Name: 转基因器官皮肤培养使用灭活人真皮代 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 了解利用灭活人真皮和表皮角质形成细胞生成转基因器官皮肤培养物的详细方案，以研究基因改变对皮肤生长和分化的影响。该技术可在数天内快速制备具有临床相关性的人类皮肤模型，为皮肤病学研究提供重要平台。

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本工作得到了美国癌症协会研究学者基金（RSG-12-148-01-DDC）和加州再生医学研究所基础生物学奖（RB4-05779）的支持。

人体皮肤实验方案严格遵循加州大学圣地亚哥分校研究伦理委员会的指导原则进行。人体皮肤可从废弃的手术样本中获取，或从皮肤库购买（皮肤库列于材料/设备表中）。只要真皮层中的基底膜区蛋白（胶原蛋白/层粘连蛋白）未发生降解，皮肤来源的具体部位或供体年龄对实验结果无显著影响。
1. 脱细胞人真皮的制备
<ol>
	<li>收到人皮肤组织后，将其放入组织培养超净台中解冻（约3-5分钟）。根据皮肤大小，将解冻后的组织置于无菌的一次性50 ml锥形管或125 ml瓶中。皮肤库提供的典型皮肤尺寸为0.75平方英尺。</li>
	<li>用含4倍浓度青霉素和链霉素（pen/strep）的1×PBS填充容器至75%体积，剧烈震荡5分钟，然后弃去液体。重复此步骤3次。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将组织转移至新的试管/瓶中，并加入新鲜的含4倍浓度pen/strep的1×PBS，填充至容器体积的75%。将该混合物置于37 °C的组织培养孵箱中孵育2周，以使真皮与表皮分离。</li>
	<li>在无菌条件下，使用镊子将表皮从真皮上剥离。真皮呈完全白色，而表皮的颜色则因供体种族不同而有所差异（图1A）。根据机构关于处理人体组织的规程丢弃表皮。</li>
	<li>将真皮放入试管或瓶中，用含4倍浓度pen/strep的1×PBS进行洗涤，每次剧烈震荡5分钟，共洗涤4次。最后一次洗涤后，将真皮转移至含有含4倍浓度pen/strep的1×PBS的新试管/瓶中，于4 °C保存，直至使用。真皮可在4 °C保存长达一年。</li>
</ol>
2. 遗传修饰原代人角质形成细胞
注意：使用在完全DMEM培养基[DMEM + 10%胎牛血清（FBS）+ 青霉素/链霉素]中培养的嗜双嗜性Phoenix细胞来产生用于感染原代人角质形成细胞的病毒。编码gag-pol和包膜蛋白等蛋白的病毒包装基因已稳定整合到Phoenix细胞基因组中，因此在转染逆转录病毒载体后可实现病毒的产生。Phoenix细胞可实现高效转染，从而产生高滴度的病毒。该包装系统产生的病毒还可感染包括人类在内的多种哺乳动物细胞。
<ol>
	<li>第1天：转染前一天，将Phoenix细胞以每孔800,000个细胞的密度接种于6孔板中，使用完全DMEM培养基。</li>
	<li>第2天：转染当天，每孔使用3 µg逆转录病毒载体。将3 µg逆转录病毒载体分装至1.5 ml离心管中。每3 µg载体使用100 µl DMEM加6 µl转染试剂的混合液。在1.5 ml离心管中将6 µl转染试剂与100 µl DMEM混合。（所用逆转录病毒载体列于仪器/材料表中）。
	<ol>
		<li>室温孵育5分钟，然后将106 µl混合液加入预先分装有3 µg逆转录病毒载体的离心管中。混匀后室温孵育30分钟。将此全部混合物逐滴加入Phoenix细胞的各孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天：转染后一天，吸除Phoenix细胞的培养基，每孔加入2 ml新鲜完全DMEM培养基。同一天，将原代人角质形成细胞以每孔75,000个细胞的密度接种至6孔板中。使用含抗生素（青霉素/链霉素）的无血清角质形成细胞培养基（KCSFM）培养角质形成细胞。 
	注：原代人角质形成细胞为外购获得。细胞可从多家供应商处购买（详见材料/设备表）。</li>
	<li>第4天：收集转染后的Phoenix细胞培养上清液，其中含有病毒颗粒。使用注射器将上清液通过0.45 µm滤器过滤（以去除可能污染的Phoenix细胞），每孔角质形成细胞（前一天接种，密度为75,000个细胞/孔；见步骤2.3）加入2 ml滤过上清液。向培养基中加入六甲溴铵（终浓度5 µg/ml），以促进病毒感染过程。病毒滴度约为1 × 107 TU/ml。
	<ol>
		<li>将6孔板在室温下以200 × g离心1小时。离心后，吸除含病毒的培养基，用1× PBS洗涤细胞一次，然后加入KCSFM培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第5天：参照步骤2.4，对同一批角质形成细胞再次进行感染。 
	注：若逆转录病毒载体携带可筛选标记，可使用药物筛选角质形成细胞，并扩增用于后续分析或应用，如类器官培养。</li>
</ol>
3. 建立体外皮肤培养体系
<ol>
	<li>使用实验室中常见的材料组装器官型培养盒，或通过金属加工店定制制作该培养盒（图2A-F）。若使用3.5 cm组织培养板制备此类培养盒，可在无菌条件下，用灼烧法从3.5 cm培养皿盖中央移除一个1.0 cm × 1.0 cm的正方形区域（图2A-B）。
	<ol>
		<li>使用透明指甲油将方形插销固定在培养盒（3.5 cm培养皿盖）底部（图2C）。静置5分钟使指甲油干燥，然后将培养盒翻转，使其依靠方形插销支撑（图2D）。将培养盒放入6 cm培养皿中。 
		注：方形插销可从多种艺术与手工用品商店购买。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制角质形成细胞生长培养基（KGM），其成分为：66% DMEM、22% Ham’s F12、100 单位/毫升青霉素、100 µg/mL链霉素、10% FBS、2.67 µg/mL腺嘌呤、40 ng/mL氢化可的松、10 ng/mL霍乱毒素、4.94 µg/mL胰岛素、5 µg/mL转铁蛋白、1.36 ng/mL三碘甲腺原氨酸（Triiodo-L-thyronine）、10 ng/mL表皮生长因子（EGF）和10 µg/mL盐酸环丙沙星。将培养基通过0.22 µm滤器过滤，4 °C保存备用。</li>
	<li>将真皮组织从含4倍青霉素/链霉素的PBS溶液中取出，用KGM洗涤两次，随后在使用前于37 °C条件下孵育两天。</li>
	<li>使用手术刀将真皮组织切割为1.5 cm × 1.5 cm大小的片状，然后放置于器官型培养盒上。放置时确保真皮的上表面朝上。真皮上表面即为后续与角质形成细胞接触的一侧（图1B）。</li>
	<li>将预切好的真皮组织置于器官型培养盒的方形孔上，确保其上表面朝上（图3A）。</li>
	<li>使用镊子将含有真皮组织的整个器官型培养盒翻转（图3B）。将细胞外基质溶液置于冰上解冻。使用注射器和针头按每盒100 µL量吸取细胞外基质溶液。向真皮底部（光泽面）滴加5滴，并轻轻晃动以确保溶液在真皮组织内均匀分布（图3B）。</li>
	<li>静置5分钟，使商品化的细胞外基质溶液完全凝固（图3C）。凝固后，用镊子将培养盒重新翻转回原位。向6 cm培养皿中加入4 mL KGM。</li>
	<li>将0.5–1×10⁶个经基因修饰的角质形成细胞接种至含有真皮组织的器官型培养盒上（图3D）。
	<ol>
		<li>将0.05%胰蛋白酶4 mL加入10 cm培养皿中，作用5分钟以消化角质形成细胞，随后加入4 mL完全DMEM培养基终止消化。</li>
		<li>使用血细胞计数板计数角质形成细胞，然后以200 × g离心5分钟。将0.5–1×10⁶个细胞（根据可用细胞数量决定）重悬于90 µL KGM中，并将全部细胞接种至真皮组织表面。 
		注：在同一实验中，各组真皮组织上接种的细胞数量应保持一致，以确保所观察到的再生表皮厚度差异并非源于起始细胞数量不同。若接种细胞少于5×10⁵个，可能导致表皮分层和分化不良。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每隔一天更换一次器官型培养体系中的KGM培养基。在角质形成细胞接种至真皮组织后1–14天内收获组织。表皮的完全分层与分化通常在第5天后完成。</li>
</ol>

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</ol>

我们没有需要披露的内容。

与常用的二维培养细胞以及小鼠模型相比，人类皮肤类器官培养体系在基因操作方面具有诸多优势。二维培养体系缺乏完整组织和器官中存在的三维细胞间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用。近期研究还发现，二维与三维培养的皮肤癌细胞之间存在显著差异，其中三维培养的细胞在基因表达上与原发性人类皮肤肿瘤更为相似16。与小鼠模型相比，人类皮肤类器官培养体系也具有多项优势。小鼠模型构建耗时且成本高昂，且人与小鼠皮肤之间存在若干显著差异，包括组织更新速率以及表皮厚度在小鼠与人类之间的不同8。随着CRISPR-CAS等新技术的出现，可对特定基因进行修饰或突变，从而利用类器官皮肤培养体系模拟人类皮肤疾病23。此外，除本文所述的逆转录病毒基因转移方法外，还可通过多种其他方法在这些细胞中实现基因导入或基因敲低。只要能够实现高效的递送，例如通过高转导效率或药物筛选，该方法即可应用。这些递送方法包括siRNA的核转染、慢病毒、腺相关病毒以及腺病毒递送系统11,12,24-26。
可以通过向系统中添加不同类型的细胞来改造类器官皮肤培养体...

人类表皮是一种复层上皮，通过称为基底膜带的细胞外基质与下方的真皮层相连。表皮不仅作为不透水屏障防止水分流失，同时也是抵御外来和有毒物质侵袭机体的第一道防线1。基底层是表皮最深层，含有表皮干细胞和祖细胞，这些细胞产生分化后代，进而形成表皮其余部分2。随着表皮祖细胞的分化，它们向上迁移，形成第一层分化细胞，即棘层3。在棘层中，细胞启动角蛋白1和角蛋白10的表达，从而为表皮的分化层提供抵抗物理应力的机械强度。当棘层细胞进一步分化时，它们继续向上迁移，形成颗粒层，该层的特征是透明角质颗粒和板层颗粒的形成，以及在细胞质膜下方组装的结构蛋白。随着细胞分化过程的推进，细胞质膜下方的蛋白质相互交联，同时板层颗粒被释放到细胞外，形成富含脂质的屏障，称为角质层4。
涉及表皮生长和分化异常的疾病影响约20%的人群5。因此，理解这一过程的机制具有重要意义。由于许多此类疾病的表型依赖于细胞-细胞或细胞-基质接触，研究人员已建立了在三维环境中重建人类表皮的类器官培养模型6-10。这些方法通常涉及将原代或永生化角质形成细胞接种于脱细胞人真皮、Matrigel或胶原等细胞外基质上进行培养。
为了理解在表皮生长和分化中起重要作用的基因调控机制，可通过逆转录病毒载体对角质形成细胞进行遗传操作，以在二维培养中敲低或过表达基因，随后将其重建为三维结构。这些方法已被广泛用于表征参与表皮干细胞和祖细胞自我更新、分化以及向肿瘤进展相关基因的功能11-21。本文提供了利用逆转录病毒在表皮类器官培养中改变基因表达的详细实验方案。

<table><tbody><tr><td>人皮肤</td><td>纽约消防员皮肤库</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html">http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>双嗜性 phoenix 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-3213</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6 转染试剂</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>角质形成细胞培养基（KCSFM）</td><td>Life Technologies</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Cambrex</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Sigma</td><td>A-9795</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;C-8052</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Calbiochem</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I-1882</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td></td></tr><tr><td>转铁蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-0665</td><td></td></tr><tr><td>盐酸环丙沙星</td><td>Serologicals</td><td>89-001-1</td><td></td></tr><tr><td>电灼器</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>角蛋白1抗体</td><td>Biolegend</td><td>PRB-149P</td><td></td></tr><tr><td>方钉</td><td>工艺美术商店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人新生儿角质形成细胞</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>人新生儿角质形成细胞</td><td>Cell Applications</td><td>102K-05n</td><td></td></tr><tr><td>MSCV 逆转录病毒载体</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td></td></tr><tr><td>LZRS 逆转录病毒载体</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSuper.Retro.Puro 逆转录病毒载体</td><td>Oligoengine</td><td>VEC-PRT-0002&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>六亚甲基溴化铵&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

利用去细胞化人真皮生成基因修饰的类器官皮肤培养物

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

类器官培养技术能够重建三维微环境，该环境对于细胞间接触以及细胞与基质间的相互作用至关重要，可模拟其功能与生理特性 体内 组织对应物。这一点在类器官皮肤培养中得到了充分体现，后者能够忠实地重现表皮分化与分层程序。原代人表皮角质形成细胞可通过逆转录病毒进行遗传操作，实现目标基因的过表达或敲低。这些经遗传修饰的角质形成细胞可用于在类器官皮肤培养系统中再生人表皮，从而为研究影响表皮生长、分化及疾病进展的遗传通路提供有力模型。本文所述方案介绍了制备去细胞化人真皮以及遗传操作原代人角质形成细胞以生成类器官皮肤培养物的方法。所再生的人皮肤组织可进一步应用于基因表达谱分析、免疫染色、染色质免疫沉淀联合高通量测序等下游实验。因此，构建此类遗传修饰的类器官皮肤培养系统将有助于鉴定在维持皮肤稳态中起关键作用的基因。

生成类器官人皮肤的第一步是将表皮从真皮中分离。将皮肤在37 °C条件下用4倍青霉素/链霉素/PBS孵育两周，应可实现真皮与表皮的分离（图1A）。如果表皮与真皮难以分离，则将组织在37 °C条件下用4倍青霉素/链霉素/PBS再孵育一周，然后使用镊子再次尝试剥离。
在脱细胞真皮上再生人类表皮的关键之一是确保将角质形成细胞置于真皮的正确一侧。真皮具有顶部和底部，其顶部是与角质形成细胞接触的一侧。 体内 以及在类器官培养物中的应用。由于真皮底层具有光泽，因此可将其与真皮上层区分开来（图1B）。如果将角质形成细胞直接置于真皮的底面（有光泽面），表皮将无法正常分化或分层。因此，必须确保真皮的上表面（无光泽面）朝上放置于器官型培养盒中。真皮可直接放置于器官型培养盒上（图2A-F）。由组织培养板制成的盒式支架应进行紫外线灭菌，而金属材质的盒式支架可在放置真皮前进行高压灭菌。随后将遗传修饰的角质形成细胞接种至真皮上。由于角质形成细胞是以KGM重悬后...

本文的目的是提供一种全面且详细的方案，介绍如何利用表皮角质形成细胞和去活性的人类真皮生成基因修饰的人类类器官皮肤。

类器官培养技术能够重建三维环境，该环境对于细胞间接触以及细胞与基质间的相互作用至关重要，并可模拟其功能……

本实验的总体目标是利用复苏的人类真皮组织构建基因修饰的类器官皮肤培养模型，以研究基因表达改变对表皮生长和分化的影响。该方法有助于解答皮肤科学领域的关键问题，例如确定哪些基因负责表皮的生长、分化以及疾病进展。该技术的主要优势在于可在数天内快速生成基因修饰的人类皮肤组织，从而能够研究具有潜在临床相关性的人体样本。本实验操作将由我实验室的 jingly 演示。若收到冻存的人类皮肤组织，需将其置于组织培养超净台中，解冻三至五分钟。解冻后，根据组织大小，将其转移至无菌的 50 毫升锥形管或 125 毫升瓶中。接着，向一个 XPBS 中加入四倍浓度的青霉素和链霉素，直至容器充满至 75%。盖紧容器，剧烈振荡五分钟。移除抗生素溶液，并重复此步骤。最后一次洗涤后，重复此步骤三次，将组织转移至新容器中，并加入新鲜的抗生素溶液。将该混合物置于37摄氏度的组织培养孵育箱中孵育两周，以使真皮与表皮分离。两周后，使用镊子将表皮从真皮上剥离。 根据机构处理人体组织的规程丢弃表皮。将真皮置于含有抗生素溶液的容器中，并如前所述通过剧烈振荡进行洗涤。最后一次洗涤后，将真皮转移至新的含有抗生素溶液的容器中，并于4 °C保存，直至转染前一天使用。转染前一日，将Phoenix细胞以每孔800,000个细胞的密度接种于六孔板中，加入完全培养基。转染当天，将六微升转染试剂与100微升dmm混合。针对每个需要转染的孔，在室温下孵育五分钟；将该混合物加入含有三微克逆转录病毒载体（针对每个需要转染的孔）的离心管中，并在室温下孵育30分钟；然后将此全部混合物逐滴加入Phoenix细胞的每孔中，过夜孵育。转染后的第二天，移除Phoenix细胞的培养基，并于同一天加入两毫升新鲜的完全培养基。将原代人角质形成细胞重悬于含抗生素的无血清角质形成细胞培养基中，并以每孔75,000个细胞的密度接种至六孔板中。次日，收集转染后的Phoenix细胞分泌的含有病毒颗粒的培养基。使用注射器将培养基通过0.45微米滤器过滤，以去除可能污染的细胞。向含有病毒的过滤培养基中加入终浓度为每毫升五微克的六亚甲基二甲基溴化铵，以促进感染过程。随后，将两毫升病毒液滴加到前一天接种的角质形成细胞上。接着，将六孔板在室温下以200 ×g离心一小时。离心后，移除并弃去含有病毒的培养基，用一倍体积的 PBS 洗涤细胞一次，次日加入新鲜的 K-C-S-F-M 培养基。使用上述所示方法，用病毒对同一批角质形成细胞进行感染。制备组织型小室。使用电灼器从3.5厘米组织培养皿盖的中心移除一个1厘米×1厘米的正方形区域。使用透明指甲油将方形插销固定在小室底部，并静置5分钟使指甲油完全干燥。最后，将胶原膜翻转，将其放入一个直径六厘米的培养皿中，使胶原膜平稳地置于支架上。从4°C保存条件下取出真皮组织，转移至含有角质形成细胞生长培养基的容器中进行洗涤。重复洗涤后，将真皮组织置于新鲜的KGM中，在37摄氏度下孵育两天。孵育结束后，使用手术刀将真皮切成1.5厘米×1.5厘米大小的片状，然后将组织块放置于器官型培养装置的方形孔中，确保真皮朝上。使用镊子将含有真皮的整个器官型培养盒翻转。在真皮底部加入五滴新鲜制备的细胞外基质，并轻轻摇晃以确保其在真皮表面均匀分布。待细胞外基质在室温下凝固5分钟后，用镊子将培养盒重新翻转回来，然后向6厘米培养皿中加入4毫升KGM培养基。接下来，在收获并计数基因修饰的角质形成细胞后，将0.5至100万个细胞重悬于90微升KGM培养基中，并将细胞接种到真皮上。将共培养物在37摄氏度下孵育。每隔一天更换一次培养基。表皮的完全分层和分化通常在第5天后发生。组织可在接种后14天内收获。此图像显示了类器官培养物的苏木精和伊红染色结果。皮肤培养物再生的人类皮肤包含表皮和真皮。表皮完全分层并分化为四个明显层次，包括未分化的基底层以及三个已分化的层次：棘层、颗粒层和角质层。这些免疫荧光图像显示，与左侧对照组织相比，右侧所示SNAi2的过表达抑制了表皮分化，通过分化标志物染色可见。绿色显示角蛋白K1，蓝色标记细胞核。通过实时定量PCR分析检测对照组LACZ和SNAI2过表达组织中SNAI2的mRNA水平，结果显示SNAI2的表达量较对照组增加50倍以上。最后，该实时定量PCR分析表明，SNAI2的过表达导致分化诱导的结构基因（如TGM1和SPRR1A）的表达丧失。按照此实验流程操作。为了确定表皮增殖和分化的机制，还可以进行染色质免疫沉淀测序（chipsy）、免疫荧光、RNA分析、电泳或蛋白质印迹（western blotting）等其他方法。该技术为皮肤科学领域的研究人员探索基因功能改变如何影响皮肤稳态铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用角质形成细胞和脱细胞人真皮构建基因修饰的有机人皮肤培养模型。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

转基因器官皮肤培养使用灭活人真皮代

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类器官全层皮肤重建的生成：利用人皮肤样本建立三维皮肤模型的操作流程

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基于支架的三维皮肤类器官培养：一种在脱细胞真皮基质上再生人类表皮的体外培养技术

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改善二维与三维皮肤模型 体外 使用大分子拥挤效应的模型

人类皮肤作为抵御外部环境的第一道防线。本文介绍一种从成人皮肤中分离原代人角质形成细胞的方法。这些分离得到的角质形成细胞可用于多种实验体系，是研究皮肤生物学中分子机制的理想模型。 体外.

成年皮肤来源人原代角质形成细胞的分离与培养

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