利用去细胞化人真皮生成基因修饰的类器官皮肤培养物

本实验的总体目标是利用复苏的人类真皮组织构建基因修饰的类器官皮肤培养模型，以确定基因表达改变对表皮生长和分化的影响。该方法有助于解答皮肤科学领域的一些关键问题，例如确定哪些基因负责表皮的生长、分化以及疾病进展。该技术的主要优势在于可在数天内生成基因修饰的人类皮肤组织，从而能够研究具有潜在临床相关性的人体样本。

本实验操作将由我实验室的 jingly 演示。若收到冻存的人类皮肤组织，需将其置于组织培养生物安全柜中，解冻三至五分钟。解冻后，根据组织大小，将其转移至无菌的 50 毫升锥形管或 125 毫升瓶中。

接着，向一个 XPBS 中加入四倍浓度的青霉素和链霉素，直至容器充满至 75%。盖紧容器，剧烈振荡五分钟。移除抗生素溶液，并重复此步骤。

最后一次洗涤后，重复此步骤三次，将组织转移至新的容器中，并加入新鲜的抗生素溶液。将该混合物置于37摄氏度的组织培养孵育箱中孵育两周，以使真皮与表皮分离。两周后，使用镊子将表皮从真皮上剥离。

根据机构处理人体组织的规程丢弃表皮。将真皮置于含有抗生素溶液的容器中，并如前所述通过剧烈振荡进行清洗。最后一次清洗后，将真皮转移至新的含有抗生素溶液的容器中，并在4°C下保存，直至准备使用。在转染前一天，将Phoenix细胞以每孔800,000个细胞的密度接种于六孔板中的完全培养基中。

转染当天，将六微升转染试剂与100微升dmm混合。针对每个需要转染的孔，在室温下孵育五分钟；将该混合物加入含有三微克逆转录病毒载体的离心管中（每个待转染孔对应一份），并在室温下孵育30分钟；随后将此全部混合物逐滴加入Phoenix细胞的每孔中，并将细胞在转染后过夜培养。转染次日，移除Phoenix细胞的培养基，并于同一天加入两毫升新鲜完全培养基。

将原代人角质形成细胞重悬于含抗生素的无血清角质形成细胞培养基中，并以每孔75,000个细胞的密度接种至6孔板中。次日，收集转染后的Phoenix细胞产生的含病毒颗粒的培养基。使用注射器将培养基通过0.45微米滤器过滤，以去除可能污染的细胞。

向含有病毒的过滤培养基中加入终浓度为每毫升5微克的六亚甲基二甲基溴化铵，以促进感染过程。随后，将2毫升病毒液滴加到前一天接种的角质形成细胞上。接着，将六孔板在室温下以200 ×g 离心1小时。

离心后，移除并弃去含有病毒的培养基。用一份 XPBS 将细胞洗涤一次，次日加入新鲜的 K-C-S-F-M。使用刚刚展示的步骤，用病毒感染同一批角质形成细胞。

制备组织型小室。使用电灼器从直径3.5厘米的组织培养皿盖中心移除一个1厘米×1厘米的正方形区域。使用透明指甲油将方形插销固定在小室底部，并静置5分钟使指甲油完全干燥。

最后，将胶原凝胶翻转，将其放入一个直径六厘米的培养皿中，使胶原凝胶架在支柱上。从4°C保存条件下取出真皮组织，转移至含有角质形成细胞生长培养基的容器中进行洗涤。

重复洗涤后，将真皮组织置于新鲜的KGM中，在37摄氏度下孵育两天。孵育结束后，使用手术刀将真皮切成1.5厘米×1.5厘米大小的片状，然后将组织块放置于器官型培养装置的方形孔中，确保真皮朝上。

使用镊子将含有真皮的整个器官型培养盒翻转。在真皮底部加入五滴新鲜制备的细胞外基质，轻轻摇晃以确保其在真皮表面均匀分布。待细胞外基质在室温下凝固5分钟后，用镊子将培养盒重新翻转回来，然后向6 cm培养皿中加入4 mL KGM培养基。

接下来，在收获并计数基因修饰的角质形成细胞后，将0.5至100万个细胞重悬于90微升KGM培养基中，并将细胞接种到真皮层上。在37°C条件下共培养。每隔一天更换一次培养基。

表皮的完全分层和分化通常在第5天后发生。组织可在接种后14天内收获。此图像显示了类器官组织的苏木精和伊红染色结果。

皮肤培养再生的人类皮肤包含表皮和真皮。表皮完全分层并分化为四个明显层次，包括未分化的基底层以及三个已分化的层次：棘层、颗粒层和角质层。这些免疫荧光图像显示，与左侧对照组织相比，右侧所示SNAi2的过表达抑制了表皮分化，通过分化标志物染色可见。

蛋白角蛋白1（K1）以绿色显示，细胞核以蓝色标记。通过RTQ-PCR分析检测对照组LACZ和SNAI2过表达组织中SNAI2的mRNA水平，结果显示SNAI2的表达量较对照组增加50倍以上。最后，该RTQ-PCR分析表明，SNAI2的过表达导致分化诱导的结构基因（如TGM1和SPRR1A）的表达丧失。按照此步骤进行。

还可以采用染色质免疫沉淀测序（chipsy）、免疫荧光、RNA、AE 或蛋白质印迹（western blotting）等其他方法，以确定表皮增殖和分化的机制。该技术为皮肤科学领域的研究人员探索基因功能改变如何影响皮肤稳态铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用角质形成细胞和脱细胞人真皮构建基因修饰的类器官人皮肤培养模型。