 HEK 293 细胞中检测了一个组成型表达的看家基因，以验证实验的可行性。阴性对照纳米颗粒（随机序列）显示极少或几乎无荧光，而永久性荧光阳性摄取组则显示明显荧光。对照组在过夜孵育后显示出强烈的信号。

这些纳米颗粒被证实可特异性检测多能干细胞标志物，即在人和猪的诱导性多能干细胞（IPCs）中，纳米颗粒与GDF3基因表达呈镜像关系。重要的是，这些标志物仅在IPCs中被检测到，而在作为IPS细胞培养过程中饲养层的成纤维细胞中则未检测到。通过流式细胞术进行的视觉和定量分析被用于评估GA DH纳米颗粒（分级版本）在0至1000浓度梯度下的标记效率。

使用HEK 293细胞进行了皮摩尔浓度实验，结果显示荧光强度随浓度增加而明显增强。随后在小鼠胚胎干细胞中进行定量分析，结果显示在加入400皮摩尔浓度的GADH纳米颗粒后，约有40%的细胞呈CY3阳性。多能性标志物也获得了类似的结果。

掌握纳米颗粒和GDF-3技术后，若操作得当，该技术可在16小时内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用基因特异性纳米颗粒，通过荧光显微镜直接在活细胞内检测细胞内基因表达。