Name: 利用荧光标记的纳米粒子检测的小鼠，人与猪源活细胞内的基因表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学习利用荧光标记纳米粒子检测小鼠、人和猪源活细胞内基因表达的方法。该技术通过荧光显微镜和流式细胞术实现实时可视化，无需细胞操作即可分析特定基因表达，为神经科学和细胞生物学研究提供重要工具。

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感谢 Lynette Henkel 在进行流式细胞术分析过程中提供的出色支持。感谢 Don Weldon 博士和 Victor Koong 博士（美国加利福尼亚州特梅库拉）对稿件的审阅以及提出的宝贵意见。本研究得到了德国研究基金会资助项目 KR-3770-7/1 和 KR-3770-9/1（M. K.）、德国心脏研究基金会资助项目 F/37/11（M. K.）、德国心脏研究基金会与德国胸心及血管外科学会联合颁发的 Dr. Rusche 2014 年研究基金（M.-A. D.），以及德国心血管研究中心支柱 B 项目 DZHK B 13-050A 和 DZHK B 14-013SE（M. K.）的资助。

1. 培养基、试剂和细胞培养条件的准备
<ol>
	<li>人源 HEK 293 胚胎肾细胞
	<ol>
		<li>在添加 5% 胎牛血清（FCS）、L-谷氨酰胺（2 mM）以及青霉素（100 U/ml）/链霉素（100 µg/ml）的 DMEM/Ham’s F-12 培养基中培养 HEK 293 细胞（CRL-1573，ATCC）。</li>
		<li>传代细胞时，用 PBS 洗涤细胞一次，加入 0.05% 胰蛋白酶/EDTA，于 37 °C 及 5% CO2 条件下孵育 3 分钟。将细胞转移至 15 ml 离心管中，以 1,200 rpm（300 x g）离心 5 分钟，取约 5×105 个细胞接种至新的 T25 培养瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）
	<ol>
		<li>向单个 6 孔板孔中加入 1 ml 0.1% 明胶溶液，在室温（RT）下孵育 1 小时。吸除液体后，于室温保存备用。</li>
		<li>在经明胶包被的 6 孔板中，使用添加 10% FCS、L-谷氨酰胺（2 mM）、L-葡萄糖（4.5 g/l）、丙酮酸钠（1 mM）以及青霉素（100 U/ml）/链霉素（100 µg/ml）的 DMEM 培养基培养 MEFs。</li>
		<li>将 MEFs 接种至 6 孔板中，使其生长至汇合。加入丝裂霉素（5 µg/ml）处理 2.5 小时以阻滞细胞增殖。吸除培养基，用完全 MEF 培养基洗涤细胞两次，每孔加入 3 ml MEF 培养基。这些细胞作为小鼠和猪 iPS 细胞的饲养层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠 ES 细胞和 iPS 细胞的培养
	<ol>
		<li>配制小鼠 ES 细胞培养基：在 DMEM 培养基中添加 15% FCS、L-谷氨酰胺（2 mM）、L-葡萄糖（4.5 g/l）、MEM 非必需氨基酸（1X）、β-巯基乙醇（0.1 mM）以及白血病抑制因子（1,000 U/ml）。</li>
		<li>用无血清 DMEM 洗涤含生长阻滞 MEFs 的 6 孔板一次，每孔加入 2 ml 小鼠 ES 培养基及小鼠 iPS 细胞（相当于一个汇合培养皿中 20% 的细胞量）。每天用无血清 DMEM 洗涤细胞一次，并更换 2 ml 新鲜的小鼠 ES 培养基。</li>
		<li>传代时，每孔用无血清 DMEM 洗涤一次，加入 0.25% 胰蛋白酶/EDTA，在 37 °C 及 5% CO2 条件下孵育 3 分钟。将细胞转移至 15 ml 离心管中，以 1,200 rpm（300 x g）离心 5 分钟，用 500 µl 小鼠 ES 培养基重悬细胞，取 100 µl 细胞悬液接种至含 MEF 饲养层的新 6 孔板中，加入 2 ml 小鼠 ES 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>猪 iPS 细胞的培养
	<ol>
		<li>配制猪 iPS 培养基：在 DMEM/Ham’s F-12 培养基中添加 20% Knockout 血清、L-谷氨酰胺（2 mM）、MEM 非必需氨基酸（1X）、β-巯基乙醇（0.1 mM）以及青霉素（100 U/ml）/链霉素（100 µg/ml）。经 0.22 µm 滤器过滤后，于 4 °C 保存 2 至 3 周。首次使用时，加入 bFGF 至终浓度 10 ng/ml。</li>
		<li>用无血清 DMEM/Ham’s F-12 洗涤含生长阻滞 MEFs 的 6 孔板一次，每孔加入 1.5 ml 猪 iPS 培养基及猪 iPS 细胞（相当于一个汇合培养皿中 10% 的细胞量）。每天用无血清 DMEM/Ham’s F-12 洗涤细胞一次，并更换 1.5 ml 新鲜猪 iPS 培养基。</li>
		<li>配制解离缓冲液：将 2.5% 胰蛋白酶、IV 型胶原酶（10 mg/ml）、Knockout 血清（20%）和 CaCl2（1 mM）加入无 Ca2+ 的 PBS 中。用 PBS 洗涤细胞两次，加入解离缓冲液，在 37 °C 及 5% CO2 条件下孵育 5 分钟。将细胞转移至 15 ml 离心管中，以 1,200 rpm（300 x g）离心 5 分钟。</li>
		<li>用 500 µl 新鲜猪 iPS 培养基重悬猪 iPS 细胞，取 50 µl 细胞悬液接种至含 MEF 饲养层的新 6 孔板中，加入 1.5 ml 猪 iPS 培养基。每天用无血清 DMEM/Ham’s F-12 洗涤细胞一次，并更换 1.5 ml 新鲜猪 iPS 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>无饲养层的人源 iPS 细胞培养
	<ol>
		<li>将含有基底膜基质的原装冻存管于 4 °C 解冻，用预冷的无血清 DMEM/Ham’s F-12 培养基稀释至 8 mg/ml，分装后于 -20 °C 保存备用。</li>
		<li>取一份基底膜基质于 4 °C 解冻，用预冷的无血清 DMEM/Ham’s F-12 培养基稀释至 90 µg/ml。取 1 ml 该溶液加入 3 cm 培养皿中，轻轻旋转使整个表面均匀覆盖。用封口膜密封后，于 4 °C 保存最多一周。使用前，将培养皿于 37 °C 孵育 30 分钟或室温孵育 3 小时，使基底膜基质聚合。</li>
		<li>吸除经基底膜基质包被的培养皿中的培养基，用无血清 DMEM/Ham’s F-12 洗涤两次。每皿加入 1.5 ml E8 培养基及人源 iPS 细胞（相当于一个汇合培养皿中 10% 的细胞量）。每天用无血清 DMEM/Ham’s F-12 洗涤细胞一次，并更换 1.5 ml 新鲜 E8 培养基。</li>
		<li>传代时，用 PBS 洗涤培养皿两次，加入 1 ml PBS/0.5 mM EDTA，在室温孵育 5 分钟。在显微镜下观察细胞。注意：当细胞集落开始变圆并出现孔洞时，即可进行转移。</li>
		<li>吸除液体，加入 1.5 ml E8 培养基，通过轻柔吹打使细胞脱落。将细胞转移至 15 ml 离心管中，以 1,200 rpm（300 x g）离心 5 分钟，用 500 µl E8 培养基重悬细胞，取 50 µl 细胞悬液接种至经基底膜基质包被的新培养皿中，加入 1.5 ml E8 培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 跨物种边界的靶序列设计
<ol>
	<li>选择目的基因（GAPDH, NANOG, GDF3）的参考人源、小鼠和猪源 cDNA 序列，并进行 CLUSTAL 多序列比对分析。 
	注意：这将显示物种间同源的序列。
	<ol>
		<li>多序列比对使用以下参数：空位罚分（固定）10，空位罚分（可变）5，转换加权 0，空位分离罚分范围 8，延迟的序列一致性百分比 40，最大迭代次数 3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将选定的目的序列提交给生产商（参见材料表），用于探针设计与生产。 
	注意：生产商将确认所选序列与该技术的兼容性。如果所选序列不兼容，生产商将建议替代序列。
	<ol>
		<li>确保可用于潜在捕获链序列的同源区域长度为 27 bp。 
		注意：建议为选定的目的基因订购多个带有不同捕获链的纳米颗粒，因为只有真实的细胞实验才能最终验证单个序列的功能性。因此，针对 GAPDH 和 GDF3 分别评估了两个不同的序列，而为评估 NANOG 的表达则测试了三种不同的纳米颗粒。它们的位置及确切序列已在别处发表17。生产商以冻干形式提供按需求序列制备的纳米颗粒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 纳米颗粒的重建及添加至细胞培养物
<ol>
	<li>收到冻干的纳米颗粒后，置于 4 °C 避光保存。</li>
	<li>加入 50 µl 双蒸水重悬纳米颗粒，得到终浓度为 100 nM 的溶液。重悬后于室温避光保存。注意：在此条件下，纳米颗粒至少可稳定保存一年。将重悬后的样品置于 4 °C 保存可能对其稳定性产生不利影响。</li>
	<li>在使用当天，用 PBS 将纳米颗粒储备液预稀释至 2 nM（HEK 293 细胞）或 8 nM（iPS 和 ES 细胞）。注意：该浓度为培养皿中终浓度的 20 倍。在 iPS 细胞和 ES 细胞中，400 pM 的纳米颗粒即可在显微镜下产生易于检测的荧光信号；对于 HEK 293 细胞，100 pM 的浓度已足够。</li>
	<li>将 12.5 µl 预稀释后的纳米颗粒加入含有 237.5 µl 完全培养基的 24 孔板中。对于不同规格的培养孔，请相应调整体积。轻轻摇动培养板以确保纳米颗粒均匀分布。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿润环境中孵育过夜（O/N）。</li>
	<li>次日，在荧光显微镜下使用激发波长 546 nm（发射波长 575 – 640 nm）观察细胞培养物中基因特异性的 Cy3 荧光信号。注意：获得足够强荧光信号所需的时间可能因细胞类型和靶基因而异。在本实验中，探针处理后 16 至 20 小时内即可观察到荧光信号。</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术鉴定 Cy3 阳性细胞群体
<ol>
	<li>分别使用第1.1节或第1.3节中指定的条件培养HEK 293细胞或小鼠ES细胞。在FACS分析前一天，向HEK 293细胞中加入不同浓度的靶向GAPDH的纳米颗粒（见图6A），向小鼠ES细胞中加入400 pM的纳米颗粒。将细胞在37 °C、5% CO2的湿润环境中孵育过夜。</li>
	<li>在荧光显微镜下观察细胞培养物中基因特异性的Cy3诱导荧光。</li>
	<li>按照第1.1.2点所述方法消化HEK 293细胞。离心后转移至1.5 ml离心管中，用200 µl预冷的PBS/0.5% BSA/2 mM EDTA（FACS缓冲液）重悬细胞。在流式细胞术分析前将细胞置于冰上避光保存。</li>
	<li>按照第1.3.3点所述方法消化小鼠ES细胞。离心后转移至1.5 ml离心管中，用200 µl预冷的PBS/0.5% BSA/2 mM EDTA重悬细胞。在流式细胞术分析前将细胞置于冰上避光保存。</li>
	<li>在FACS分析前2分钟，将细胞通过30 µM滤膜以防止细胞聚集，并加入碘化丙啶（终浓度为2 µg/ml），以排除死细胞。</li>
	<li>为分析Cy3阳性细胞，首先在FSC-A/SSC-A、FSC-H/FSC-W和SSC-H/SSC-W子集中设置分层门控。利用前向散射和侧向散射排除细胞碎片及非散射细胞。通过碘化丙啶染色（在PE与PE-Texas Red通道中显示）排除死细胞。最终对Cy3-PE阳性细胞进行分选门控（图4）。</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
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<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+adult+rhesus+monkey+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).</li>
<li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).</li>
<li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+leukemia+inhibitory+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor-dependent+induced+pluripotent+stem+cells+from+canine+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).</li>
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<li>Esteban, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+Tibetan+miniature+pig%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig.</a> J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).</li>
<li>Maekawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+somatic+cells+is+promoted+by+maternal+transcription+factor+Glis1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1.</a> Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).</li>
<li>Marti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).</li>
<li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+gingival+fibroblasts+and+periodontal+ligament+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts.</a> J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).</li>
<li>Chan, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+distinguishes+bona+fide+human+iPS+cells+from+partially+reprogrammed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.</a> Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).</li>
<li>Singh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+alkaline+phosphatase+substrate+for+identification+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev.+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).</li>
<li>Kang, N. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cell+staining+and+sorting+with+the+live-cell+fluorescence+imaging+probe+CDy1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).</li>
<li>Ban, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+cardiomyocytes+from+differentiating+pluripotent+stem+cells+using+molecular+beacons+targeting+cardiomyocyte-specific+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA.</a> Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).</li>
<li>Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-flares%3A+probes+for+transfection+and+mRNA+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).</li>
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</ol>

H.L. 免费从 EMD Millipore Corporation 获得了纳米颗粒。其余所有作者均无任何利益冲突披露。

本研究描述了使用荧光标记的纳米颗粒，可在荧光显微镜下直接对来自不同哺乳动物物种、具有不同组织发生来源的活细胞进行细胞内基因表达的可靠评估。与已发表的其他方法相比，该方法具有若干优势。首先，研究人员在目标基因或细胞类型的选择上不受限制。所有基于抗体的检测方法均局限于单一表位。尽管荧光分子信标也可针对广泛范围的基因进行设计，但该方法需要对细胞进行解离并随后进行核转染15。相比之下，基因特异性纳米颗粒的应用无需对靶细胞进行任何操作，细胞可通过内吞作用主动摄取这些纳米颗粒。在后续传代过程中，金颗粒会逐渐离开细胞，因此细胞培养物仍可用于后续实验。
然而，该技术仍存在一些局限性。由于某些标志物具有糖类性质，例如 SSEA-1 或 TRA-1-81，因此明显无法被检测到20。目前市面上已有多种纳米颗粒可供选择，这些颗粒均已预先测试其在细胞实验中的功能特性。本研究的目的是设计可跨物种使用的定制探针。在采用此类方法或针对新靶基因设计探针时，必须认识到，对in silico预测的探针功能必须在in vitro条件下进行充分评估。例如，NANOG-SF3 探针虽然与序列同源性达到100%，却完全无法发挥作用；而 NANOG-SF1 探针在小鼠和猪的序列中存在一个错配碱基，却产生了良好的荧光信号。另一个问题是纳米颗粒的有效摄取。这些颗粒通过内吞作用进入细胞，该过程受纳米颗粒大小21、细胞类型和分化状态22以及细胞进行吞噬和巨胞饮的能力23的影响。为获得满意的荧光信号，其最佳浓度需针对每种具体应用或细胞系进行测试。因此，在开展靶基因表达特异性检测之前，首次实验应始终先进行摄取对照实验，以评估探针在特定细胞类型和培养条件下的适用性。
将本实验方案应用于新的细胞系或细胞群体时，获得可靠结果的一个关键点是必须设置适当的对照组。持续发光的摄取对照可提示哪些浓度的纳米颗粒将在目标细胞群体中诱导出足够的荧光信号。由于信号会随时间减弱，荧光应在第二天进行评估17。同时，阴性对照（即在真核基因组中无对应序列的乱序序列对照）应在相同浓度下处理，且必须仅产生可忽略的背景信号。作为第三种对照，建议使用针对持家基因（例如 GAPDH、β-Actin）的纳米颗粒。这些纳米颗粒可作为阳性对照，验证该方法可用于检测所选目标细胞群体中特定基因的表达。若上述对照结果满意，则可预期使用针对其他目标基因的特异性纳米颗粒也能获得可靠的特异性荧光信号。所用纳米颗粒的浓度也可能至关重要，因为已有研究表明高浓度纳米颗粒可下调目标序列24。然而，该效应需要远高于本实验所用浓度（400 pM）的浓度（5 nM）。在本实验所用浓度下，纳米flare不会影响目标基因的mRNA或蛋白质水平，浓度高达2 nM时也不会影响HEK293细胞和小鼠ES细胞的增殖17。此外，全基因组表达分析未发现基因表达存在显著变化25。因此，在浓度不超过1 nM时，纳米flare不应表现出任何重要的不良效应。
该技术一个极具前景的应用是能够标记由特定基因标识的任何给定细胞群体。近期，基因特异性纳米颗粒已成功用于选择性染色活体心室心肌细胞。 26黑色素瘤细胞亚群 27单核细胞 28 小脑细胞培养 29此类荧光标记的细胞群体可通过流式细胞术分选并纯化为活细胞。在肿瘤学领域，可根据动物模型中转移性肿瘤细胞的表达特征，分离获取活的转移性肿瘤细胞。 癌胚抗原，对于寻找潜在的转移促进基因或靶向结构最具价值。我们最近的研究表明，真正重编程的小鼠iPS克隆可以被鉴定出来 原位 与 Nanog基于检测到的荧光强度的特异性纳米颗粒 17因此，真正重编程的iPS克隆可在高通量平台上进行鉴定，该平台利用机器人荧光检测与克隆挑选装置识别最具潜力的克隆。该技术在多个研究领域中均显示出适用于筛选特定细胞亚群的潜力，且纳米颗粒似乎可应用于高通量平台。综上所述，本方案代表了一种新颖的方法，即利用荧光标记的纳米颗粒，实现对活细胞内基因表达的直接检测。该技术有望成为在多个研究领域中纯化、扩增并进一步表征稀有细胞亚群的重要工具。

2006年，一种将体细胞重编程为多能状态的新方法被提出。在对一系列潜在重编程因子进行预筛选后，研究人员通过逆转录病毒转导并过表达四种转录因子（Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc），成功将小鼠成纤维细胞转化为所谓的诱导性多能干细胞（iPS）1。随后，该技术被有效复制于多种哺乳动物的体细胞，包括人类2、猴子3、大鼠4、狗5、绵羊6和猪7。此外，已有研究报道了改良的实验方案，省略或替换了具有潜在致癌风险的转录因子c-MYC8, 9。
无论采用何种初始重编程方法，都必须确认正在生长的克隆是否具有真正的多能性，这是一项费力且耗时的工作。大多数此类分析的一个主要缺点是无法在活细胞上进行。已确立的多能性因子如 OCT4、SOX2、NANOG 或 REX1 均为位于细胞核内的转录因子，其检测需要在进行免疫组织化学染色或RT-PCR分析前对细胞进行固定或裂解10 - 12。此后，这些细胞将无法用于需要对每个克隆进行重复培养的后续实验。
因此，一种能够在活细胞上分析多能性的技术具有很高的需求。确实已有多种方法可直接用于活细胞，例如使用靶向膜抗原的抗体（例如 TRA-1-60、SSEA4）12、荧光报告染料检测碱性磷酸酶活性13，或可特异性标记胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）的小分子化合物14。然而，这些抗体仍可能对细胞产生不利影响，且每种方法仅限于单一的多能性标志物。最后，已有研究报道使用荧光分子信标——一类具有发夹结构的双链反义寡核苷酸——实现对活细胞的染色15。尽管该方法可应用于多个基因，但该技术需要对单细胞悬液进行核转染，因而不适用于正在生长的iPS细胞集落。
几年前，已有研究描述了基因特异性的纳米颗粒，用于分析人 SKBR3 乳腺癌细胞中survivin的表达16。本文描述了一种新颖且创新的方法，通过使用金纳米颗粒偶联物，在活体胚胎干细胞（ES）和诱导多能干细胞（iPS）中检测多能性标志物。这些纳米颗粒由一个中心金颗粒组成，其上连接了一条携带互补RNA序列的捕获链和一条Cy3标记的报告链。报告链的荧光信号被中心金颗粒淬灭。此外，相应的纳米颗粒分别作为阴性对照和阳性对照（图1）。在实际应用中，只需将纳米颗粒加入培养基中（图2），它们便可通过内吞作用进入细胞（图3）。当目标RNA表达时，会置换出报告链，使其发出荧光信号。该方法无需对目标细胞进行基因操作，可在荧光显微镜下直接对活细胞中的目标基因表达进行光学监测。此外，该技术可跨物种应用于iPS细胞中的任意目标基因，因此可在多种不同的研究领域中使用。最后，通过流式细胞术分析，可实现对Cy3阳性细胞的鉴定与富集。

<table><tbody><tr><td>含稳定谷氨酰胺的DMEM/Ham's F12培养基</td><td>Biochrome GmbH</td><td>FG4815</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（100倍浓度）</td><td>Millipore</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100倍浓度）</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>高糖DMEM培养基（含稳定谷氨酰胺）</td><td>Biochrome GmbH</td><td>FG0435</td><td></td></tr><tr><td>丝裂霉素C</td><td>Roche</td><td>10 107 409 001</td><td>抑制MEF细胞分裂</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸（100倍浓度）</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子（10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; U/ml）</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>小鼠胚胎干细胞和诱导多能干细胞的生长因子，可防止分化</td></tr><tr><td>0.25%胰蛋白酶/EDTA（1倍浓度）</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>用于解离贴壁细胞培养物</td></tr><tr><td>Knockout血清替代物</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>人源和猪源诱导多能干细胞培养的补充剂</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>人源和猪源诱导多能干细胞的生长因子</td></tr><tr><td>IV型胶原酶</td><td>Worthington</td><td>LS004188</td><td>用于猪源诱导多能干细胞的解离</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>适用于无饲养层培养人源诱导多能干细胞的有效表面，在文稿中称为基底膜制备物</td></tr><tr><td>E8培养基</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05940</td><td>在Matrigel上进行无饲养层人源诱导多能干细胞培养的化学成分明确培养基</td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>SmartFlare探针</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>定制产品</td><td>用于活细胞内基因表达的检测，在文稿中称为纳米颗粒</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>HeraCell 150i CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>明胶（来自猪皮）</td><td>Sigma</td><td>G6144</td><td>增强MEF细胞在表面的贴附</td></tr><tr><td>碘化丙啶（1 mg/ml）</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td>用于流式细胞分析中标记死细胞</td></tr><tr><td>BD FACS Aria Illu</td><td>Becton Dickinson</td><td>A4544</td><td>在图4中称为设备1</td></tr><tr><td>Navios</td><td>Beckman Coulter</td><td>775213</td><td>在图4中称为设备2</td></tr><tr><td>FloJo vX 10.0.7r2</td><td>Treestar</td><td></td><td>流式细胞数据的分析软件</td></tr></tbody></table>

利用荧光标记纳米颗粒检测小鼠、人类和猪源性活细胞内的基因表达

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

已成功在多种哺乳动物物种（包括小鼠、大鼠、人类、猪及其他物种）中实现体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS）。iPS克隆的验证主要依赖于检测不同多能性基因的内源性表达。这些基因大多为定位于细胞核内的转录因子。传统上，通过细胞固定后的免疫组织化学染色来证明其内源性表达。该方法在早期阶段需要为每个克隆设立重复培养，以保留经验证的克隆用于后续实验。本实验方案描述了一种使用基因特异性纳米颗粒的方法，可通过荧光直接在活细胞中评估细胞内基因表达。这些纳米颗粒由一个中心金颗粒组成，连接一条携带与目标mRNA序列互补的捕获链以及一条带有荧光淬灭的报告链。这些纳米颗粒可被细胞主动内吞，目标mRNA会置换报告链，使其开始发出荧光。因此，可在显微镜下直接检测特定目标基因的表达。此外，所发射的荧光还可用于通过流式细胞术识别、分离和富集表达特定基因的细胞。该方法可直接应用于培养中的活细胞，无需对目标细胞进行任何操作。

为了首次验证并建立利用纳米颗粒在活细胞中检测特定基因表达的技术，我们决定使用人源 HEK 293 细胞中组成型表达的管家基因（GAPDH）开展预实验。实验中所用纳米颗粒的浓度依据生产商的推荐进行选择。在培养基中加入终浓度为 100 pM 的 GAPDH 特异性探针，经过夜孵育后，在荧光显微镜下可观察到细胞中出现清晰的 Cy3 荧光信号（图 5A）。为支持该结果，实验设置了两个对照组。其中一个对照使用所谓的“随机序列”（scramble）纳米颗粒，其报告链在哺乳动物或真核细胞中无匹配序列，用于评估因探针降解或荧光淬灭不完全所导致的非特异性背景荧光。“随机序列”探针仅产生微弱的荧光信号，可忽略不计（图 5B）。另一个持续发光的“摄取”对照用于评估细胞通过内吞作用摄入纳米颗粒的能力，该能力在不同细胞类型间可能存在差异。该阳性对照颗粒在 HEK 293 细胞中产生了强烈的荧光信号（图 5C）。因此，该技术能够记录到细胞内特定基因的荧光信号，且背景信号可忽略的技术可行性得到了证实。需要指出的是，背景信号与特异性荧光信号之间的差异随时间推移而减小：背景信号因探针降解或淬灭不完全而逐渐升高，而特异性荧光则逐渐减弱（图 5D）。相同的 GAPDH 特异性纳米颗粒已在小鼠、猪和绵羊来源的原代成纤维细胞培养物中进行了测试17。这些细胞产生的背景信号明显高于 HEK 293 细胞，而靶标特异性荧光则相对较弱，可能与这些培养物相对较低的增殖能力有关。
这些初步实验促使我们采用该技术检测不同物种来源的诱导多能干细胞（iPS）中多能性基因的表达。为此，我们分析了NANOG和GDF3，这两个基因均已被证实可在多能细胞中表达18。首先，我们检测了来源于Nkx2.5心脏增强子转基因小鼠品系尾尖成纤维细胞的iPS细胞19。对于这两个基因，均获得了强烈的荧光信号（图6A），而阴性对照（scramble control）的Cy3荧光信号可忽略不计（数据未显示）。在人和猪来源的iPS细胞中也获得了类似结果（图6B和C）。重要的是，荧光信号仅局限于iPS细胞集落，未标记用作小鼠和猪iPS细胞饲养层的成纤维细胞（见图6A和C中的箭头）。对NANOG基因表达的进一步分析表明，并非所有在计算机（in silico）预测为“良好”的序列最终都具有功能。尽管在小鼠iPS细胞中与靶序列完全匹配（100%序列匹配），三种特异性针对NANOG的纳米探针中的一种几乎未产生任何可检测的荧光信号，其水平与阴性对照相当（图6D）。该探针在人和猪来源的iPS细胞中也得到类似结果（数据未显示）。因此，纳米探针可用于跨物种检测多能性基因的表达，但每种设计的探针在使用前均需预先验证其功能有效性。
令人鼓舞的结果 原位 在细胞培养皿中标记活细胞促使我们通过流式细胞术对基因表达进行定量分析。为此 GAPDH特异性纳米颗粒以梯度浓度加入HEK 293单层细胞中，以比较目标细胞群体内的标记效率。通过荧光显微镜评估，与未接受纳米颗粒的细胞相比，最低浓度下即观察到Cy3诱导荧光增强。随着纳米颗粒浓度增加，HEK 293细胞的荧光表现出明显的浓度依赖性增强。 原位 (图7A）。对这些细胞进行流式细胞术分析，证实了标记效率具有浓度依赖性。当使用最高浓度的纳米颗粒时，Cy3阳性细胞的频率显著增加（超过七倍）。图7B）。在后续实验中，来自ES细胞的 Nkx2.5 心脏增强子转基因小鼠品系 19 用于通过流式细胞术分析多能性基因的表达。初步实验使用400 pM的阳性摄取对照，在显微镜下可观察到明显的Cy3阳性活体ES集落，流式细胞术检测到近40%的Cy3阳性细胞（图7C）。相比之下，与未经处理的细胞类似，经scramble处理的细胞中约有0.1%呈阳性染色（数据未显示）。同样地，添加针对 Gapdh, Nanog 和 Gdf3 在细胞培养皿的单个菌落中诱导出明显的荧光信号。Cy3阳性细胞的频率为 Gapdh 通过流式细胞术测定的结果与两种多能性基因所观察到的结果相当图 7C。这一结果是可以预期的，因为 Nanog 和 Gdf3 也被认为在多能性胚胎干细胞中组成型表达。因此，这些数据明确表明，可通过流式细胞术定性地以及根据其相对含量来鉴定表达特定基因的细胞。
<img alt="用于mRNA检测的金纳米颗粒示意图，通过荧光释放进行基因特异性报告分析。" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：纳米颗粒结构的示意图。(A) 基因特异性纳米颗粒的结构。(B) 乱序纳米颗粒（阴性对照）。(C) 摄取纳米颗粒（阳性对照）。改编自Lahm et al. 17，经Wiley许可重印。
<img alt="纳米颗粒显微镜；稀释、孵育、荧光评估（示意图，实验）" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2：纳米颗粒在细胞培养中的应用。 将适当稀释的纳米颗粒溶液直接用移液器加入培养基中。经过过夜孵育后，可在荧光显微镜下观察到表达基因特异性荧光的细胞。
<img alt="mRNA 检测过程；示意图；带有荧光报告分子的纳米星；细胞摄取与发光。" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3：细胞通过内吞作用主动摄取纳米颗粒。 (A) 细胞通过内吞作用主动吞噬纳米颗粒。 (B) 目标 mRNA 与捕获链结合，并置换出荧光报告分子。
<img alt="流式细胞术图示、HEK 293 细胞和小鼠 ES 细胞、GAPDH 纳米颗粒比较、数据分析。" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4：流式细胞术设门策略。（A） HEK 293 细胞的设门策略。（B） 小鼠 ES 细胞的设门策略。数据使用设备 1 采集 HEK 293 细胞，或使用设备 2 采集小鼠 ES 细胞，随后通过软件工具进行分析（见材料表）。
<img alt="纳米颗粒摄取分析，荧光显微镜，GAPDH，Scramble，相差显微镜，延时成像。" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5：HEK 293细胞中GAPDH表达的分析。向细胞中加入100 pM（终浓度）的GAPDH特异性纳米颗粒，过夜孵育后记录荧光信号。（A）GAPDH特异性纳米颗粒。（B）Scramble（阴性对照）。（C）摄取（阳性对照）。（D）Scramble与摄取对照的动力学。在加入GAPDH特异性纳米颗粒后指定时间点测定荧光强度。比例尺为50 µM。
<img alt="iPS 细胞比较，Nanog 和 GDF3 标记物，相差显微镜，小鼠、人、猪细胞。" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6：不同物种 iPS 细胞多能性基因表达的分析。 将针对 NANOG 或 GDF3 的特异性纳米颗粒以 400 pM（终浓度）加入细胞，过夜孵育后检测荧光信号。(A) 小鼠 iPS 细胞。(B) 人 iPS 细胞。(C) 猪 iPS 细胞。(A) 和 (C) 中的箭头指示未标记的成纤维细胞饲养层细胞。(D) 加入 NANOG-design SF3 纳米颗粒后小鼠 iPS 细胞的荧光信号。比例尺表示 50 µM。
<img alt="纳米颗粒对HEK 293细胞和小鼠胚胎干细胞的影响；荧光图像、柱状图、流式细胞术。" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图7"> 
图7：可通过流式细胞术鉴定被纳米颗粒标记的活细胞。（A） 添加不同浓度纳米颗粒后，Cy3阳性HEK 293细胞的显微图像。（B） 通过流式细胞术测定的Cy3阳性细胞频率。（C） 小鼠胚胎干细胞集落的活细胞染色及Cy3阳性细胞频率的测定。纳米颗粒的终浓度为400 pM。比例尺代表50 µM。

本手稿描述了一种新技术，该技术能够在荧光标记的纳米颗粒被内吞后，直接在活细胞内检测其细胞内基因表达。该方法无需对细胞进行操作，且不受目标基因或物种的限制。

体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS）已在包括小鼠在内的多种哺乳动物物种中成功实现。

本实验的总体目标是通过应用基因特异性的荧光纳米颗粒，直接在活细胞内分析基因表达。该目标的实现首先需要确定目标基因中的合适靶序列；第二步是制备带有特异性捕获链和报告链的纳米颗粒。接下来，将纳米颗粒直接加入活细胞的培养基中。最后一步是在37摄氏度、5% CO2的湿润环境中孵育细胞与纳米颗粒过夜。最终，利用荧光显微镜观察活的目标细胞中基因特异性的荧光信号，同时通过流式细胞术分析定量荧光阳性细胞的数量。与现有的免疫组织化学、分子信标或PCR分析等方法相比，该技术的主要优势在于无需对细胞培养物进行任何操作，即可在活细胞中直观地观察基因表达。接下来由我们实验室的生物学家、博士生玛蒂娜·特蕾莎（Martina Teresa）演示实验操作步骤，流式细胞术部分由林内特·亨克尔（Lynette Henkel）完成。在确定靶序列后，从商业来源订购冻干的金纳米颗粒。这些颗粒由一个中心金颗粒组成，该金颗粒通过共价键连接一条捕获链，而捕获链又与一条报告链结合。当目标 mRNA 与捕获链结合后，报告链及其连接的荧光团被释放到溶液中，从而使 Fluor four 发出荧光。在重建之前。纳米颗粒应避光保存于纸板箱中，置于4°C环境下。为重组金纳米颗粒，加入20微升双蒸水，最终浓度为100纳摩尔。重组后的纳米颗粒可在避光条件下室温保存至少一年。在使用当天，将金纳米颗粒的储备液用PBS稀释成20倍工作液，从细胞培养箱中取出含有HEK 293细胞的24孔板，吸除培养基，每孔加入237.5 µL新鲜培养基，再向各孔中加入12.5 µL纳米颗粒工作液，轻轻摇动培养板以确保纳米颗粒均匀分布。将细胞置于37°C、5% CO₂的湿润环境中过夜培养。第二天。使用标准荧光显微镜分析细胞培养物中基因特异性位点三的荧光，以准备进行流式细胞术。用 PBS 洗涤一次显示位点三诱导荧光的 HEK 293 细胞，加入 1 毫升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA，在 37 摄氏度和 5% CO2 条件下孵育细胞 3 分钟。孵育结束后，加入 0.5 毫升 CO 培养基，上下吹打混匀。然后将细胞转移至15毫升离心管中，加入3毫升培养基，以300 × g离心5分钟。接着弃去上清液，将细胞重悬于200微升预冷的FACS缓冲液中。将细胞转移至1.5毫升离心管中，置于冰上避光保存，直至分析。进行传真分析之前，需将细胞通过30微米滤器，以防止细胞聚集。然后向细胞中加入碘化丙啶，终浓度为每毫升2微克，孵育至少2分钟，将细胞混匀后转移至流式细胞仪，并将样品管加载到仪器中。用于检测SI3阳性细胞。使用未经处理的对照细胞，在前向散射（FSC）面积与侧向散射（SSC）面积的散点图上设置层级门控，以及在FSC高度与FSC宽度、SSE高度与SSE宽度的子集中进行门控，以排除细胞碎片和未充分散射的细胞。根据碘化丙啶染色结果，通过展示PE通道与PE Texas Red通道排除死细胞，然后在第三检测位点对PE阳性细胞进行最终分选门控。检测GA脱氢酶。在 HEK 293 细胞中检测了一个组成型表达的看家基因，以验证实验的可行性。阴性对照纳米颗粒（随机序列）显示极少或几乎无荧光，而永久性荧光阳性摄取组则显示明显荧光。对照组在过夜孵育后显示出强烈的信号。这些纳米颗粒被证实可特异性检测多能干细胞标志物，即在人和猪的诱导性多能干细胞（IPCs）中，纳米颗粒与GDF3基因表达呈镜像关系。重要的是，这些标志物仅在IPCs中被检测到，而在作为IPS细胞培养过程中饲养层的成纤维细胞中则未检测到。通过流式细胞术进行的视觉和定量分析被用于评估GA DH纳米颗粒（分级版本）在0至1000浓度梯度下的标记效率。使用HEK 293细胞进行了皮摩尔浓度实验，结果显示荧光强度随浓度增加而明显增强。随后在小鼠胚胎干细胞中进行定量分析，结果显示在加入400皮摩尔浓度的GADH纳米颗粒后，约有40%的细胞呈CY3阳性。多能性标志物也获得了类似的结果。掌握纳米颗粒和GDF-3技术后，若操作得当，该技术可在16小时内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用基因特异性纳米颗粒，通过荧光显微镜直接在活细胞内检测细胞内基因表达。

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