外切囊梗死模型使用光化学技术
2016年6月2日
这份手稿描述囊梗塞的建模技术。在这里，我们利用与手术后前目标映射光的低强度改良光化学技术。使用这种技术，我们创造了持续性运动障碍外接囊梗死模型。
该技术的总体目标是使用光血栓形成技术创建一个具有持续运动障碍的局限性包膜梗死模型。在形成包膜性梗死之前，有必要通过将表达 GFP 的腺相关病毒引入运动皮层的前肢区域来识别内囊中的前肢区域。首先将麻醉的大鼠放入立体定位框架中。
然后剃掉大鼠的头部，并使用 70% 酒精和聚维酮和碘溶液对头皮进行消毒。在预定头皮切口区域的头皮下注射 2% 盐酸利多卡因，以减轻术中疼痛。涂抹眼药膏以防止眼睛干燥。
并在动物身上放上无菌窗帘。在头皮上做一个 2 厘米的中线切口后，定位立体定位臂，根据立体定位坐标识别运动皮层的前肢区域。在此位置钻一个入口孔。
将针头移动到钻孔中，然后将针头通过硬脑膜降低 1 毫米，进入运动皮层。使用高精度微型泵缓慢注入 1 微升病毒。将针头再留在原位 10 分钟，以防止针头回流。
10 分钟后，慢慢拔出针头。用盐水冲洗清洁手术部位后，用 3-0 尼龙缝合线固定伤口。然后将大鼠从立体定位框架中释放出来，并将其转移到恢复室进行监测。
给予镇痛药以控制术后疼痛。两到三周后，根据批准的方法处死大鼠并切片冷冻保护的大脑。GFP 染色后，用荧光显微镜观察内囊中 AAV-GFP 转导的轴突。
将荧光图像上看到的转导轴突的位置与大鼠脑图谱进行比较，以准确确定转导轴突的立体定位坐标。为了准备光学神经接口，首先使用切割钻切割大约 4 厘米的 27 号脊髓针，里面有管心针。然后剥去 10 厘米的光纤护套。
将未护套的光纤插入金属管中。并将管子夹在光纤周围。然后用压紧器夹住金属管的下部 1/2 两次。
金属管填充了光纤和脊髓针针座之间的空间。在光纤上涂上热固化环氧树脂。在轮毂的空白处涂抹额外的环氧树脂。
并将光纤插入脊髓针。在 100 摄氏度下固化环氧树脂 20 分钟，以稳定固定。固化后，劈开从脊椎针中伸出的光纤，然后使用金刚石研磨片对脊椎针尖端的光纤进行抛光。
最后，将跳线的 FCPC 连接器部分连接到绿光激光系统的耦合器。然后使用数字光功率和能量计测量光纤尖端的光强度，以确保光的准确发射。在动物的身体下放置一个加热垫，以将体温保持在 37.5 摄氏度，认为手术。
首先像以前一样麻醉和准备大鼠进行手术。做一个 2 厘米的中线切口后，调整鼻夹的高度，直到前囟和 Lambda 对齐在同一水平。正确的对齐对于正确定位内部囊至关重要。
定位立体定位臂以定位光血栓形成的部位。然后在这一点上钻一个 2 毫米的孔。接下来，抛光并清洁 ONI 的光纤尖端，然后将其固定在立体定位框架上，不要弯曲。
检查 ONI 的尖端以确保其干净完整。在将光学接口插入大鼠大脑的目标部位之前，测量从光纤尖端的激光强度。将光纤尖端的激光强度调整为 3.5 毫瓦。
现在，使用协议第一部分中确定的背腹坐标将 ONI 降低到内囊的目标区域。然后，通过尾静脉每公斤孟加拉玫瑰注射 2 毫克，然后启动设置为一分钟的倒数计时器。一分钟过后，打开 532 纳米绿色激光 90 秒以造成梗塞。
放疗后，轻轻地从大脑中取出 ONI。清洁手术部位后，用 3-0 尼龙缝合线固定伤口。然后将大鼠从立体定位框架中取出，并将其转移到恢复室中。
该图像显示了光血栓性病变两周后，在不同强度的激光下从 2 毫瓦到 5 毫瓦的梗死病变范围。箭头表示梗死病变。在此实验设置中，光学光强度被认为在 3 毫瓦到 4 毫瓦之间。
接下来的两张图片显示了光血栓形成 3 周后包膜梗塞的微观外观。在大鼠大脑的冠状切片中，箭头表示丘脑中含有光纤的针道，一直到内囊。这些连续嵌套的染色切片显示了内囊中梗死病变的范围。
箭头表示梗死病变。
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概述
本稿描述了一种使用改良光致血栓技术建模胶囊梗塞的方法。这种方法可以创建一个导致持续运动障碍的限定性胶囊梗塞模型。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经生物学
- 运动障碍
背景
- 胶囊梗塞与运动缺陷相关。
- 光致血栓技术用于诱导局部脑损伤。
- 了解运动障碍机制对于开发治疗策略至关重要。
- 目标映射对于准确创建模型至关重要。
研究目的
- 开发一个可靠的胶囊梗塞模型。
- 研究胶囊梗塞对运动功能的影响。
- 利用改良光致血栓技术进行精确定位。
使用的方法
- 使用表达GFP的腺相关病毒识别内囊中的前肢区域。
- 通过麻醉和立体定位框架的放置来准备大鼠。
- 头皮消毒和切口准备。
- 注射利多卡因以最小化术中疼痛。
主要结果
- 成功创建了一个限定性胶囊梗塞模型。
- 证明了梗塞后持续的运动障碍。
- 验证了改良光致血栓技术。
- 建立了一种可重复的方法供未来研究使用。
结论
- 改良光致血栓技术有效用于建模胶囊梗塞。
- 该模型可用于研究运动障碍和潜在干预措施。
- 需要进一步研究以探索运动缺陷的潜在机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
This photothrombotic technique enables precise modeling of white matter stroke by selectively targeting the internal capsule while sparing adjacent gray matter. The resulting circumscribed capsular infarct produces persistent motor deficits, providing a disease-relevant system for mechanistic de-risking of neurotherapeutic candidates. The model supports target validation and preclinical assessment of interventions aimed at white matter pathology, addressing a critical gap in stroke research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to white matter stroke pathophysiology.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for functional target validation in motor circuitry.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking infarct location to persistent motor impairment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable lesion volumes via optical intensity titration for dose-response assessment.
- Operational Value: Delivers highly replicable infarct models with consistent motor deficit readouts.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening in neuroprotection or neurorepair.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models white matter stroke at behavioral, circuit, and cellular levels for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on lesion specificity and functional outcome correlation.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of infarct extent with motor deficit severity for predictive biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through preclinical efficacy testing, enabling iterative refinement of neurotherapeutic strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of white matter vulnerability and circuit-specific motor pathway disruption.
- Screening: Enables assay standardization through precise lesion control and quantitative motor deficit scoring.
- Analytics: Provides volumetric infarct measurements and behavioral readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via persistent motor deficit phenotyping.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of neuroprotective and rehabilitative compounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through selective white matter infarct modeling.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via laser intensity calibration and stereotaxic targeting.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early mechanistic de-risking of white matter pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on ability to mitigate persistent motor deficits in a validated model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector delivery, stereotaxic surgery, and optical neural interface fabrication.
- Depends on precision instrumentation including stereotaxic frames, microinjectors, and calibrated laser systems.
- Necessitates cross-team standardization for viral titer consistency, optical fiber preparation, and postoperative monitoring.
- Adaptation considerations include species-specific stereotaxic coordinates and optical properties of gray versus white matter.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for postoperative validation via histology and behavior.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Identification of the Forelimb Area in the Internal Capsule Using AAV-GFP
3:09
Construction of the Optical Neural Interface
4:41
Photothrombotic Infarct of the Internal Capsule
6:44
Results: Microscopic Appearance of Capsular Infarct after Photothrombosis
7:38
Conclusion
