Name: 在成年小鼠V-SVZ细胞的神经分析的稳定，高效的基因修饰干细胞自主和非自主的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 了解利用慢病毒颗粒对成年小鼠脑室-室管膜下区神经干细胞进行长期基因修饰的方法。该技术可区分细胞自主性与非自主性效应，为神经干细胞微环境研究提供重要工具。

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我们感谢 M.J. Palop 以及瓦伦西亚大学 SCSIE 提供的技术支持。同时感谢 Antonia Follenzi 对本文手稿提出的有益评论和讨论。I.F. 的研究得到 Fundaciòn Botìn、通过桑坦德银行全球大学部门资助、以及来自瓦伦西亚自治区政府（Prometeo 计划、ACOMP 和 ISIC 项目）和西班牙经济与竞争力部（MINECO：SAF2011-23331、CIBERNED 和 RETIC TerCel）的基金支持。本工作还获得了 MINECO 的 BFU2010-21823 和 RETIC TerCel 项目资助，以及欧洲研究理事会（ERC）2012 年启动基金（311736-PD-HUMMODEL）对 A.C. 的资助。B.M-P. 获得了西班牙 MINECO 颁发的 FPI 博士奖学金。

伦理声明：本方案遵循瓦伦西亚大学的动物护理指南，符合欧盟指令 2010/63/EU 的规定。
1. 慢病毒载体的制备 在体实验 标记研究（见图1a）
警告：本文所述操作属于生物安全二级，因此所有后续操作均须在生物安全柜中进行。确保研究人员已具备相应资质并接受过所有操作流程的培训。穿戴个人防护装备，包括防护服、双层手套和适当的护目用品。最后，根据机构批准的消毒规范，对所有可能接触过病毒的工具和表面进行彻底去污染处理（使用70%乙醇、10%次氯酸钠溶液擦拭和/或高压灭菌）。
<ol>
	<li>在人胚胎肾293T细胞中生产慢病毒（LV）
	<ol>
		<li>开始本实验前，需准备用于转染的高纯度DNA。可通过双氯化铯（CsCl）梯度离心法或其他市售柱层析方法制备并纯化各质粒，以获得无内毒素DNA。本实验中使用的转移载体质粒为pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre。推荐的核心包装质粒为pMDLg/pRRE和pRSV.REV，包膜质粒为pMD2G13,18,19。</li>
		<li>转染前24小时，将5 × 106个293T细胞接种于含Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）（见材料表）的10 cm塑料培养皿中，使转染时细胞融合度约为1/4至1/3。在37 °C、5–7% CO2的湿化培养箱中孵育。</li>
		<li>转染前2小时更换为新鲜培养基。</li>
		<li>在无菌的1.5 ml微量离心管中，将10 µg转移载体质粒（含待递送的cDNA或shRNA）与2.5 µg pRSV.REV、5 µg pMDLg/pRRE包装质粒以及3.5 µg包膜质粒pMD2G混合。用0.1x TE缓冲液（见材料表）/dH2O（2:1）将质粒溶液补至终体积450 µl，然后加入50 µl 2.5 M CaCl2。</li>
		<li>在剧烈涡旋条件下，逐滴加入500 µl 2x Hepes缓冲盐水（HBS，见材料表）至500 µl DNA-TE-CaCl2混合液中，形成沉淀。</li>
		<li>立即将沉淀加入293T细胞中，轻轻摇动培养皿混匀。将细胞放回培养箱，在转染后14–16小时更换培养基。</li>
		<li>更换培养基后30小时收集细胞上清液，经0.22 µm孔径硝酸纤维素滤膜过滤后，进行浓缩。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>慢病毒（LV）的浓缩
	<ol>
		<li>将条件培养基在室温下以50,000 × g（使用SW-28超速离心转子时为19,000 rpm）离心2小时，于30 ml聚丙烯透明锥形转子管中进行超速离心浓缩。 
		注：使用适用于锥形转子管的超速离心适配器（见材料表）。</li>
		<li>倾去上清液，将沉淀物重悬于少量体积（若仅进行一次离心，则为200 µl或更少）的磷酸盐缓冲液（PBS；见材料表）中，反复吹打约20次。</li>
		<li>合并所有悬液，再次在室温下以50,000 × g（使用SW-55超速离心转子时为23,000 rpm）离心2小时，使用标称体积为5 ml的聚丙烯透明转子管（见材料表）。</li>
		<li>将最终沉淀物重悬于极小体积（起始培养液体积的1/500或1/1,000）的无菌PBS中，在旋转摇床上室温震荡1小时。分装为小份（5–20 µl），于-80 °C冻存。</li>
		<li>所有空管在丢弃前均需用10%次氯酸钠溶液处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用流式细胞术进行慢病毒滴度测定
	<ol>
		<li>滴定前一天，将每孔5 × 104个HeLa细胞接种于6孔组织培养板中，每孔加入2 ml Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（见材料表）。在37 °C、5–7% CO2的湿化培养箱中孵育24小时。</li>
		<li>滴定当天，取出病毒原液的一份冻存样品解冻，并在DMEM中进行10-3至10-8的系列稀释。
		<ol>
			<li>取一块24孔板，在第一孔中加入2 ml DMEM，后续各孔加入1.8 ml DMEM。向第一孔加入2 µl浓缩病毒原液（终稀释度为1:1,000或10-3）。</li>
			<li>反复吹打混匀后，更换枪头，将200 µl 10-3稀释液转移至第二孔。依次重复操作，直至完成10-8稀释。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从培养箱中取出前一日接种的HeLa细胞，小心吸除各孔中的培养基。向含HeLa细胞的各孔中分别加入1 ml不同稀释度的病毒液及1 µl 8 mg/ml的六亚甲基溴化铵（hexadimethrine bromide）。轻轻摇动培养板混匀。 
		注：添加六亚甲基溴化铵可增强病毒在培养细胞上的吸附。</li>
		<li>将细胞放回培养箱，继续感染72小时。之后吸除培养基，用PBS洗涤一次，每孔加入200 µl胰蛋白酶-EDTA溶液（见材料表）。</li>
		<li>在37 °C孵育5分钟后，每孔加入2 ml PBS，将细胞收集至流式细胞仪检测管中。</li>
		<li>在室温下以300 × g离心5分钟，吸除上清液。</li>
		<li>用1 ml固定液（含1%电子显微镜级甲醛和2%胎牛血清的PBS）重悬沉淀，随后涡旋振荡各管。</li>
		<li>使用488 nm氩离子激光器（功率15 mW）在流式细胞仪上分析细胞。</li>
		<li>设置仪器标准参数：前向散射光（FS）、侧向散射光（SS）及GFP荧光检测（525/40 nm）。在FS vs. SS点图中设门选择细胞群体，排除细胞聚集体和碎片。以对数尺度收集荧光信号。计算各样品中GFP+细胞的数量。</li>
		<li>使用以下公式计算病毒载体滴度：% GFP+/100 × 感染细胞数 × 稀释因子（DF） = 转导单位（TU）/ml。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Lentiviral vector preparation, mouse brain injection diagram, flow cytometry data, serial dilution." src="/files/ftp_upload/53282/53282fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1：实验步骤各部分的示意图。 (a第1部分：慢病毒载体的制备 体内 标记研究，从使用适当的质粒转染HEK293T细胞以产生慢病毒（LVs），到通过流式细胞术结合指定公式测定病毒滴度。质粒名称和离心机转子名称均已标明。b 和 c第2部分实验方案：LV的立体定位注射。“b”展示了游标卡尺的一个示例，游标卡尺是立体定位仪的组成部分，用于精确测量。例如，箭头指示的读数为4.23 cm。游标卡尺用于确定脑部顶视图（左）和矢状切面（右）中前-后（AP）、内-外（ML）和背-腹（DV）轴上的坐标。“c”指示bregma的位置，即矢状缝与冠状缝的交点。LV通过注射器进行注射。d) 示意图显示了用于分析的大脑处理方法。将两个半球分开，每个半球再分为两个组织块。包含嗅球（OBs）的“a”块，是通过在嗅球与端脑连接处后方的前后（AP）水平进行冠状切面切割而获得（bregma 2.46 mm；参考Paxinos´ Atlas）。 “b”块则是通过两次冠状切面切割获得，其中一次切面位于最前端的端脑结构前方不远处 胼胝体 （前囟 1.7 mm）和侧脑室交界处水平（前囟 -0.22 mm）各一个。GL，嗅球层；GCL，颗粒细胞层；st，纹状体；cc， 胼胝体；ac，前联合；lv，侧脑室。
2. 将慢病毒（LV）立体定位注射至V-SVZ/纹状体边界或侧脑室（见图1b）
<ol>
	<li>制备
	<ol>
		<li>灭菌一个 5 µl 使用33号针头的容量注射器，将推杆完全拉出，用70%乙醇喷洒针筒和针头进行消毒。反复从1.5 ml微量离心管中吸取乙醇并彻底推出数次，随后用无菌水充分冲洗注射器。将注射器安全放置于超净工作台内，静置晾干。</li>
		<li>准备一个生物危害废物容器，加入10%漂白剂至适当体积，以确保本实验产生的所有废弃物均可浸没其中（通常为500 ml容器中加入200 ml）。</li>
		<li>准备并预热一个 37 °C 注水床垫，方法是将水注入可密封的塑料储物袋并加温至 37 °C这将使小鼠在注射后得以恢复。</li>
		<li>从 -80°C 中取出病毒储备液80 °C 冷冻保存1小时后开始注射，并将病毒小瓶置于室温下的旋转轮上。解冻后，在注射期间将病毒储备液置于冰上保存。在进行LV立体定位注射前，将浓缩的病毒储备液稀释至106 TU/μl 在培养罩中使用 PBS。</li>
		<li>用70%乙醇对选定的手术区域进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LV 显微注射
	<ol>
		<li>选择并灭菌手术所需器械（手术刀、钻头和小镊子）。</li>
		<li>通过腹腔注射（ip）给予兽医监督下的氯胺酮与美托咪啶混合物，使一只6-8周龄的小鼠麻醉。称量每只动物的体重，并按每只给予50-75 mg氯胺酮和0.5-1 mg美托咪啶的剂量进行给药 每 kg 小鼠体重（约 100-125 µl 氯胺酮/美托咪定工作液 每 小鼠</li>
		<li>通过捏压动物的脚趾、尾巴或耳朵来评估麻醉深度，确保动物无任何反应。</li>
		<li>小鼠麻醉后，皮下注射丁丙诺啡，终剂量为每千克小鼠体重0.4–0.5 mg，以减轻术后疼痛。</li>
		<li>剃除耳间区域的毛发，并使用聚维酮碘或70%乙醇等碘伏对皮肤进行消毒。用无菌棉签擦拭清洁。注意避免动物被过度浸湿，以免加重低体温。</li>
		<li>将动物置于立体定位仪上呈俯卧位，并使用仪器的耳杆和腭部支撑小心固定头部。用设定为 37 °C 并向眼睛涂抹眼用润滑剂。</li>
		<li>使用手术刀在头部皮肤上纵向做一个1 cm长的切口，用精细镊子轻轻牵拉皮肤以暴露颅骨。</li>
		<li>使用无菌棉签仔细清洁骨表面，清除暴露的颅骨上残留的任何组织。</li>
		<li>使用注射器固定架将灭菌后的注射器安装至立体定位仪上。</li>
		<li>移动注射器支架的 x、y 和 z 轴，直至注射器针尖位于前囟点，即矢状缝（纵向中线缝）与冠状缝垂直相交的交点图1b确保背腹轴（DV轴）的“零”位置位于前囟点处的颅骨表面。</li>
		<li>将注射器移至 x 和 y 目标坐标（参见 表1 和 图1b).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">注射区域</td>
			<td colspan="3">坐标</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>前-后 (AP)</td>
			<td>内-外 (ML)</td>
			<td>背-腹 (DV)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEZ/纹状体边界</td>
			<td>+0.6 mm</td>
			<td>+1.2 mm</td>
			<td>-3.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>侧脑室</td>
			<td>-0.3 mm</td>
			<td>+1.0 mm</td>
			<td>-2.6 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：注射用立体定位坐标。 对于前后（AP）和内侧-外侧（ML）轴，x 和 y 坐标以距前囟的距离（单位：mm）表示。“-”表示“向后”。对于背腹（DV）坐标，“0”表示前囟点处颅骨表面，DV 坐标表示从此点向下的距离（单位：mm）。
<ol start="12" style="margin-left: 40px;">
	<li>在游标卡尺上标注 x、y 和 z 方向的目标坐标，以便后续能够返回注射位点。使用外科标记笔在颅骨上标记 x 和 y 坐标位置。</li>
	<li>将注射器移离操作区域。</li>
	<li>使用电动钻在颅骨上钻孔，注意操作轻柔，避免损伤脑组织。切勿钻穿软脑膜表面，以免损伤脑表面。</li>
	<li>用 1 µl 浓度为 106 TU/µl 的病毒溶液填充注射器。使用 33 号锋利斜面针头，其尖端角度为 10–12°。将注射器针头垂直于脑表面，保持 90° 角度。</li>
	<li>将注射器移回注射位点，并向下移动，直至针尖接触软脑膜表面。</li>
	<li>将注射器沿 DV 轴方向插入脑内至 z 坐标位置。</li>
	<li>缓慢释放病毒悬液，流速控制在 0.2 µl/min，以尽量减少因液体压力过高对脑组织造成的损伤。</li>
	<li>等待 5–10 分钟，以减少病毒悬液回流，然后极缓慢地回撤注射器。使用实验室擦拭纸吸除因回撤注射器而在表面渗出的多余液体，并立即放入含漂白剂的生物安全废弃物容器中。</li>
	<li>将动物从立体定位仪中取出，放置于加热垫上，使用皮肤粘合剂闭合伤口。通过腹腔或皮下注射 0.1–1.0 mg/kg 体重的阿替美唑逆转镇静状态。</li>
	<li>每 12 小时皮下注射一次布托啡诺，剂量为每公斤小鼠体重 0.1 mg，首次给药时间为短效镇痛药布托啡诺给药后 4 小时。</li>
	<li>将动物置于带有加热垫的独立笼盒中，密切监测直至小鼠从麻醉中恢复。在笼内放置一袋水凝胶，以帮助动物恢复后补充水分。</li>
	<li>将所有生物污染废弃物丢弃至含液体漂白剂的生物危害废物容器中。通过反复吸入和推出乙醇清洗注射器，再用水冲洗。使用漂白剂和 70% 乙醇对操作区域、立体定位仪及所有使用过的手术器械进行消毒。</li>
	<li>将注射后的动物隔离饲养于生物安全二级（BSL-2）实验室中 24–48 小时，之后可转移至常规饲养设施。</li>
</ol>
3. 组织学分析
<ol>
	<li>灌注、组织取材与切片
	<ol>
		<li>使用兽医监督下的美托咪啶与氯胺酮混合物对小鼠进行深度麻醉（通过夹捏脚趾、尾巴或耳朵来评估麻醉深度），方法如前所述。</li>
		<li>以相同流速经心脏灌注 25 ml 生理盐水，随后灌注 75 ml 含 4% 多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PB）17。</li>
		<li>取出脑组织，并将其浸入至少 10 倍体积的冰冷 4% PFA（溶于 PB）中，后固定 1–16 小时（延长后固定时间可能降低某些抗原的免疫反应性）。用 PB 充分洗涤以去除残留的 PFA。</li>
		<li>按照 图1d 的指示切割脑组织，将所得组织块用氰基丙烯酸酯胶水粘附于振动切片机的持样器上。</li>
		<li>使用振动切片机切取 30 µm 厚的连续冠状面切片。将脑切片置于 24 孔板中，以 PB 缓冲液在 4 °C 下保存。为防止污染，可在 PB 溶液中添加 0.05% 叠氮化钠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学染色
	<ol>
		<li>将游离漂浮的切片在封闭缓冲液（含 0.05% 叠氮化钠、1% 甘氨酸、5% 正常山羊血清和 0.1% Triton X-100 的 PB）中，于室温下在摇床上轻柔振荡孵育 1 小时。</li>
		<li>小心用移液器移除封闭缓冲液，加入适当稀释比例的兔抗 GFP 一抗（见材料表），溶于封闭缓冲液中，在 4 °C 下轻柔振荡孵育 48 小时。</li>
		<li>用 PB 至少洗涤 3 次，每次间隔 10 分钟，以去除未结合的一抗溶液。</li>
		<li>将游离漂浮切片与适当稀释的荧光标记二抗（溶于封闭缓冲液，见材料表）在室温下轻柔振荡孵育 1 小时。孵育过程中避免切片暴露于直射光线下。</li>
		<li>用 PB 洗涤二抗溶液，每次 10 分钟，共 3 次；然后通过将切片与 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）在水中以 1 mg/ml 浓度孵育 5 分钟进行复染。用蒸馏水快速冲洗两次，去除 DAPI 溶液。</li>
		<li>使用细毛刷小心将切片转移至显微镜载玻片上。滴加数滴用于荧光样本的封片剂（见材料表）覆盖组织，小心盖上盖玻片，确保封片剂均匀分布于整个表面且无气泡。轻轻按压盖玻片以排出多余封片剂。</li>
		<li>待封片剂完全干燥（2–16 小时）后，使用 488 nm 激光进行共聚焦激光扫描显微镜观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neural+stem+cells+bridge+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neural stem cells bridge their niche.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 698-708 (2012).</li>
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</ol>

所有操作均在生物安全二级实验室中进行。动物实验方案已获瓦伦西亚大学伦理委员会批准，并严格遵守欧盟指令 2010/63/EU 的相关规定。

与其他病毒系统相比，慢病毒（LVs）在成年神经干细胞（NSCs）的遗传修饰方面具有重要优势16,18。通过立体定位将慢病毒递送至V-SVZ微环境，是一种高效标记和示踪低频分裂的B1型神经干细胞的方法，克服了其他常用技术（如BrdU标记法或逆转录病毒转导）的局限性：BrdU在多次细胞分裂后会被稀释，而逆转录病毒仅能靶向在施用时处于增殖状态的细胞。慢病毒与腺病毒均可不依赖细胞周期状态实现感染，这对于不分裂的细胞（如室管膜细胞）或相对静息、分裂稀少的成年神经干细胞尤为关键16,18。转导的转基因可高效、稳定地整合至细胞基因组并持续表达，从而实现对转导细胞及其子代细胞的形态学特征分析。
神经干细胞存在于一个高度特化的微环境中，周围有室管膜细胞、血管细胞以及其自身产生的子代细胞，共同形成一个受到严密调控的环境2与许多胎儿神经干细胞（NSCs）类似，B1细胞位于脑室旁边，其顶端细小突起延伸至脑室腔，末端形成单一的非运动性初级纤毛，浸没于脑室脑脊液（CSF）中1 (图2a）。...

小鼠侧脑室壁朝向纹状体的室管膜下区（V-SVZ）是一个高度活跃的生发区域，在此区域内前体细胞持续进行复制与分化，从而不断产生嗅球（OB）中间神经元和胼胝体少突胶质细胞1。这些细胞的终生生成被认为依赖于该区域内存在的神经干细胞（NSCs；亦称B1细胞），这些细胞表达星形胶质细胞抗原胶质纤维酸性蛋白（GFAP）以及nestin、Id1和Sox2等干细胞标志物2。表达GFAP的B1细胞产生过渡性扩增前体细胞（TAP细胞；又称C细胞），后者表达转录因子Dlx2（远端-less同源盒2）和Ascl1（哺乳动物achaete-schute同源物1），快速分裂数次后，生成迁徙中的成神经细胞（A细胞）或成少突胶质细胞3。新生成的增殖性成神经细胞向前迁移，形成通往嗅球的吻侧迁移流（RMS），最终整合至颗粒层和小球层，分化为成熟的抑制性中间神经细胞。年轻的迁徙性成少突胶质细胞则移行至胼胝体（CC），转变为未成熟的NG2阳性细胞，这些细胞可在局部继续分裂，或进一步分化为成熟的髓鞘形成少突胶质细胞1,4。
B1细胞来源于胎儿期的放射状胶质细胞，保留了前体细胞的细长极化形态，并与其微环境形成高度特化的相互关系。这些细胞跨越衬于脑室壁的室管膜和灌注V-SVZ微环境的血管网络。B1细胞的顶端小突起穿插于多纤毛的室管膜细胞之间，并终止于一条单一的非运动性初级纤毛；而其基底突起则延伸较长距离，伸向该微环境中的平面状血管丛，并终止于血管丛毛细血管的基膜2,5-8。
在完整的 V-SVZ 生态位中，区分 B1-NSCs 与同样为 GFAP+ 的非成神经星形细胞的最可靠方法，是基于侧脑室壁的整体装片制备，并在使用 GFAP 免疫染色标记 B1-NSC 细胞纤细的顶突、β-catenin 标记细胞膜、以及 γ-tubulin 作为纤毛基体标志物或乙酰化 α-tubulin 标记每根纤毛延伸范围后，通过三维共聚焦显微镜进行分析5,8。从脑室表面观察这些整体装片表明，B1 细胞与室管膜细胞以“风车状”结构排列5，其中一个或多个 GFAP+ B1 细胞的单纤毛顶突被一圈多纤毛的室管膜细胞呈轮状包围。
B1细胞的特征性形态与实验结果一致，表明血管/内皮细胞和脑室脑脊液（CSF）是作用于神经干细胞（NSCs）的可调控可溶性信号来源2,6,9-11。在脑室表面，室管膜细胞与B1细胞之间存在同型和异型的顶端-侧向相互作用，包括紧密连接和黏附连接5,12。此外，参与B1细胞与室管膜细胞之间连接复合体的黏附分子（如N-钙黏蛋白和V-CAM）已被证明不仅调控B1细胞在V-SVZ微环境中的高度有序定位，还调控其静息状态12,13。室管膜细胞与B1细胞构成的单层结构似乎起到扩散屏障的作用，允许水和小分子从脑脊液中进行受控流动，但限制大分子蛋白的细胞间通透10,11。实验证据表明，B1细胞顶端纤毛的独特位置可能使其作为脑脊液中信号多肽的感应器发挥作用2,5-7。室管膜细胞本身也是可溶性和膜结合信号分子的来源，在调控NSC行为中发挥重要作用14,15。
可示踪的核苷类似物（如溴脱氧尿苷，BrdU）或逆转录病毒已被广泛用于标记包括神经干细胞（NSCs）在内的前体细胞， 体内然而，这些方法并不适合长期命运示踪，因为BrdU信号会随着细胞的多次分裂而逐渐稀释，而逆转录病毒由于需要细胞增殖才能实现转导，似乎更倾向于靶向短暂扩增的细胞。16,17. 以研究神经干细胞的生理学 在体，包括与微环境组分的相互作用，建立一种标记和示踪罕见分裂细胞的方法至关重要，因为B1型神经干细胞大多处于静息状态，而其邻近的室管膜细胞在生理条件下从不分裂3在此，我们证明慢病毒载体（LVs）能够高效地标记基因并实现对成年神经干细胞（NSCs）及非分裂型室管膜细胞的长期遗传修饰，这最可能归因于LVs能够以不依赖细胞周期的方式转导并整合入靶细胞基因组的特性。此外，我们展示了通过调控递送途径和病毒滴度，可特异性地转导室管膜细胞而非B1细胞，从而实现对室管膜细胞依赖性微环境效应在神经干细胞中作用的分析。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;第1部分：用于体内递送的LV的制备。&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;设备：&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima XL-100K</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW-28</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW-55</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>358126</td><td>25 mm × 89 mm</td></tr><tr><td>超速离心管&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>326819</td><td>13 mm x 51 mm</td></tr><tr><td>超速离心机转子适配器</td><td>Beckman Coulter</td><td>358156</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>SPL</td><td>PLC-30006</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>SPL</td><td>PLC-30024</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>SPL</td><td>PLC-20101</td><td>100 x 20 样式</td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>Afora</td><td>DE400800</td><td>12 mm × 75 mm，5 ml</td></tr><tr><td>无菌FACS滤杯</td><td>BD</td><td>340626</td><td>30 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>硝酸纤维素滤膜</td><td>默克密理博</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>蓝色激光 488 nm</td></tr><tr><td>Steritop 滤器</td><td>生物膜</td><td>FPE-204-500&amp;nbsp;</td><td>0.22 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;试剂：&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE 质粒&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12251</td><td>核心包装质粒</td></tr><tr><td>pRSV.REV 质粒&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12253</td><td>核心包装质粒</td></tr><tr><td>pMD&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;G质粒&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>包膜质粒</td></tr><tr><td>pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre 质粒&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12252</td><td>转移载体质粒</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基&amp;nbsp;</td><td>Biowest</td><td>L0101-500</td><td>用于 HeLa 细胞培养</td></tr><tr><td>Iscove改良型Dulbecco培养基&amp;nbsp;</td><td>生命技术</td><td>12440-053</td><td>293T 细胞培养</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td></td><td></td><td>Tris-HCl（sigma，T5941），0.1 mM EDTA（sigma，E5134），pH 7.6&amp;nbsp; 无DNA酶/RNA酶、0.2 &amp;micro;m 经无菌过滤</td></tr><tr><td>2x HBS</td><td></td><td></td><td>0.28 M NaCl（Sigma，S7653），0.05 M HEPES（Sigma，H7523），1.5 mM 无水 Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;（Sigma，S7907）溶于 dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O（最好不是MilliQ）。用NaOH溶液（Calbiochem，567530）调节pH至7.0。</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td>100倍浓缩储备液，用于配制HeLa和293T细胞培养基，终浓度为10倍。</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513-100</td><td>200 mM 储存液，用于配制 HeLa 和 293T 细胞培养基，终浓度为 6 mM。</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>生命技术</td><td>11360-039</td><td>100 mM 储存液，用于配制 HeLa 和 293T 细胞培养基，终浓度为 1 mM。</td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>生命技术</td><td>35050-061</td><td>用于配制293T培养基，终浓度为1%。</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>储存液含有 5,000 单位/毫升青霉素和 5 毫克/毫升链霉素。用于配制 HeLa 和 293T 细胞培养基，终浓度为 1%。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>含酚红，每升含有2.5 g猪胰蛋白酶和0.2 g EDTA 4Na的HBSS。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp; （PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>不含氯化钙和氯化镁，10倍浓度，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养。该储备液用于在细胞培养级水中配制1倍浓度的PBS。</td></tr><tr><td>聚凝胺（hexadimethrine bromide）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>粉末。在 dH₂O 中配制 8 mg/ml 的 1,000 倍储存液&lt;亚区2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>甲醛，电子显微镜级，16%</td><td>EM Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;第2部分：将LV立体定位注射至SEZ实质或侧脑室。&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;设备：&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vernier 立体定位仪</td><td>NeuroLab，Leica</td><td>39463001</td><td>http://www.leicabiosystems.com/</td></tr><tr><td>Cunningham小鼠和新生大鼠适配器</td><td>NeuroLab，Leica</td><td>39462950</td><td></td></tr><tr><td>注射器固定器</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-311-CE</td><td></td></tr><tr><td>33 号针头注射器</td><td>Hamilton</td><td>P/N&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 84851/00</td><td>#85RN</td></tr><tr><td>电动钻机</td><td>精细科学工具</td><td>98096</td><td></td></tr><tr><td>保温毯</td><td>Ufesa</td><td>AL5512/01</td><td>230-240 V，100-110 W，型号 C_AL01</td></tr><tr><td>Shaver&amp;nbsp;</td><td>Jata</td><td>MP373N</td><td>模型：beauty，3 V，300 mA，型号 HT-03</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;试剂：&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>美托咪定</td><td>Esteve</td><td>DOMTOR&amp;nbsp;</td><td>1 mg/ml 的商用溶液。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Merial</td><td>Imalgene 500&amp;nbsp;</td><td>50 mg/ml 的商用溶液</td></tr><tr><td>美托咪定/氯胺酮混合物</td><td></td><td></td><td>配制工作液：将美托咪定稀释至终浓度为0.2 mg/ml，氯胺酮稀释至终浓度为15 mg/ml，溶剂为生理盐水。作为麻醉剂使用时，注射体积应使美托咪定终剂量为每公斤体重0.5–1 mg，氯胺酮终剂量为每公斤体重50–75 mg。</td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>辉瑞</td><td>托布吉辛</td><td>储存液浓度为10 mg/ml。使用时用生理盐水稀释至1 mg/ml作为镇痛剂。</td></tr><tr><td>阿替美唑</td><td>Esteve</td><td>安替塞丹</td><td>储存液浓度为5 mg/ml，使用时用生理盐水稀释至终浓度0.5 mg/ml以拮抗麻醉。</td></tr><tr><td>0.9% 生理盐水溶液</td><td>Braun</td><td>13465412</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>皮肤用粘合剂</td></tr><tr><td>HydroGel</td><td>透明 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>70-01-5022</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>金伯利-克拉克</td><td>34120</td><td>11 cm x 21 cm</td></tr><tr><td>漂白剂/Virkon</td><td>Dupont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科标记笔</td><td>Staedler</td><td>313-9</td><td>永久性发光标记</td></tr><tr><td>眼科润滑剂 &amp;nbsp;</td><td></td><td>SICCAFLUID</td><td>0.5 g/剂量，卡波姆 974P</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>聚维酮碘</td><td>694109.6</td><td>10% 聚维酮碘</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;第3部分：组织学分析。&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;设备：&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动蠕动泵</td><td>Cole-Parmer 仪器公司</td><td>HV-07524-55</td><td>Masterflex L/S 可调速经济型驱动器，1.6–100 rpm，230 V</td></tr><tr><td>泵头</td><td>Cole-Parmer 仪器公司</td><td>HV-07518-00</td><td>Masterflex L/S Easy-Load 精密管路泵头；PSF 泵壳，CRS 转子</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>Cole-Parmer 仪器公司</td><td>HV-96410-16</td><td>Platinum L/S 16</td></tr><tr><td>头皮静脉输液套件</td><td>Vygon V-green</td><td>70246.05T</td><td>25 G，30 cm 管长</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>FluoView FV10i</td><td></td></tr><tr><td>热板</td><td>技术</td><td>SHP-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;试剂：&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PB）</td><td></td><td></td><td>0.2 M PB：0.2 M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; （Sigma，S7907）和 0.2 M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;（Panreac，141965.1211）在 dH 中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，调节pH至7.2–7.4</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Panreac</td><td>141451.1211</td><td>每次均需新鲜配制。将去离子水加热&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 至 55&amp;ndash;60 &amp;deg;C 在通风橱中使用加热板，边搅拌边加入PFA粉末，配制8%溶液。由于PFA不易溶解，溶液呈乳白色浑浊状。逐滴加入1N NaOH，直至溶液变澄清。冷却后，用Whatman滤纸过滤，并加入等体积的0.2 M PB。</td></tr><tr><td>生理盐水溶液</td><td></td><td></td><td>0.9% NaCl in dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>乐泰</td><td>767547</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Panreac</td><td>122712.1608</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-100</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>默克密理博</td><td>S30-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>抗GFP兔抗体</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-215</td><td>以1:500稀释度使用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗兔IgG（H+L）抗体</td><td>分子探针</td><td>A-21206</td><td>以1:750的稀释比例使用</td></tr><tr><td>6-二氨基二苯并吲哚二盐酸盐水合物（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>荧光核染色。使用浓度为 2 mg/ml 的 ddH₂O 溶液。&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. 4℃避光保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>EM Sciences</td><td>17984-25</td><td>荧光样本封片剂</td></tr></tbody></table>

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

相对静息的体细胞干细胞在大多数成年组织中支持终生的细胞更新。成年哺乳动物大脑中的神经干细胞仅局限于两个特定的神经发生微环境：海马齿状回的颗粒下区和侧脑室壁的室管膜下区（V-SVZ；亦称室管膜下区或SEZ）。 在体 成体干细胞群体的基因转移策略（即 哺乳动物大脑中的成体干细胞群体，实现目的转基因在干细胞及其分化后代中的长期表达，是当前生物医学与生物技术研究中的关键工具。本文介绍一种直接 体内 本方法通过利用慢病毒（LVs）对细胞周期非依赖性感染的特性以及V-SVZ微环境高度特化的细胞结构，实现了对成年小鼠V-SVZ细胞的稳定遗传修饰。具体而言，本实验方案包括将空载慢病毒（对照）或携带特定转基因表达盒的慢病毒直接注射至V-SVZ区域本身，以在体内靶向该微环境中所有类型的细胞，或注射至侧脑室腔内，以特异性靶向室管膜细胞。 体内 靶向神经发生微环境中所有类型的细胞，或注入侧脑室腔内，仅靶向室管膜细胞。随后，表达盒被整合至转导细胞的基因组中，而慢病毒（LVs）编码的荧光蛋白则可用于检测转导细胞，从而分析标记细胞及其子代细胞中细胞自主性与非自主性、依赖微环境的效应。

慢病毒介导的基因递送系统可用于成年小鼠侧脑室下区（V-SVZ）细胞的长期体内转导，从而在细胞增殖、迁移和分化过程中对其进行示踪和遗传学改造。该感染方法效率高，可获得大量表达报告基因的转导细胞，这些细胞可轻松地与未感染细胞区分开来。目前我们主要使用由泛表达的磷酸甘油酸激酶启动子驱动的GFP荧光报告分子来示踪转导细胞，但也可使用其他报告分子或蛋白标签。我们通常使用抗GFP抗体进行检测，而非直接检测报告分子的荧光信号，因为前者可获得更强的荧光信号。此外，脑组织可新鲜解剖后直接浸入固定液，但通过经心脏灌注固定可获得更佳的效果。
在立体定位引导下，将纯化且浓缩的病毒载体缓慢注射至侧脑室下区（V-SVZ）与纹状体交界处（图 2a, b）。注射后两个月，在 V-SVZ 及注射点周围约 1 mm 半径范围内均可见大量 GFP+ 细胞（图 2a, b）。慢病毒（LVs）可转导 V-SVZ 中所有类型的细胞，且室管膜细胞中报告基因的表达表明，LVs 亦能高效靶向非分裂细胞（图 2...

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。

相对静息的体细胞干细胞在大多数成年组织中支持终生的细胞更新。成年哺乳动物大脑中的神经干细胞局限于两个特定的神经发生微环境：海马齿状回的颗粒下区和侧脑室壁的室管膜下区（ventricular-subventricular zone，V-SVZ；也称为室管膜下区或SEZ）。针对成年干细胞群体（例如哺乳动物大脑中的干细胞）开发体内基因转移策略，以实现目的转基因在干细胞及其分化后代中的长期表达，是当前生物医学与生物技术研究的关键工具。本文介绍了一种直接用于稳定遗传修饰成年小鼠V-SVZ细胞的体内方法，该方法利用慢病毒载体（LVs）的细胞周期非依赖性感染特性以及V-SVZ微环境高度特化的细胞结构。具体而言，本实验方案包括将空载LVs（对照）或携带特定转基因表达盒的LVs直接注射至V-SVZ区域，以在体内靶向该微环境中所有类型的细胞；或注射至侧脑室腔内，以特异性靶向室管膜细胞。表达盒随后整合至被转导细胞的基因组中，而LVs所编码的荧光蛋白则可用于标记被转导的细胞，从而分析标记细胞及其后代中细胞自主性与非自主性、依赖微环境的效应。

本实验的总体目标是将携带特定DNA构建体的高滴度慢病毒颗粒以低体积递送至成年小鼠的室管膜下区或侧脑室，以感染该区域所有细胞类型或仅影响室管膜细胞。该方法有助于解答成年小鼠室管膜下区神经干细胞与其邻近室管膜细胞之间相互作用的关键问题。该技术的主要优势在于，慢病毒载体能够以细胞周期非依赖的方式整合到靶细胞基因组中，从而实现对分裂频率较低的细胞进行长期标记。本次实验操作将由研究生 Beatriz Mart 进行示范。

stable-efficient-genetic-modification-cells-adult-mouse-v-svz-for

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

在成年小鼠V-SVZ细胞的神经分析的稳定，高效的基因修饰干细胞自主和非自主的影响

控制体细胞干细胞的扩增是阻碍其研究和治疗应用的主要因素。本文介绍了一种可在发育期和成年期时序性调控神经干细胞扩增的系统，该系统可用于增加小鼠大脑中生成的神经元数量。...

胚胎和成体神经干细胞的扩增 子宫内 电穿孔或病毒立体定位注射

来源：Porlan, E., 等．用于分析成年小鼠V-SVZ神经干细胞自主性与非自主性效应的稳定高效遗传修饰细胞方法．J. Vis. Exp.

小鼠模型中用于稳定遗传修饰的病毒立体定位注射

病毒载体可实现靶向基因操作。本文演示一种在小鼠脊髓中进行条件性基因表达或基因剔除的方法，通过立体定位注射将病毒载体注入脊髓背角，此处是初级躯体感觉传入神经与中枢神经系统神经元之间突触联系的重要部位。...

在小鼠脊髓中进行病毒载体的立体定位注射以实现条件性基因操作

本文详细描述了一种从单只成年小鼠的脑室下区和齿状回同时生成神经前体细胞培养物的实验方案，该培养物可采用贴壁单层培养或神经球培养的形式。...

一只小鼠，两种培养：从单只小鼠的两个神经发生区分离与培养成年神经干细胞

我们报告了一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的方法，用于从成年小鼠脑的脑室下区（SVZ）分离神经干细胞（NSCs）及其子代细胞。该方法应用于荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）转基因小鼠时，可实现通过活细胞成像来研究细胞周期进程。...

成年小鼠侧脑室下区神经干细胞与前体细胞的分选及细胞周期动态的活体成像

我们描述了一种使用自制固定装置进行立体定位手术的方案，用于将试剂微量注射到新生小鼠脑的纹状体中。该技术可实现对新生小鼠脑特定区域神经元细胞的遗传操作。...

新生小鼠脑纹状体细胞基因操作的立体定位手术

本文介绍了一种利用胚胎干细胞构建基因修饰小鼠模型的实验方案，尤其适用于大片段DNA的基因敲入（KI）。该方案结合CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行优化，与传统的依赖同源重组的线性化DNA靶向方法相比，显著提高了基因敲入效率。...

利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

本文详细介绍了从活体大鼠脑组织中分离神经干细胞和少突胶质前体细胞的方法。该方法可在不损害动物健康状况的前提下，从同一动物多次采集这些细胞。...

从活体大鼠中分离神经干细胞和少突胶质细胞前体细胞的“脑乳法”

本文介绍了一种核转染系统，旨在提高从成年小鼠脑室下区分离获得的扩增神经干细胞（NSCs）的基因递送效率。研究结果表明，该方法显著改善了神经干细胞的基因调控效果，优于传统转染方案，并提高了细胞存活率。...

从小鼠成年脑室下区分离、扩增及核转染神经干细胞

本文介绍了一种工程化化学重编程干细胞的方案，通过将这些细胞分化为多巴胺能前体细胞，移植到帕金森病小鼠模型中，并评估其行为学和电生理学结果，以验证移植细胞的成功整合及其功能有效性。...

化学遗传学调控重编程干细胞来源的前体细胞在治疗神经退行性疾病中的应用

了解利用慢病毒颗粒对成年小鼠脑室-室管膜下区神经干细胞进行长期基因修饰的方法。该技术可区分细胞自主性与非自主性效应，为神经干细胞微环境研究提供重要工具。

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

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