Name: 加工机械可调和生物活性金属支架的生物医学应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 了解动态冷冻铸造与致密化工艺制备多孔钛金属支架的方法。该技术可实现机械性能调控与药物缓释功能，为骨科植入物开发提供新途径。

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本研究由韩国产业通商资源部资助的科技创新项目（合同编号：0037915，WPM 生物医学材料-植入材料）和产业战略技术开发项目（合同编号：10045329，用于骨替代的多孔结构定制化植入体的开发）支持。 &amp;#38; 能源部（MI，韩国）以及BK21 PLUS 首尔国立大学材料学科全球创新型领袖培养项目（合同编号：21A20131912052）。

1. 多孔金属支架的制备
<ol>
	<li>根据表1中所述，称取适量市售Ti粉末、莰烯和KD-4，制备Ti-莰烯浆料，用于制备具有四种初始孔隙率（40、50、60和70）的多孔Ti支架。将浆料倒入500 ml聚乙烯（PE）瓶中，在球磨炉中以30 rpm转速、55 °C条件下旋转30 min。</li>
	<li>将PE瓶中的浆料倒入直径60 mm、高60 mm的圆柱形铝（Al）模具中。用相应的Al盖片密封每个Al模具，并在球磨炉中以30 rpm转速、55 °C条件下旋转10 min。
	<ol>
		<li>随后，将球磨炉温度降至44 °C，并在恒定温度44 °C下以30 rpm转速持续旋转12 hr。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在球磨炉中继续于室温（RT）旋转1 hr以完成冷却过程后，取出模具。使用Al冲头从Al模具中取出固化的钛/莰烯生坯。</li>
	<li>手动将固化的钛/莰烯生坯放入橡胶袋中，并用绳子扎紧袋口完全密封。将橡胶袋置于冷等静压（CIP）机的水箱中，施加200 MPa的等静压持续10 min。从橡胶袋中取出压缩后的生坯。</li>
	<li>手动将Ti-莰烯生坯转移至氧化铝坩埚中，并将坩埚放入冷冻干燥机。在-40 °C条件下冷冻干燥24 hr，以使生坯中的莰烯相升华。</li>
	<li>随后，用氧化铝盖片封闭坩埚，并将封闭的坩埚置于室温下的真空炉（低于10-6 Torr）中。然后以5 °C/min的升温速率将炉温升至1,300 °C，并在1,300 °C下保温2 hr。</li>
	<li>热处理完成后，将烧结的多孔Ti留在炉中6–7 hr，直至炉温完全冷却至室温（RT）。 
	注意：在6 hr的冷却过程中，炉温高于400 °C时的平均冷却速率约为15 °C/min，低于400 °C时的平均冷却速率约为2 °C/min。</li>
	<li>如有需要，通过电火花加工（EDM）将烧结的多孔Ti块体切割成直径为16 mm的圆片状样品。27 
	注意：根据Al模具的尺寸，需通过机加工过程调整烧结多孔Ti的尺寸（图2A）。</li>
	<li>将装有多孔Ti样品的玻璃烧杯放入高压灭菌器中，在121 °C下灭菌15 min。从高压灭菌器中取出样品。用蒸馏水清洗多孔Ti样品两次，再用70%乙醇清洗两次。最后将多孔Ti样品置于培养皿中，在紫外灯下的洁净工作台中于室温下风干。</li>
</ol>
2. 使用生物活性物质对支架进行浸涂
<ol>
	<li>在洁净工作台中，按照表1所示，将市售绿色荧光蛋白（GFP）从1 mg/ml稀释至100 μg/ml：在10 ml无菌聚苯乙烯（PS）管中，将1 ml GFP与9 ml杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS，pH 7.4）混合。</li>
	<li>将无菌的致密或 多孔钛浸入10 ml稀释后的GFP溶液（100 µg/ml）中，即将钛样品放入含有GFP溶液的PS管中，于室温（RT）下置于洁净工作台上。</li>
	<li>将PS管放入真空干燥器中，抽真空10分钟，以确保GFP溶液更有效地渗入多孔钛的孔隙中。</li>
	<li>用镊子将多孔钛从PS管中取出，将涂覆GFP的多孔钛放入直径10 cm的培养皿中，在洁净工作台上室温下过夜空气干燥。</li>
	<li>在玻璃烧杯中用10 ml杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗多孔钛两次，用镊子将多孔钛转移至直径10 cm的培养皿中，在洁净工作台上室温下空气干燥。</li>
</ol>
3. 多孔支架的致密化
<ol>
	<li>将不同高度的GFP包被多孔Ti样品放入圆柱形钢模具中，并将一组冲头插入钢模具的顶部和底部孔中（图 3A).</li>
	<li>在室温下沿样品的 z 方向压缩钢制模具组件中的多孔钛图3A) 使用压力机在0.05 ~ 0.1 sec的中等应变率下进行-1 预设施加应变值 表2保持压力1分钟，然后卸载。</li>
	<li>从钢制模具中取出致密化的 Ti 样品。在烧杯中用 10 ml DPBS 清洗致密化样品两次，然后在洁净台中室温下静置过夜晾干。</li>
</ol>
4. GFP 涂层支架的释放试验
<ol>
	<li>在洁净台中，将三种样品（经步骤2处理的GFP涂层致密Ti、经步骤1和2处理的GFP涂层多孔Ti、以及经步骤1-3处理的GFP涂层致密化多孔Ti）分别浸入装有5 ml DPBS（pH 7.4）溶液的10 ml无菌PS管中，并于37 °C下孵育。</li>
	<li>根据预设时间点（浸入后第1、2、3、5、8、12、15、22和29天），用移液器吸除各PS管中含GFP涂层样品的全部DPBS溶液，并补充5 ml新鲜的DPBS溶液（pH 7.4）。</li>
	<li>在浸入前（第0天）和浸入22天后，使用共聚焦激光扫描光谱仪（CLSM）对GFP涂层样品进行荧光成像。</li>
	<li>使用紫外光谱法在215 nm波长下，测定从每个PS管中取出的5 ml DPBS溶液中1 ml样品所释放的GFP的荧光信号强度。利用标准曲线将测得的荧光强度值转换为GFP溶液浓度。 
	注意：在测量前，需通过测定浓度范围为0 ng/ml - 10 µg/ml的GFP溶液的荧光信号强度，绘制GFP溶液的标准曲线。</li>
</ol>
5. 梯度多孔钛支架的制备
<ol>
	<li>通过重复步骤1.1至步骤1.7，制备一块烧结多孔钛。</li>
	<li>根据预设的结构设计加工烧结多孔钛块（例如, 图 5a 和 5天由EDM完成。</li>
	<li>将具有高度分布的机械加工钛样品放入钢制模具中，其中多孔钛的直径比模具直径小约0.1 mm，并将一组冲头插入钢制模具的顶部和底部孔中。</li>
	<li>执行步骤 3.2 和 3.3。</li>
</ol>
6. 钛支架孔隙率的测量
<ol>
	<li>测量 Ti 支架的质量（ms）。</li>
	<li>通过测量 Ti 支架的长度、宽度和高度，计算其表观体积（Vs）。</li>
	<li>使用以下公式计算孔隙率： 
	  <img alt="静态平衡公式 P=100(1−mS/VS)/ρTl。公式表示。" src="/files/ftp_upload/53279/53279eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 1"> 
其中 P 为总孔隙率百分比，ρTi 为钛的理论密度，mS/VS 为样品的实测密度。 
注意：Ti 样品的孔隙率可在使用微型计算机断层扫描仪进行 microCT 成像后，直接从 microCT 图像中获取。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

尽管生物金属系统已广泛应用于生物医学领域，特别是作为承重材料，但金属的高刚度和低生物活性一直被视为主要挑战。在本研究中，我们建立了一种新型金属系统的制备方法，即致密化多孔金属支架，该支架具有仿生的力学性能以及可实现生物分子持续释放的生物活性表面。我们制备方法的主要优势包括：1）无需改变此前已开发的动态冷冻铸造法28；2）仅通过调控一个参数——致密化程度，即可实现多孔金属支架的力学性能增强及生物分子的持续释放行为；3）可拓展应用于功能梯度材料。
制备致密化多孔金属的关键步骤之一是制造具有两种重要特性的多孔钛：1）具备延展性，以调控生物活性分子的释放速率和材料的力学性能；2）具有高孔隙连通性，以实现生物分子的有效负载与释放。然而，以往采用造孔剂法、海绵模板法和粉末冶金法制备的多孔钛支架，往往表现出孔隙连通性不足或延展性较差的问题14,24,29。特别是，在热处理过程中，金属粉末与其他周围材料发生反应所产生的杂质会显著降低材料的延展性，这是因为金属粉末与第二相材料（例如，造孔剂或聚合物模板）直接接触，导致材料在力学测试中发生脆...

尽管金属生物材料因其优异的机械强度和弹性而被广泛用作承重植入物和内固定装置1-3，但仍面临两个关键挑战：1）力学性能不匹配，因为金属远比生物组织刚硬，容易对周围组织造成不良损伤；2）生物活性较低，常导致与生物组织界面结合不良，并引发异物反应（例如，炎症或血栓形成）4-6。多孔金属支架已被提出用于促进骨组织长入结构内部，在提高骨-植入物接触的同时，因其刚度降低而减轻应力屏蔽效应7-9。此外，已采用多种表面改性方法来增强金属植入物的生物活性，包括在金属表面涂覆生物活性分子（例如，生长因子）或药物（例如，万古霉素、四环素）10-12。然而，多孔金属支架机械性能下降、刚度降低以及生物活性涂层快速释放等问题仍未得到解决13-16。
特别是，钛（Ti）及其合金由于具有优异的机械性能、化学稳定性和良好的生物相容性，已成为最受欢迎的生物金属体系之一。13,17-19 其泡沫状应用也引起了越来越多的关注，因为三维多孔结构不仅具有类似骨组织的力学性能，还能促进骨组织长入。20-22 已通过开发新的制造技术来改善材料的力学性能，这些技术包括聚合物海绵复制法、金属颗粒烧结法、快速成型（RP）法以及造孔剂法，以调控孔隙的多种特征（例如，孔隙率、形状、尺寸、分布和连通性）以及材料特性（例如，金属相和杂质）。23-25 近年来，利用水基金属浆料的冷冻铸造技术受到广泛关注，该技术通过凝固过程中单向冰晶枝晶的生长，可制备具有高度取向孔结构且力学性能增强的钛材料；然而，金属粉末与水接触所导致的氧污染可能引发钛支架的脆化，因此需特别注意以尽量减少此类污染。14,15
因此，我们开发了一种制备具有生物活性且机械性能可调的多孔钛支架的新方法25。该支架初始具有孔隙率超过50%的多孔结构。所制备的多孔支架经生物活性分子涂层后，通过机械压力机进行压缩，在此过程中，通过施加的应变来调控其最终孔隙率、力学性能及药物释放行为。致密化的多孔钛植入体表现出较低的孔隙率和良好的强度，同时其刚度较低，与骨组织的刚度（3–20 GPa）相当2。由于涂层的存在，致密化多孔钛的生物活性显著提高。此外，由于致密化过程诱导形成了独特的扁平化孔结构，涂层中的生物活性分子可从支架中逐渐释放，长期保持其生物学功效。
本研究中，我们介绍了已建立的制备致密化多孔钛支架的方法，该支架具有用于生物医学应用的潜力。该方案包括金属浆料的动态冷冻铸造以及多孔支架的致密化处理。首先，为了制备具有良好延展性的多孔钛支架，引入了如图1A所示的动态冷冻铸造方法。将钛粉分散于液态樟脑中；随后通过降低温度使液相固化，从而实现钛粉网络与固态樟脑晶体之间的相分离。接着，将固化的钛-樟脑生坯进行烧结，使钛粉凝聚形成连续的钛支柱结构，同时完全去除樟脑相，从而获得多孔结构。利用所获得的多孔支架进行涂层及致密化处理，并改变致密化程度和初始孔隙率。通过比较经绿色荧光蛋白（GFP）涂层的致密化与非致密化多孔钛支架，以及GFP涂层的致密钛材料，对涂层层及其释放行为进行了可视化与定量分析。最后，通过调节多孔支架内部与外部区域的致密化程度，提出并展示了具有两种不同多孔结构的功能梯度钛支架。

<table><tbody><tr><td>钛粉</td><td>Alfa Aesar</td><td>#42624</td><td>-325目，99.5%（以金属为基础）</td></tr><tr><td>樟脑烯</td><td>SigmaAldrich</td><td>#456055</td><td>95%，C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>KD-4</td><td>Croda</td><td>&amp;shy;</td><td>Hypermer，聚合物分散剂</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Welgene</td><td>ML 008-01</td><td>&amp;shy;</td></tr><tr><td>绿色荧光蛋白（GFP）</td><td>Genoss Co.</td><td>-</td><td>&gt;98%纯度，1 mg/mL</td></tr><tr><td>球磨炉</td><td>SAMHENUG ENERGY</td><td>SH-BDO150</td><td>&amp;shy;</td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Ilshin Lab.</td><td>PVTFD50A</td><td>&amp;shy;</td></tr><tr><td>冷等静压机（CIP）</td><td>SONGWON SYSTEMS</td><td>CIP 42260</td><td>&amp;shy;</td></tr><tr><td>真空炉</td><td>JEONG MIN INDUSTRIAL</td><td>JM-HP20</td><td>&amp;shy;</td></tr><tr><td>电火花加工机</td><td>FANUC robocut</td><td>0iB</td><td>外部使用</td></tr><tr><td>压力机</td><td>CG&amp;S</td><td>AJP-200</td><td>&amp;shy;</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）</td><td>Olympus</td><td>FluoView FV1000</td><td>外部使用</td></tr></tbody></table>

用于生物医学应用的可调机械性能与生物活性金属支架的制备

Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications

生物金属系统已广泛应用于生物医学领域，尤其是作为承重材料。然而，金属材料面临的主要挑战是刚度过高以及生物活性较低。在本研究中，我们开发了一种新方法，用于制备新型的具有生物活性且机械性能可靠的多孔金属支架——致密化多孔钛（Ti）支架。该方法包含两个制备步骤：1）通过动态冷冻铸造法制备多孔钛支架；2）对多孔支架进行涂层和致密化处理。用于制备多孔钛支架的动态冷冻铸造法，能够通过最小化化学污染和结构缺陷，实现多孔支架的致密化。该致密化过程具有三个显著特点。首先，该过程操作简便，仅需控制一个参数（致密化程度）。其次，该过程高效，可实现机械性能的增强，并实现生物分子从多孔支架中的可持续释放。第三，该方法具有广泛的应用前景，因为在致密化过程中通过施加空间变化的应变，还可用于制备功能梯度多孔支架。

用于制备多孔钛支架的制造工艺如图1A所示。将钛粉在44 °C下持续旋转容器12小时，使其在樟脑中均匀分散；在此过程中，当液态樟脑完全固化时，相对较重的钛粉沉降可降至最低。因此，采用动态冷冻铸造工艺制备出均匀的钛-樟脑生坯，如图1B所示，其中三维相互连通的大尺寸樟脑孔隙被钛粉相包围（图1C）。然而，容器旋转不当常导致生坯中钛相与樟脑相分布不均，从而在热处理后引起多孔支架的变形或开裂。经研究发现，最佳旋转速度为30 rpm，在大多数情况下均可制得均匀的生坯。在进行热处理之前，需通过观察钛-樟脑生坯的横截面（如图1C所示）来确认樟脑的充分生长。若樟脑相不连续且孔隙尺寸分布显著，则需重新设定动态冷冻铸造的温度和时间。通常情况下，经过12小时的动态冷冻铸造后，钛-樟脑生坯中的樟脑相发育良好，此时大尺寸球形孔隙相互接触，形成连续结构。多孔钛材料中孔隙的尺寸、形貌及连通性在热处理后进一步通过显微CT分析进行评估。
在1,300 °C烧结后，多孔钛块通过电火花加工...

通过一种包含两个步骤的方法制备了具有生物活性且机械性能可靠的金属支架：首先采用动态冷冻铸造法制备多孔钛，然后对钛支架进行涂层和致密化处理。该致密化过程简单、高效，并可适用于制备功能梯度支架。

生物金属系统已广泛应用于生物医学领域，尤其是作为承重材料。然而，其主要挑战在于刚度较高……

本实验的总体目标是制备可用于生物医学应用的机械性能可调且具有生物活性的金属支架。该方法有助于解答骨科植入物领域中的关键问题，例如可递送药物的机械性能可调金属支架的可行性。该成形方法简便，仅需一个控制参数即可实现。参数可实现力学性能增强和可持续药物释放，并能够制造功能化的多孔类器官结构。首先，在500毫升聚乙烯瓶中加入适量的钛粉、咖啡因和KD4，用于制备四种初始孔隙率的多孔钛支架。将聚乙烯瓶置于球磨烘箱中，以30 RPM的转速在55摄氏度下旋转30分钟。将浆料从聚乙烯瓶倒入直径和高度均为60毫米的圆柱形铝模具中。用铝制盖玻片密封每个铝制模具后，将模具置于球磨炉中，在55摄氏度下以30 RPM的速度旋转10分钟。随后，将球磨炉温度降至44摄氏度，并在44摄氏度下继续以30 RPM的速度持续旋转模具12小时。在室温下旋转冷却模具1小时后，将其从球磨炉中取出。然后使用铝制冲头从每个铝制模具中取出固化的钛-咖啡因生坯。接着，将固化的钛-咖啡因生坯放入橡胶袋中，并用绳子扎紧袋口，完全密封。将橡胶袋放入冷等静压机的水箱中，施加 200 兆帕的等静压，持续 10 分钟。从机器中取出橡胶袋后，将压制成型的生坯从橡胶袋中取出。将钛-咖啡因生坯转移至 Illumina 坩埚中。将坩埚放入冷冻干燥机中，在零下40摄氏度条件下冷冻干燥24小时，以升华去除咖啡因相。冷冻干燥完成后，用Illumina盖玻片密封坩埚。将密封后的坩埚置于真空炉中，于室温下保存。然后以每分钟5 °C的升温速率将炉温升至1300 °C。空气干燥的生坯样品通常较脆弱，可能发生坍塌。在操作过程中需格外小心。在1300摄氏度下保温两小时后，将中心多孔钛保留在炉内六至七小时，直至炉子完全冷却至室温。样品从炉中取出后，加工成较小的试样，并转移至玻璃烧杯中。将烧杯放入高压灭菌器，在121摄氏度下灭菌15分钟。实验结束后，用蒸馏水将灭菌后的样品清洗两次，再用70%乙醇清洗两次。然后将多孔钛材料放入培养皿中，在紫外光下于室温条件下自然晾干。此时，将绿色荧光蛋白（GFP）用ECCOs磷酸盐缓冲液稀释至100微克/毫升，方法为将1毫升GFP溶液与9毫升ECCOs磷酸盐缓冲液混合。在50毫升灭菌聚苯乙烯管中，将多孔钛材料浸入稀释后的GFP溶液中，并在室温下孵育。然后立即将样品放入真空干燥器中，并抽真空10分钟。为确保GFP溶液更有效地渗透多孔钛的孔隙，从干燥器中取出玻璃烧杯。随后用镊子将多孔钛从玻璃烧杯中取出。将GFP包被的多孔钛置于直径10厘米的培养皿中，在洁净台中室温下晾干过夜。次日，用10毫升玻璃烧杯中的ECOS磷酸盐缓冲液冲洗多孔钛两次。然后用镊子将多孔钛转移至另一个直径10厘米的培养皿中，在洁净台中室温下再次晾干过夜。接着，将不同高度的GFP包被多孔钛样品放入圆柱形钢模中，并将一组冲头插入钢模顶部和底部的孔中。在室温下沿样品的 Z 方向，使用钢制模具组件对多孔钛进行压缩。采用压力机以 0.05 至 0.1 每秒的中等应变率施加预设的应变。保持压力一分钟。从压片机中取出模具。将钢环套在模具底部，然后将模具放回压片机中。翻转模具后，缓慢施加压力，直至冲头将压缩后的样品从D孔中推出，随后将模具从压片机中取出。将致密化的钛样品从钢模中取出。最后，在烧杯中用10毫升ECCOs磷酸盐缓冲液将致密化样品清洗两次，并在洁净台中室温下晾干过夜。传统冷冻铸造法制备的钛材料孔隙结构显示出由咖啡因枝晶生长导致的具有不规则孔形的定向孔隙排列。在动态冷冻铸造过程中，样品冷冻时形成近乎球形的孔隙，且孔隙分布随机；随着致密化程度的增加，孔隙形状逐渐变得扁平，在最高致密化程度下，相邻孔隙相互接触，孔隙几乎完全消失。四个具有不同孔隙率的试样在致密化前表现出不同的初始高度，但在致密化后高度几乎相同。凹痕结构和多孔钛均表现出快速的GFP释放行为，具有明显的初始突释效应，大部分GFP在一周内释放完毕。致密化的多孔钛可实现长达一个月的持续释放，即使在一个月后仍能清晰观察到表面的GFP。对于具有更致密核心的支架，其外部部分通过机械加工被缩短。对内部较高区域进行选择性致密化后的显微CT图像显示了支架内外部分具有不同孔隙率的结构：外层孔隙率较高而内层孔隙率较低的多孔钛在致密化后形成更致密的外层，外层孔隙率降低，而内层则保持初始孔隙率不变。一旦掌握该技术。如果在开发后正确操作，该技术可在72小时内完成。该技术为生物材料领域的研究人员探索制造具有可调机械性能和载药功能的支架以治疗脊髓损伤的可行性开辟了道路。该技术的影响延伸至脊髓损伤治疗领域，因为所制备的支架可作为兼具药物递送功能的人工椎间盘替代物。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

加工机械可调和生物活性金属支架的生物医学应用

我们介绍了两种用于三维细胞培养的多孔聚合物芯片微加工工艺。第一种是热压印与溶剂蒸气焊接工艺相结合的方法。第二种则采用 recently developed...

芯片级三维细胞培养支架的微加工

在本视频中，我们将演示用于多孔金属植入物的改性技术，以提升其功能并控制细胞迁移。这些技术包括构建孔隙梯度以调控三维环境中的细胞运动，以及制备模拟基底膜的结构以调控二维环境中的细胞运动。此外，还介绍了一种基于高效液相色谱（HPLC）的方法，通过分析血液蛋白来监测植入物在体内的整合情况。...

具有孔隙梯度、聚电解质及其间接监测的金属植入物多尺度改性 在体

共混是一种高效的方法，可用于制备具有广泛性能和多种特性的生物材料。通过预测不同天然丝蛋白之间的分子相互作用，可以设计出具有可调机械韧性、电响应性、光学透明性、化学可加工性、生物降解性或热稳定性的新型丝蛋白-丝蛋白合金平台。...

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本文介绍一种制备具有纤维梯度排列的电纺纳米纤维支架的方案，并探讨其在调控细胞形态与取向中的应用。纳米纤维支架在物理和化学性质上的梯度特征在生物医学领域具有广泛的应用前景。...

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了解动态冷冻铸造与致密化工艺制备多孔钛金属支架的方法。该技术可实现机械性能调控与药物缓释功能，为骨科植入物开发提供新途径。

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