上皮细胞复育和肾组织的发展准备啮齿动物细胞外基质的支架

该程序的总体目标是用人肾上皮细胞重新填充脱细胞三维啮齿动物肾细胞外基质支架。这是通过首先脱细胞来实现的，在 26 小时内将山虎大鼠肾脏与一系列去污剂溶液灌注到肾动脉中。然后对肾脏进行消毒，并在定制设计的 Biore 反应器系统内，在连续顺行动脉灌注下，向脱细胞肾细胞外基质支架注射 4000 万个人肾皮质肾小管上皮细胞或 RCTE 细胞。

最终，可以通过 ER 和灌注测定以及免疫组织化学分析来评估 RCTE 细胞重新填充肾支架的能力。这种 3D 细胞培养技术使研究人员能够重新填充整个器官的细胞外基质。支架细胞沉积在细胞外基质内的肾小管周围空间内，以允许影响细胞生长、分化和成熟的研究和结合因子。

与合成聚合物支架的制造等替代方法相比，该技术的主要优点是肾细胞外基质促进灌注细胞在天然结构蛋白、生长因子和其他生物成分的复杂网络内的粘附、增殖和成熟。通过将每个解冻肾脏的肾动脉导管连接到泵下游灌注回路管的末端来开始脱细胞程序，确保导管中没有气泡滞留。如果导管中存在气泡，请使用 200 微升微量移液器将气泡吸出并填充导管。

将肾脏沿着空的 5 升烧杯的内壁悬吊，以免肾动脉扭结或盘绕，并将泵驱动调整至每分钟 5 毫升。然后按下开始，通过观察从器官底部滴落的溶液以及每个肾脏与灌注结束时流程图中指定的适当溶液确认每个肾脏都在灌注后，将脱细胞的肾脏储存在 PBS 中，在 4 摄氏度或最多 2 摄氏度的 50 毫升锥形管中。组装灌注回路后，取下生物反应器头上的红色螺帽，通过开口将 50 毫升 0.1% 的乙酸、4% 乙醇溶液移液到培养基储液器中。

使用大泵筒，将蠕动泵管段连接到泵头。然后将流速调整为每分钟 5 毫升。按下开始键，当液体充满充沛管路并到达三通旋塞旋塞的剩余开放端口时，让电路启动。

使用公诱饵塞塞住端口。让回路完全灌注，直到在灌注回路管路或入口内部没有观察到空气。诱饵受体通过暂时增加泵的流速从灌注回路中排出气泡。

当系统完全灌注后，停止泵驱动并对 6 英寸镊子进行消毒。要小心地将肾动脉导管的内诱饵端插入外螺纹入口，请将受体诱饵在生物反应器头的内表面，确保连接紧密且导管中没有空气残留。让肾脏轻轻地悬挂在肾动脉导管上，这样肾动脉就不会扭曲或扭结。

然后拧紧将生物反应器头和主体固定在一起的金属夹，使生物反应器储液器储液槽紧密密封并关闭螺帽。现在用每分钟 5 毫升的全乙酸乙醇溶液的室温灌注对肾脏进行消毒。一小时后，停止泵并打开红色螺帽。

使用无菌害虫，移液器小心地从生物反应器储液器中吸出所有溶液。然后将 50 毫升新鲜 PBS 移液到生物反应器储液器中。盖上螺旋盖，启动泵，在室温下以每分钟 5 毫升的速度连续进行 3 次灌注，每次 1 小时。

最后一次 PBS 冲洗后，从储液槽中吸出盐水，并在关闭螺帽的情况下向储液槽中加入 50 毫升培养基。将带有连接灌注回路的生物反应器转移到 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的大容量培养箱中。然后将生物反应器灌注回路连接到泵上，以每分钟 4 毫升的速度灌注肾脏，至少在接种前一小时。

为了细胞化，肾脏收集足够数量的培养瓶以达到所需的座位浓度。接下来，从每个培养瓶中吸出培养基后，使用 10 毫升适当的细胞解离酶在 37 摄氏度下从培养瓶中取出肾皮质肾小管上皮细胞。10 分钟后，开始每两分钟在面部对比显微镜上检查培养瓶，直到观察到折叠脱落。

然后，在取一小份细胞进行计数后，在等体积的 premed 培养基中稀释相关的细胞悬液，并离心细胞复苏。用适当体积的培养基悬浮沉淀，以获得每毫升第 7 个细胞的 2 倍/mL 的最终浓度。转移 2 毫升的座悬液，一个 35 毫米的培养皿，然后将 2 毫升的体积吸入无菌的 5 毫升注射器中。

将灌流生物反应器转移到生物安全柜中，然后转动旋塞阀以关闭流向阀座端口的液流。取下公诱饵滑片，从旋塞上塞住并连接注射器。然后快速将灌注回路转移回培养箱，并使用大型泵筒将蠕动泵管段固定到泵头上，以固定细胞。

关闭指向泵的旋塞阀端口，然后将细胞缓慢注射到肾支架中。然后转动旋塞阀以关闭注射器的液流，并以每分钟 25 毫升的速度启动泵。15 分钟后，将泵流速降低至每分钟 4 mL，第二天更换培养基，此后每两天更换一次。

为了评估细胞的活力和增殖，在整整 1 小时后，无菌地将培养基与 10 毫升 zarin 工作溶液交换为每分钟 4 毫升的肾支架灌注，收集条件和部分还原的 zarin 溶液，并再进行每分钟 4 毫升的灌注。使用 100 毫升新鲜培养物，依次注入水和稀释洗涤剂溶液的中等肾脏在 26 小时内通过最终洗涤剂灌注逐渐变得更加透明，肾脏血管网络，特别是叶间血管在脱细胞支架中突出显示。整个器官清除了天然细胞，留下了肾小球小管和集合管的完整基底膜网络以及脱细胞血管的细胞外基质。

除了较大的血管外，肾小球内的微血管基底膜也保持其结构完整性。正如刚刚证明的那样，接种到肾支架中的 RCTE 细胞主要位于肾支架的皮质区域，在那里它们优先重新填充 pereg 肾小球小管。在接种后第 1 天，很少有细胞嵌入肾小球内，到第 7 天，肾小球几乎没有细胞，而这些细胞中的大多数占据了肾细胞外基质的皮质区域。

顺行灌注培养 7 天后，许多 RCTE 系小管存在于外髓管和状小管中，并在 RCTE 细胞再繁殖和灌注培养一周后收集鸭子。然而，在脱细胞后观察到的透明度消失了，化后的肾脏看起来不透明，在外观上更接近其天然状态。在此程序之后，可以执行其他方法，如条件培养基的免疫化学分析，以回答其他问题，例如，这些细胞的代谢或表型状态在肾细胞外基质中如何变化？

开发细胞外支架和向基质中添加供体销售的能力使研究人员能够在天然肾外基质支架内的三维空间中描绘生长和成熟。最终目标是将这项技术用作更好地了解肾脏修复和再生机制的工具。