Name: 上皮细胞复育和肾组织的发展准备啮齿动物细胞外基质的支架 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 了解利用去细胞化大鼠肾脏支架进行人肾上皮细胞复育的三维培养技术。该方法通过灌注生物反应器系统实现细胞在天然细胞外基质中的生长与分化，为肾脏组织工程和再生医学研究提供重要框架。

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作者感谢Zell家族基金会的支持。我们承认获得西北纪念基金会Dixon转化研究资助计划、美国移植外科医师学会教职员工发展资助、伊利诺伊州国家肾脏基金会青年研究者资助的支持。我们感谢Robert R. McCormick基金会的支持。本研究还获得了美国国家糖尿病、消化病和肾病研究所（NIDDK）K08 DK10175（授予J.A.W.）的资助。本研究所使用的成像和组织学核心设施由西北大学小鼠组织学与表型分析实验室、电子探针仪器中心（EPIC）和Simpson Querrey研究所设备核心提供支持，并获得癌症中心支持资助（NCI CA060553）。作者谨此感谢西北大学显微外科核心实验室在啮齿类动物肾脏获取方面提供的协助。肾小管上皮细胞在重细胞化后的形态学评估是在由P30 CA118100资助的荧光显微镜共享资源平台上完成的。

伦理声明：所有涉及动物的实验操作均依照西北大学机构动物护理和使用委员会批准的指南进行。
1. 肾脏脱细胞
<ol>
	<li>制备脱细胞溶液。为每只待脱细胞的肾脏准备以下体积的试剂，并额外多准备一份体积（例如，对于4个肾脏，准备5,000 ml&#160;步骤 1.1.3 中使用的 Triton X-100：
	<ol>
		<li>准备 500 ml&#160;反渗透水（ROH2O）。注意：在使用 ROH 的步骤中，也可使用去离子水2O 被标示出。</li>
		<li>准备 1,000 ml&#160;Triton X-100，1%（v/v）溶于ROH2O. 缓慢加入10 ml&#160;在搅拌板上剧烈搅拌下，将Triton X-100加入990 ml水中，置于大烧杯中。使用前需确保试剂完全溶解（至少10分钟）。</li>
		<li>准备 1,000 ml&#160;Triton X-100，1%（v/v）溶于ROH2O（单独体积）</li>
		<li>准备 1,000 ml&#160;十二烷基硫酸钠（SDS），0.1%（v/v）溶于ROH2O. 缓慢加入 5 ml&#160;在搅拌器上剧烈搅拌下，将SDS（20%储存液）加入995 ml水中。使用前让试剂充分混匀（至少10分钟）。</li>
		<li>准备 500 ml&#160;ROH2O（单独体积）&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备肾脏以进行脱细胞处理。
	<ol>
		<li>从一只雄性Sprague Dawley大鼠（250-300 g）中取出肾脏，方法如前所述7.
		<ol>
			<li>通过腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg 体重）对大鼠进行麻醉。手术期间定期（每10–15分钟）通过监测呼吸功能、心率及脚趾夹捏反应来评估麻醉深度。若动物出现呼吸频率升高或足底反射呈阳性，应追加给予戊巴比妥（剂量为初始剂量的1/3至1/4）。</li>
			<li>沿腹部正中线做纵行切口，暴露肾脏、腹主动脉和下腔静脉。</li>
			<li>向阴茎静脉注射2,000 USP肝素单位/公斤体重。</li>
			<li>通过轻柔解剖游离双侧肾脏。仔细将肾脏从周围肾周脂肪中分离，同时保持包绕肾脏的肾包膜完整。经肾下腹主动脉灌注冷生理盐水（10 ml）至肾脏。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将24号导管插入肾动脉，牢固结扎导管与动脉，并用注射器以10 ml生理盐水轻柔灌注肾脏&#160;冷磷酸盐缓冲液（PBS）以彻底清除器官中的血液。</li>
		<li>将肾脏浸入25 ml&#160;将 PBS 置于培养皿中，放入 -20 °C 冰箱，使器官逐渐冷冻（从而诱导细胞裂解），以供脱细胞处理前储存。 
		注意：如有需要，也可对输尿管和/或肾静脉进行插管以实现逆行接种，但本方案中未作描述。</li>
		<li>完全解冻冷冻肾脏（在室温（RT）下平衡），并用10 ml轻轻灌注&#160;加入 PBS 检查结扎的肾动脉是否有渗漏。若观察到渗漏或明显阻力，则重新插管肾动脉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备脱细胞化设备。按照图示组装脱细胞化灌注系统 图1B.
	<ol>
		<li>连接一段8英寸长的蠕动泵管（图1D，f）剪成两段足够长的部分（&#62;36”推荐）内径（ID）为1/16”的硅胶管（图1D，h）。使用两个雄性鲁尔锁接头转1/8英寸倒刺接头，并通过一个雌性鲁尔接头转雌性鲁尔接头连接管路的各段（图1D，j）。插入一个额外的公型鲁尔锁接头至1/8英寸带倒刺接头（图1D，c将灌注管路的下游末端连接至肾动脉导管。</li>
		<li>使用大型泵盒将每个蠕动泵管段连接到四滚轮泵头。</li>
		<li>将硅胶橡胶管的上游端放入第一溶液储液池（ROH）中后2O），按住“Prime”按钮，用溶液充分预灌注每条灌注回路。关键步骤：确认管路中无残留气泡，且硅胶管的上游端（敞口以吸取液体）已固定在试剂储液罐的液-气界面以下，如图所示。 图1B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下进行脱细胞化操作7.
	<ol>
		<li>将每个解冻肾脏的肾动脉导管连接到灌注回路管道泵下游末端，确保导管内无气泡滞留。使肾脏沿一个空的5 L烧杯内壁悬垂（灌流液收集储液池，见 图1B以确保肾动脉不发生扭曲或盘绕。</li>
		<li>将泵速调节至5 ml/min，然后按下“开始”按钮。通过观察器官底部是否有灌注液滴下，确认每个肾脏是否正在灌注。</li>
		<li>用以下试剂对每个肾脏进行灌注，具体步骤如下所述 图1A
		<ol>
			<li>灌流 500 ml&#160;ROH2O₂，5 ml/min，持续1小时40分钟。</li>
			<li>灌注 1,000 ml&#160;1% Triton X-100，流速5 ml/min，持续3小时20分钟</li>
			<li>灌注 1,000 ml&#160;1% Triton X-100，流速1 ml/min，持续16小时40分钟。</li>
			<li>灌注 1,000 ml&#160;0.1% SDS，5 ml/min，3小时20分钟</li>
			<li>灌注 500 ml&#160;ROH2O₂，5 ml/min，持续1小时40分钟 
			注意：每块去细胞化肾脏可在使用前置于含 PBS（不含添加剂）的 50 ml 锥形管中，4 °C 保存，最长不超过两周。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 灌注生物反应器组装、肾脏灭菌及再细胞化前准备
<ol>
	<li>准备生物反应器容器。
	<ol>
		<li>用温热的稀释洗洁精溶液清洗玻璃生物反应器储液罐（主体部件）和生物反应器头部例如. 1% 洗洁精溶液（用自来水配制），先用自来水彻底冲洗，然后用 ROH 冲洗2O. 让各组分彻底干燥。</li>
		<li>向每个储液槽底部加入少量硅化试剂（约5 ml），确保试剂润湿整个底部表面数秒钟，然后排出多余液体。</li>
		<li>在室温下将储液槽置于通风橱中过夜干燥。或者，也可将储液槽在100 °C烘箱中干燥30分钟，以加快干燥速度并提高涂层的耐久性，该涂层旨在防止细胞贴附于玻璃生物反应器储液槽底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备灌注回路组件以进行灭菌（图1D).
	<ol>
		<li>为每个生物反应器裁剪以下长度的管路：
		<ol>
			<li>剪取两段25英寸长、内径1/16英寸的硅胶管（图1D，h).</li>
			<li>剪取一段8英寸长的蠕动泵管（图1D，f).</li>
			<li>剪取一段长度为4.25英寸、内径为1/16英寸的硅胶橡胶管。</li>
			<li>剪取两段内径为1/16英寸、壁较厚的硅胶管，每段长1英寸（图1D，g).</li>
			<li>剪取一段长2英寸、内径1/4英寸、外径0.5英寸的硅胶管图1D，e).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>准备以下鲁尔接头（每个生物反应器各一套）：
		<ol>
			<li>准备10个雄性鲁尔锁接头转1/8英寸带倒刺接头适配器（图1D，c)</li>
			<li>准备2个雄性鲁尔接头堵头（图1D，a)</li>
			<li>准备2个雌性鲁尔帽（图1D，b)</li>
			<li>准备5个雌性鲁尔接头转雌性鲁尔接头适配器（×5； 图1D，d)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用温热的稀释洗洁精溶液清洗所有管路和鲁尔接头，然后用自来水彻底冲洗，再用ROH冲洗2O，并使其干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组装灌注回路。
	<ol>
		<li>将一段长约1英寸、内径为1/16英寸的厚壁硅胶管套在生物反应器头部的进液鲁尔接头上。将鲁尔锁公接头转1/8英寸内径卡套接头插入硅胶管的开口端。对另一个进液鲁尔接头重复此操作，并连接一个鲁尔锁母帽以封闭该端口（该端口用于本方案未描述的输尿管或静脉接种技术）。</li>
		<li>将每段25英寸长、内径1/16英寸的硅胶橡胶管，使用公型鲁尔锁扣转1/8英寸内径接头和母型鲁尔转母型鲁尔接头，连接至8英寸长的蠕动泵管上（图1D，j).</li>
		<li>将硅胶管的一端连接到生物反应器盖外部的培养基灌注出口上。将一段长4.25英寸、内径为1/16英寸的管道连接到生物反应器盖内部培养基灌注出口的另一侧（内侧）。</li>
		<li>将一个公型鲁尔锁扣接头连接至灌注回路管路剩余的开口端，并接上1/8英寸内径的带倒刺接头。将一个母型鲁尔接母型鲁尔接头连接至该公型鲁尔锁扣上。再将此母型鲁尔接母型鲁尔接头连接至通向生物反应器入口鲁尔接口的开口公型鲁尔锁扣。该连接将作为培养基灌注液的入口，直接通入插管的肾动脉。</li>
		<li>确保生物反应器盖上的所有接口均未敞开或暴露。紧密关闭生物反应器本体上的真空阀。</li>
		<li>将生物反应器盖安装到储液主体上，O型圈置于两个部件各自的相同凹槽之间并夹紧。在接口处放置金属夹，以固定两个部件。</li>
		<li>在生物反应器盖子的通气口安装一个0.2微米通气滤器，使用一段长2英寸、内径1/4英寸、外径0.5英寸的硅胶管连接这两个部件（图1D，e打开排气阀。</li>
		<li>略微松开生物反应器顶部的红色螺钉帽。</li>
		<li>将剩余的鲁尔接头和6英寸带齿镊子放入可高压灭菌袋中并封口。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对组装好的生物反应器和公型鲁尔接头塞进行高压灭菌。</li>
	<li>在接种前准备好以下试剂，用于脱细胞肾脏支架的消毒和培养基灌注（所列体积均为每例脱细胞肾脏所需）：
	<ol>
		<li>在通风橱内，通过将 2.56 ml 过氧乙酸溶液（39% 储存浓度）和 40 ml 无水乙醇加入约 957 ml 去离子水中，配制 50 ml 0.1% 过氧乙酸、4% 乙醇溶液2在1 L瓶中混合均匀，通过反复倒置瓶子彻底混匀，并置于生物安全柜中。</li>
		<li>制备150 ml 1×PBS溶液，经高压灭菌预消毒。</li>
		<li>配制50 ml DMEM/F12培养基，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep）。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集灌注生物反应器组装所需的其余物品。将所有物品放入生物安全柜中。关键步骤：确保生物安全柜配备正常工作的电源插座，以连接数字泵驱动器供电。或者，可使用延长线将泵驱动器连接至生物安全柜外部的电源插座。
	<ol>
		<li>收集脱细胞肾脏。</li>
		<li>收集已灭菌的生物反应器及其连接的灌注回路。</li>
		<li>收集已灭菌的包装袋，内含鲁尔接头和镊子。</li>
		<li>收集配备4滚轮头的数字泵驱动器和大容量泵管（每个灌注回路1根）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照所述完成灌注回路 图1C 在生物安全柜内的无菌条件下。
	<ol>
		<li>连接一个三通旋塞阀（图1D，i) 连接至培养基灌注入口附近的雄性鲁尔锁接头与1/8英寸内径接头之间的雌性鲁尔接头转雌性鲁尔接头适配器。保持三通阀上的三个端口均处于开放状态。</li>
		<li>取下生物反应器顶部的红色螺帽，通过开口将50 ml的0.1%过氧乙酸、4%乙醇溶液移入培养基储液罐中。</li>
		<li>使用大型泵盒将蠕动泵管段连接至泵头。调节流速至5 ml/min，按下“启动”按钮，使管路系统完成预充。
		<ol>
			<li>当液体充满灌注管路并到达三通旋塞阀剩余的开放端口时，使用公型鲁尔接头堵头封闭该端口。 （图1D，a）.</li>
			<li>让电路充分预充，直至灌注管路或入口鲁尔接头内部无气泡可见。如有必要，可暂时提高流速以排出灌注管路中的气泡。完全预充后，停止泵驱动。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用已灭菌的6英寸镊子，将肾动脉导管的雌性鲁尔接头小心插入生物反应器盖内表面的雄性鲁尔接口。确保连接紧密，且导管内无残留空气。让肾脏自然悬垂于肾动脉导管上，避免肾动脉发生扭转或弯曲。</li>
		<li>拧紧固定生物反应器盖与主体的金属夹，确保生物反应器储液腔完全密封。关闭生物反应器盖上的红色螺旋盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下以0.1%过氧乙酸、4%乙醇溶液以5 ml/min流速灌注肾脏进行灭菌1小时，随后在室温下用50 ml PBS以5 ml/min流速依次进行三次、每次1小时的灌注。
	<ol>
		<li>更换溶液：
		<ol>
			<li>1小时后，停止泵并打开红色螺帽。使用无菌（已高压灭菌）的巴斯德吸管，小心抽吸生物反应器储液槽中的全部溶液。保持灌流回路完全预充。</li>
			<li>将50 ml新鲜溶液用移液器加入生物反应器储液罐中，拧紧螺口盖，然后启动泵。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后一次 PBS 清洗后，吸出储液槽中的 PBS，用移液器加入 50 ml 添加了 10% FBS 和 1% Pen-Strep 的 DMEM/F12 培养基。拧紧螺口盖，将连接灌注回路的生物反应器转移至维持在 37 °C 和 5% CO₂ 的大容量培养箱中2.</li>
	<li>如有需要，将泵驱动装置转移至培养箱内。将生物反应器灌注回路连接至泵，并以 4 ml/min 的流速对肾脏灌注至少 1 小时，然后再进行细胞接种。</li>
</ol>
3. 使用肾皮质小管上皮细胞进行肾脏再细胞化
<ol>
	<li>将足够体积的 DMEM/F12 培养基（添加 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素）以及用于细胞消化的细胞解离酶预热至 37 °C。建议用量如下：
	<ol>
		<li>每 175 cm2 培养瓶准备 10 ml&#160;细胞解离酶和 10 ml&#160;DMEM/F12 用于细胞消化。</li>
		<li>每颗待接种的肾脏准备 5–10 ml&#160;DMEM/F12。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备足够数量的培养瓶，以达到所需的接种浓度（每颗肾脏接种 4 × 107 个永生化人肾小管上皮细胞（RCTE 细胞）18，可在此接种策略下实现 RCTE 细胞的最大程度定植）。</li>
	<li>使用细胞解离酶从培养瓶中消化细胞。吸除培养瓶中的培养基，然后加入 10 ml 细胞解离酶。将培养瓶置于 37 °C 培养箱中以加速细胞解离。</li>
	<li>每 2 分钟在相差显微镜下观察一次培养瓶，直至细胞完全从瓶壁解离。注意：孵育时间因细胞融合度不同而异，但 RCTE 细胞通常需要约 15 分钟才能完全解离。</li>
	<li>在离心前取部分细胞悬液用于计数。用等体积预热的 DMEM/F12 培养基稀释细胞悬液，然后在 232 × g 相对离心力（RCF）下离心 5 分钟。</li>
	<li>在离心过程中进行细胞计数。将所取样本与等体积台盼蓝（Trypan Blue）混合，吸取 10 µl&#160;分别加入血细胞计数板两端进行计数。根据结果计算所需重悬体积，以获得目标接种浓度（2 × 107 个细胞/ml）。</li>
	<li>离心结束后，用适量培养基重悬细胞沉淀，使最终浓度为 2 × 107 个细胞/ml。用无菌 5 ml&#160;注射器吸取 2 ml&#160;细胞接种悬液。</li>
	<li>将灌注生物反应器转移至生物安全柜中。旋转三通阀，关闭接种口的液体通路。取下三通阀上的雄性鲁尔滑动堵头，连接装有细胞悬液的注射器。</li>
	<li>迅速将灌注回路转移回培养箱，并使用大号泵管夹具将蠕动泵管段固定在泵头上。</li>
	<li>细胞接种：关闭朝向泵方向的三通阀端口。缓慢将细胞悬液注入肾脏，确保全部悬液从注射器转移至三通阀和灌注管路中。关闭来自注射器的三通阀通路，启动泵并以 25 ml/min 的流速运行 15 分钟。</li>
	<li>15 分钟后，将泵流速降至 4 ml/min。次日更换培养基（后续每次更换体积为 100 ml），之后每两天更换一次。</li>
</ol>
4. 使用刃天青灌注法检测细胞活力和增殖
<ol>
	<li>配制刃天青试剂。将110.5 mg刃天青钠盐溶于100 ml PBS中，持续搅拌，然后取5 ml该溶液加入45 ml新鲜PBS中，稀释10倍，制成440 µM刃天青储备液。使用0.2 µm注射器滤器过滤除菌，并将储备液置于避光的50 ml锥形管中，4 °C保存。</li>
	<li>制备含刃天青的培养基对照。在培养基中配制10%的刃天青试剂溶液（例如将0.5 ml刃天青储备液与45 ml培养基混合，配制刃天青工作液。取10 ml刃天青工作液置于避光容器中，经高压灭菌。注意：此步骤可将刃天青化合物完全还原为羟基刃天青，用作计算刃天青还原百分比的阳性对照。</li>
	<li>分别取1 ml刃天青工作液（氧化态）、经高压灭菌的刃天青工作液（还原态）以及仅含培养基（空白）加入不同的1.5 ml收集管中。将开口的收集管置于与灌注生物反应器相同的培养箱中。</li>
	<li>将肾脏灌注系统从培养箱转移至生物安全柜中。取下生物反应器盖上的螺帽，使用巴斯德吸管从生物反应器储液槽中吸除培养基。</li>
	<li>将10 ml刃天青工作液用移液器移入储液槽中，拧紧螺口盖，并将肾脏灌注回路放回培养箱。</li>
	<li>以 4 ml/min 的流速启动泵，使试剂恰好灌注肾脏 1 小时。</li>
	<li>1小时后，停止泵送，并将肾脏灌注系统转移至生物安全柜中。</li>
	<li>收集已处理（部分还原）的刃天青溶液，并向生物反应器储液罐中加入 100 ml 培养基。将灌注系统转移至培养箱中，并恢复流速（4 ml/min）。</li>
	<li>移液100 µl（3个复孔）条件化刃天青溶液、刃天青工作液、灭菌工作液及培养基空白对照至黑色（不透光）96孔检测板中。使用分光光度计测定荧光强度（激发波长：540/35；发射波长：590/20）。</li>
	<li>计算还原百分比，公式为：以氧化型刃天青培养基（ORM，即未与细胞接触的刃天青工作液）或还原型刃天青培养基（RRM，即经高压灭菌的刃天青工作液）的荧光强度（FI）为归一化基准，% 还原 = 100 × {[FI（条件化刃天青溶液）－ FI（ORM）] / [FI（RRM）－ FI（ORM）]}。为归一化结果，将%还原乘以循环体积（10 ml），再除以孵育时间（1 hr）。</li>
</ol>

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<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+proliferate+and+differentiate+when+seeded+into+kidney+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).</li>
<li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nat Med. 19, 646-651 (2013).</li>
<li>Bonandrini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recellularization+of+well-preserved+acellular+kidney+scaffold+using+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells.</a> Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).</li>
<li>Burgkart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+kidney+matrix+for+perfused+bone+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods.2%22%5BJournal%5D)">Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering.</a> Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).</li>
<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+stem+cells+seeded+into+decellularized+rat+kidney+scaffolds+endothelialize+and+remodel+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes.</a> Organogenesis. 8, 49-55 (2012).</li>
<li>Uzarski, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-purpose+bioreactors+to+monitor+non-invasive+physical+and+biochemical+markers+of+kidney+and+liver+scaffold+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization.</a> Tissue Eng Part C Methods. , (2015).</li>
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<li>Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+epithelial+cells+from+human+autosomal+dominant+polycystic+kidney+cysts.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Renal+physiology%22%5BJournal%5D)">Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology.</a> Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所述的脱细胞化方案能够稳定地制备出完全无细胞的肾脏细胞外基质（ECM），该基质可作为三维支架用于培养人肾皮质小管上皮细胞（包括近端和远端小管来源的细胞）以及血管内皮细胞7,17。通过插管的肾血管系统是实现试剂和细胞在生物反应器系统中均匀输送的关键结构，从而支持灌注式脱细胞化、细胞接种、长期灌注培养以及刃天青（resazurin）灌注检测等操作。因此，在器官灌注前正确地对肾动脉进行插管至关重要，必须特别注意避免肾动脉发生阻塞或损伤，并确保导管固定牢靠。用于获取肾脏的Sprague Dawley大鼠必须进行全身肝素化处理，以防止器官获取过程中血管内形成血栓；因为血管内血栓无法清除，可能阻碍肾脏的完全脱细胞化。
用于重细胞化肾脏接种和灌注培养的灌注生物反应器设计允许多种接种方法 原位17除了本文所述的动脉注射技术外，还可通过插管的输尿管或肾静脉进行逆行细胞注射。此外，生物反应器本体装有阀门，可用于施加负压（部分真空；参见 图1C)，用于输尿管种植。无论采用何种种植策略，通过肾动脉顺行灌注培养基...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/53271/epithelial-cell-repopulation-preparation-rodent-extracellular-matrix">Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development</a>.
The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.&#160; Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

随着终末期肾衰竭患者人数持续增加，可用于移植的供体肾脏数量严重且日益短缺。由于无法满足等待肾移植患者数量不断增长的需求，科研人员开始致力于肾脏器官工程研究，最终目标是按需开发可定制的、可植入的肾脏移植物1,2。利用患者自身的细胞构建具有功能的肾组织，将消除终身免疫抑制治疗的需要，缩短患者在等待肾移植期间接受透析的时间，并使更多慢性肾病患者获得挽救生命的移植机会。
利用患者来源的细胞进行肾脏组织生物工程的第一步是构建一种支架，作为肾实质（例如 肾小管上皮细胞）、间质成纤维细胞和血管细胞生长的支持性基质。来源于天然器官细胞外基质（ECM）的生物材料支架具有多种特性，使其适用于组织工程，包括其天然的生物学组成；适宜的宏观和微观结构以赋予生理功能；以及良好的细胞相容性，可促进细胞黏附、迁移和建设性组织重塑3。一种有前景的制备肾脏组织再生支架的方法是通过对同种异体或异种来源的肾脏进行脱细胞处理，该方法能够保留肾脏ECM大部分复杂的天然蛋白质组成4，维持器官固有的结构复杂性，并在支架再细胞化后为发育中的细胞提供血管供应，从而克服自下而上构建厚实细胞化组织所面临的难题5。
灌注脱细胞是一种通过器官血管网络均匀输送去污剂、酶或其他破坏细胞的溶液的过程6。该策略已被确立为一种高效的方法，可用于制备基于无细胞器官的细胞外基质（ECM）支架，作为全器官工程的三维（3D）生物模板6-8，这一点已通过利用废弃的人类肾脏9以及来自大型动物（例如猪10、山羊11）和啮齿类动物来源的异种肾脏所构建的无细胞肾模板得到证实12。特别是，使用啮齿类等小型动物模型所需的细胞和培养基较少，这对于细胞数量通常有限的器官再细胞化研究尤其有利，例如干细胞来源的组织。本描述的脱细胞方案的目标是生成一种无细胞肾ECM，可作为三维支架系统用于肾脏结构的再生，包括在本示例中用人肾皮质小管上皮（RCTE）细胞重新定植的肾单位小管。我们先前已详细报道了一种优化的基于去污剂的大鼠肾脏脱细胞方案7，该方法比此前报道的其他方法更快速（约1天），而此前的方法分别需要5天（Ross et al12）和4.5天（Song et al13），并且在脱细胞过程中对变性剂十二烷基硫酸钠（SDS）的暴露浓度显著更低（0.1%），低于以往报道的水平12-15。
目前仅有少量研究报道了使用啮齿类动物肾脏进行脱细胞处理，并将其作为三维支架用于细胞重接种（其他地方已有综述112-16）。在本实验方案中，我们详细描述了先前已建立的、用于从Sprague Dawley大鼠肾脏制备无细胞肾脏支架的最优脱细胞策略7。利用自行设计的可实现双重接种和维持灌注培养的灌注生物反应器17，我们将人肾小管上皮细胞（RCTE细胞）接种至无细胞肾脏支架中，这些细胞能够持续定植于脱细胞基质的肾小管结构中，并在灌注培养条件下增殖且存活超过一周。此外，我们还展示了如何应用刃天青灌注检测法——一种经济、无细胞毒性且非侵入性的代谢评估方法，此前已被用于细胞毒性研究17——以动态评估重细胞化肾脏内细胞的活力与增殖情况7。

<table><tbody><tr><td>试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100，蛋白质组学级，AMRESCO</td><td>VWR</td><td>M143-4L</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠溶液，BioUltra，用于分子生物学，20% 水溶液（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>过氧乙酸溶液，纯度约 39%，溶于乙酸（室温）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77240</td><td>过氧乙酸易燃且具有腐蚀性。应在通风橱内配制，并使用适当的个人防护装备（如手套、护目镜）。</td></tr><tr><td>200 proof 乙醇</td><td>VWR</td><td>V1001TP</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote，用于玻璃及其他表面的硅化试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>用于生物反应器储液槽的处理。文中称为硅化试剂。</td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro 胎牛血清（优质），Mediatech</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100X，10,000 I.U. 青霉素，10,000 &amp;micro;g/mL 链霉素</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (1X)，含酚红</td><td>Life Technologies</td><td>12605-028</td><td>文中称为细胞解离酶。</td></tr><tr><td>台盼蓝染色液（0.4%）</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>刃天青钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>设备：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 数字驱动器，600 RPM，115/230 VAC</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07522-20</td><td></td></tr><tr><td>适用于 07519-05 和 -06 泵头的 Masterflex L/S 大容量泵管</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-70</td><td>文中称为大容量泵管。</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 8通道4滚轮泵头</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-06</td><td></td></tr><tr><td>直形 6&quot; 齿状镊</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>*肾脏灌注生物反应器</td><td>WilMad Labglass</td><td>*定制设计</td><td>生物反应器由 WilMad Labglass 按照所述方法生产。其设计已在先前发表的文章中详细描述。</td></tr><tr><td>灌注回路组件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 G × 0.75 英寸 BD Insyte Autoguard 防护型静脉导管（0.7 mm × 19 mm），由 BD Vialon 生物材料制成，带刻痕针头（50/包，200/箱）</td><td>BD Biosciences</td><td>381412</td><td>文中称为 24 号导管。</td></tr><tr><td>Masterflex PharMed BPT 泵管，L/S #14，25 英尺</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-06508-14</td><td>文中称为蠕动泵管。</td></tr><tr><td>过氧化物固化硅胶管，内径 1/16&quot;，外径 1/8&quot;，25 英尺/包</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-06411-62</td><td>文中称为内径 1/16&quot; 的硅橡胶管。</td></tr><tr><td>Masterflex 铂固化硅胶管，L/S 14，25 英尺</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96410-14</td><td>文中称为厚壁内径 1/16&quot; 硅橡胶管。</td></tr><tr><td>VWR 硅胶管，内径 1/4&quot;，外径 0.5&quot;</td><td>VWR</td><td>89068-484</td><td></td></tr><tr><td>Acro 50 通气滤器，Pall Life Sciences</td><td>VWR</td><td>28143-558</td><td>文中称为 0.2 微米通气滤器。</td></tr><tr><td>Cole-Parmer 鲁尔接头，雄性鲁尔锁扣转 1/8&quot; 内径，尼龙，25/包</td><td>Cole-Parmer</td><td>T-45505-11</td><td>文中称为雄性鲁尔锁扣转 1/8&quot; 带刺接头。</td></tr><tr><td>Cole-Parmer 鲁尔配件，雄性鲁尔堵头，尼龙，25/包</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-58</td><td></td></tr><tr><td>雌性鲁尔转雌性鲁尔接头，尼龙，25/包</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-22</td><td>文中称为雌性鲁尔转雌性鲁尔接头。</td></tr><tr><td>Cole-Parmer 鲁尔配件，雌性鲁尔帽，尼龙，25/包</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-28</td><td></td></tr><tr><td>Smiths Medical 大孔径 Hi-Flo 三通旋塞阀 # MX4311L — 带延长雄性鲁尔锁扣的三通 Hi-Flo 旋塞阀，不含 DEHP，无乳胶（LF），抗脂质，非 PVD，50/箱</td><td>Careforde Healthcare</td><td>10254821</td><td>Smiths Medical（供应商）目录号为 #MX4311L。</td></tr><tr><td>其他组件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml BD Luer-Lok 一次性注射器，带 BD Luer-Lok&amp;trade; 接头</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>35 mm × 10 mm Easy Grip 培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td>用于将细胞悬液吸入注射器以进行细胞接种。</td></tr></tbody></table>

上皮细胞重植及啮齿类动物肾脏组织发育用细胞外基质支架的制备

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

本方案详细描述了如何制备无细胞但具有生物功能的肾脏细胞外基质（ECM）支架，该支架可作为器官尺度组织发育的小规模模型基质。通过将导管插入Sprague Dawley大鼠的肾动脉进行插管，并以一系列低浓度去垢剂（Triton X-100和十二烷基硫酸钠（SDS））灌注26小时，从而获得结构完整、包含可灌注血管系统、肾小球及肾小管的全肾支架。脱细胞处理后，将肾脏支架置于自行设计的灌注式生物反应器容器中，经导管插入的肾动脉连接至包含蠕动泵、管路以及可选的pH、溶解氧和压力探头的灌注回路。使用过氧乙酸和乙醇对支架灭菌后，调节pH至7.4，随后在维持于37 °C和5% CO2的大型培养箱中，通过灌注培养基的方式准备接种细胞。经肾动脉注入四千万个肾皮质小管上皮（RCTE）细胞，在高流速（25 ml/min）和高压（约230 mmHg）条件下快速灌注15分钟后，将流速降低至生理水平（4 ml/min）。RCTE细胞主要定植于肾皮质内的小管ECM微环境，在连续七天的灌注培养中增殖并形成小管状上皮结构。在更换培养基期间，将含有44 µM刃天青（resazurin）的溶液灌注通过肾脏持续1小时，以进行基于荧光检测的氧化还原代谢分析，评估细胞在小管形成过程中的活力与增殖情况。该肾脏灌注生物反应器支持对培养基进行无创取样以进行生化分析，多个进样口还允许通过肾静脉或输尿管逆行接种其他类型细胞。本方案可用于在该系统内快速评估多种细胞类型（包括血管内皮细胞、小管上皮细胞和间质成纤维细胞）对肾脏支架的再细胞化效果。

根据先前建立的最佳脱细胞方案，肾脏依次用清水和稀释的去垢剂溶液（1% Triton X-100、0.1% SDS）灌注（见图1A、B）7，在26小时期间内逐渐变得透明，如图2A所示。所得的无细胞肾脏支架不含细胞，保留了由完整肾包膜支撑的连贯肾细胞外基质（ECM），且灌注程序完成后肾包膜未受损伤。在最终的去垢剂灌注（SDS）阶段，由于较大血管（如叶间动脉）的壁厚明显超过肾单位小管基底膜的厚度，脱细胞支架中肾脏的血管网络（尤其是叶间血管）清晰可见（见图2A、B）。整个器官的天然细胞均被清除，仅留下肾小球、肾小管和集合管完整的基底膜网络，以及脱细胞血管的细胞外基质，包括皮质内叶间动脉的内弹力层和外弹力层（见图2B、C）。除大血管外，肾小球内的微血管基底膜也保持了结构完整性（见图2B、C）。
脱细胞肾脏应保存在4 °C的磷酸盐缓冲液（PBS）中，以限制肾细胞外基质（ECM）的自然水解降解，并应在脱细胞...

本方案描述了通过血管顺行灌注去污剂对 Sprague Dawley 大鼠肾脏进行脱细胞处理，从而获得无细胞的肾脏细胞外基质，用作人类肾上皮细胞再接种的支架模板。再细胞化过程及利用刃天青灌注法监测细胞生长的操作在专门设计的灌注生物反应器中进行。

本方案详细描述了生成无细胞但具有生物功能的肾脏细胞外基质（ECM）支架的方法，该支架可作为小规模模型使用……

本实验的总体目标是利用人肾上皮细胞重新定植去细胞化的三维啮齿类动物肾脏细胞外基质支架。该过程首先通过肾动脉持续灌注一系列去污剂溶液，历时26小时，对哈瓦那大鼠肾脏进行去细胞化处理。随后对肾脏进行灭菌，并在定制设计的生物反应器系统中，通过持续顺行性动脉灌注，将4000万个人肾皮质小管上皮细胞（RCTE细胞）注入去细胞化的肾脏细胞外基质支架中。最终，可通过内质网染色和灌注实验以及免疫组织化学分析，评估RTEC细胞在肾脏支架中重植的能力。这种三维细胞培养技术可使研究人员在完整器官的细胞外基质中重新植入细胞。支架中的细胞被沉积于细胞外基质的肾小管周围间隙内，从而便于研究影响细胞生长、分化和成熟的结合因子。与合成聚合物支架等替代方法相比，该技术的主要优势在于，肾脏细胞外基质可在由天然结构蛋白、生长因子及其他生物组分构成的复杂网络中，促进灌注细胞的黏附、增殖和成熟。开始脱细胞过程时，将每个解冻肾脏的肾动脉导管连接至泵下游灌流回路管路的一端，确保导管内无气泡滞留。若导管中存在气泡，使用200微升微量移液器将气泡抽出，并用液体充满导管。将肾脏沿一个空的5升烧杯内壁悬挂，确保肾动脉不扭曲或盘绕，并将泵速调节至5毫升每分钟。然后确认每个肾脏的灌注情况，通过观察器官底部溶液滴落的状态来判断，随后根据灌注流程图中指定的方案，向每个肾脏加入相应的溶液。将脱细胞后的肾脏置于含PBS的50毫升锥形管中，于4摄氏度保存，最长不超过2周。在组装灌注回路后，取下生物反应器头部的红色螺帽，通过开口处用移液器向培养基储液罐中加入50毫升0.1%过乙酸、4%乙醇溶液。使用一个较大的泵管卡盒，将蠕动泵管段连接到泵头上。然后将流速调节至每分钟五毫升。按下启动按钮，当液体充满灌注管路并到达三通旋塞阀的另一个开放端口时，使管路系统完成预充。使用雄性接头塞堵住端口。让灌注回路充分预充，直至灌注管路或入口内侧无气泡可见。通过暂时提高泵的流速，使雌性接头排出灌注回路中的气泡。当系统完全灌注后，停止泵的驱动，并对六英寸镊子进行灭菌。小心地将肾动脉导管的雌性接头端插入生物反应器盖内表面的雄性入口接头，确保连接紧密且导管内无残留空气。使肾脏自然悬垂于肾动脉导管上，以避免肾动脉发生扭转或弯曲。然后拧紧固定生物反应器头盖与主体的金属夹，确保生物反应器储液罐紧密密封，并关闭螺口盖。接着以每分钟5 mL的流速，用室温的过氧乙酸乙醇溶液对肾脏进行灌注灭菌。一小时后，停止泵运行并打开红色螺口盖。使用无菌移液器，小心吸取生物反应器储液槽中的全部溶液。然后向生物反应器储液槽中加入50毫升新鲜的PBS。拧紧螺口盖，并以每分钟5毫升的流速，在室温下启动泵进行三次连续的一小时灌注。最后一次 PBS 冲洗后，吸出储液槽中的生理盐水，并向储液槽中加入 50 毫升培养基，拧紧螺旋盖。将连接灌注回路的生物反应器转移至 37 摄氏度、5% 二氧化碳的

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生物工程

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