Name: 地磁场（GMF）和植物进化:调查逆转基因食品对影响拟南芥开发与基因表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 了解利用亥姆霍兹线圈逆转地磁场的方法，研究其对拟南芥根系形态和基因表达的影响。该技术为探索磁场在植物进化中的作用提供了可控实验模型。

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本工作获得了意大利都灵大学生命科学与系统生物学系向 MEM 提供的资助。作者感谢 G. Gnavi 在部分实验中提供的技术支持。CTR 由惠康信托基金和英国皇家学会资助（资助编号：098436/Z/12/Z）。

1. 三轴线圈的设置
注意：图1展示了用于逆转地磁场（GMF）的三轴线圈。
<ol>
	<li>打开三轴磁力计，其探头已插入三轴线圈中。</li>
	<li>打开计算机并启动磁力计软件，以采集三轴磁力计的数据。</li>
	<li>利用磁力计报告的分量值计算地磁场（GMF）的强度。例如，当磁力计测得的分量值为：Bx = 6.39 µT，By = 36.08 µT，Bz = 20.40 µT 时，可通过以下公式计算得到磁场强度为 41.94 µT：B = BGMF + B额外的，其中 B额外的 = (Bx2 + 作者2 + Bz2)½ (即， 41.9 µT（以示例为准）。</li>
	<li>打开三台直流电源（双量程：0-8 V/5 A 和 0-20 V/2.5 A，50 W），每台分别连接一组亥姆霍兹线圈（共三组），并通过 GPIB 接口与计算机连接（图1B).</li>
	<li>设置电源电压，以产生具有反向磁场矢量的所需磁场。例如，当 BGMF 如步骤1.3所述，结合此处所述仪器的线圈尺寸，将电压设置为Vx =0.00 V，Vy = 30.52 V，Vz = 0.00 V，以生成新的合成磁场 B = BGMF + B三轴线圈 = (6.38, -36.08, 20.39) µT。 即， 一个与B大小相同的新磁场GMF 但指向不同的方向。</li>
	<li>使用1.3节中描述的程序，通过磁力计软件验证新磁场。</li>
	<li>使用培养皿，按照第2节所述方法，将植物分别暴露于正常和反向的地磁场条件下。</li>
	<li>进行假暴露实验时，保持磁场强度大小等于 | BGMF并保持 地磁场垂直分量的大小相等但改变方向（即， “北、东或西”方向的水平分量磁场，在三轴线圈中通以相等电流时，与磁场反转条件进行比较。通过改变线圈电压（如1.5节所述）来实现。 
	注意：这种假暴露可排除线圈本身或用于控制线圈的电子设备可能产生的细微加热或振动效应。</li>
	<li>通过向执行实验其余部分和/或分析数据的人员隐藏田间处理条件，开展双盲实验。</li>
</ol>
2. 植物材料的准备与植物生长条件
<ol>
	<li>使用拟南芥（Arabidopsis thaliana）生态型Columbia 0（Col 0）的种子，将其放入1.5 ml离心管中，用含0.02%（v/v）Triton X-100的5%（w/v）次氯酸钙溶液与80%乙醇（EtOH）混合液在25–28 °C下振荡处理10–12分钟进行表面灭菌。随后用80% EtOH漂洗两次，再用100% EtOH洗涤，最后用无菌蒸馏水冲洗。</li>
	<li>配制1 L改良的Murashige和Skoog22（MS）培养基：加入2.297 g MS（0.5×MS基础盐混合物）、10 g蔗糖，加去离子水至1 L，用KOH调节pH至5.8–6.0。加入16 g琼脂，于120 °C高压灭菌20分钟。</li>
	<li>在培养基凝固前，将80 ml培养基倒入每个（120 × 120 mm2）方形培养皿中。每皿播种30粒无菌种子，然后用石蜡膜密封培养皿。</li>
	<li>将培养皿水平置于4 °C黑暗条件下春化处理2天，以促进并同步种子萌发，随后将培养皿暴露于正常或反向的地磁场（GMF）环境中。</li>
	<li>将种子置于气候可控的环境中，在22 °C下垂直培养，平行实验分别在三轴线圈内部和外部进行，光照周期为8小时黑暗和16小时光照，使用钠蒸气灯（光照强度为220 × 10-6 E m-2s-1）。使用蓝色明胶滤光片以减少光源中的红光成分。</li>
	<li>在正常（对照）和反向（处理）地磁场（GMF）条件下培养植株10天后，进行RNA提取。</li>
	<li>处理结束后，拍摄培养皿的照片。</li>
	<li>使用ImageJ软件计算根长和叶面积。
	<ol>
		<li>首先测量培养皿一侧的实际长度，然后打开培养皿图像，使用“直线”工具绘制一条精确穿过培养皿边缘的直线。</li>
		<li>在“分析”菜单中选择“设置尺度”，在“已知距离”框中输入实际距离（例如，120 mm），并输入长度单位（mm）；最后勾选“全局”选项，使该设置适用于所有测量。</li>
		<li>测量根长时，使用“自由手绘”工具仔细沿根的轮廓描记，然后在“分析”菜单中选择“测量”功能获取长度。依次测量图像中所有根的长度，并保存文件以供后续统计分析。</li>
		<li>测量叶面积时，从“图像”菜单中选择“调整”→“颜色阈值”，选中单个叶片后，在“分析”菜单中选择“分析颗粒”。保存各叶片的测量数据用于统计分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 拟南芥 总RNA提取、定量实时PCR（qPCR）反应条件及引物 拟南芥
<ol>
	<li>分别收集30个茎和30个根，并立即用液氮速冻。然后在液氮中用研钵和研杵研磨。</li>
	<li>使用总RNA提取试剂盒及无RNase的DNase处理试剂盒，按照制造商说明书提取总RNA。</li>
	<li>使用RNA纳米试剂盒和毛细管凝胶电泳，按照制造商说明书检测样品的质量和数量。通过分光光度法确认RNA的定量结果。</li>
	<li>取2 µg总RNA，使用随机引物和cDNA反转录试剂盒，按照制造商推荐条件合成第一链cDNA。</li>
	<li>使用SYBR Green I染料并以ROX作为内部上样标准，在实时定量PCR系统上进行所有实验。</li>
	<li>反应体系为25 µl，包含12.5 µl 2× SYBR Green qPCR主混合液、0.5 µl cDNA和100 nM引物。引物序列见表1。设置非反转录对照（使用未进行反转录的总RNA，以监测基因组DNA污染）和无模板对照（以水替代模板）。</li>
	<li>采用标准曲线法23计算所有引物对的扩增效率。</li>
	<li>PCR反应条件如下：CRU3、COTP1、RRTF1：95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环（95 °C变性15秒，58 °C退火30秒，72 °C延伸30秒）；UBP6、eEF1Balpha2、ACT1、GAPC2、CAT3、TAPX、APX1、RbohD、FeSOD1：95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环（95 °C变性15秒，57 °C退火20秒，72 °C延伸30秒）。</li>
	<li>在每个退火和延伸阶段后读取荧光信号。所有运行均需进行熔解曲线分析，温度范围为55至95 °C，通过在热循环程序中加入解离步骤实现。通过结果选项卡中的解离曲线界面查看解离曲线（荧光强度随温度变化的曲线图）。确保在分析/设置界面中选择实验解离阶段所采集的数据用于分析。</li>
	<li>通过将来自三次独立RNA提取的cDNA进行10倍系列稀释（1至103倍），并在技术重复中分析三次，确定模板浓度与阈值循环值（Ct值）之间的线性范围24,25。</li>
	<li>使用实时定量PCR仪器配套软件分析所有扩增曲线以获得Ct值。通过最佳看家基因的表达水平对相对RNA水平进行校准和归一化，具体操作如下：3.11.1）通过结果选项卡进入扩增曲线界面，在分析选择/设置界面中选择需分析的扩增斜率或平台期，然后在命令面板的荧光菜单中选择dRn（基线校正后的归一化荧光值）。通过结果选项卡进入板样本值界面，显示各孔的Ct值。</li>
	<li>使用四个不同的参考基因[例如，细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPC2）、泛素特异性蛋白酶6（UBP6）、肌动蛋白1（ACT1）和延伸因子1Bα亚基2（eEF1Balpha2）]对实时定量PCR结果进行归一化。使用分析软件26筛选排名最高的基因，并选择表达最稳定的基因用于归一化。
	<ol>
		<li>简要步骤：在Excel表格中整理输入数据，第一列为基因名称，第一行为样本名称。然后从菜单栏选择分析软件，通过对话框选择输入数据。</li>
		<li>接着勾选“样本名称”、“基因名称”和“仅简单输出”选项，点击“Go”按钮执行分析。选择排名最高（即稳定性值最小）的基因作为表达最稳定的候选基因。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绘制图表，展示茎和根中基因表达的差异倍数变化。</li>
</ol>
4. 统计分析
<ol>
	<li>以均值 ± 标准误表示数据。通过方差分析（ANOVA）及Tukey检验，并结合Bonferroni和Dunn-Sidak校正概率检验（95%置信度），比较对照组与处理组。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们最近发现，地磁场（GMF）倒转与大多数被子植物科级谱系发生分化的时间之间存在显著的相关性2。然而，尽管已有大量关于不同地磁场强度效应的假说和研究，地磁场倒转本身是否能够引起植物基因表达和形态上的显著变化，这一假设至今尚未得到证实。本文中，我们首次展示了一种在实验室中利用八角形三轴亥姆霍兹线圈实现地磁场倒转的方法，并证明环境磁场的倒转可导致植物表型变化以及基因表达的调控。
为了在足够大的空间范围内（2 × 2 × 2 m3）实现地磁场反转（或改性）以满足植物生长实验的需求，我们构建了一套八角形亥姆霍兹线圈系统。该系统并非市售产品（通常亥姆霍兹线圈为环形且尺寸较小），其建造成本较高。重要的是，该系统能够提供稳定的磁场改性，且在改性后的磁场中具有极佳的时间稳定性和均匀性。
该系统的设计和构建旨在将地磁场（GMF）的强度降低至正常条件下的千分之一，或反转磁场的任意三个维度。然而，线圈的设计无法产生高强度的磁场。因此，当前形式的仪器不适用于旨在评估高强度磁场对植物或其他生物影响的实验。
在实验室中，可通过多种方法实现类似于本方法所述的地磁场（GMF）改变，包括使用高磁导率的铁磁性金属板包围实验区域进行屏蔽，从而使磁场发生偏转并集中于金属内部。使用亥姆霍兹线圈的优势在于，该系统可使植物暴露于更接近自然的环境条件（如光照、空气流通）中， 等等。），因此不仅使其成为 体外 研究（如使用培养皿）以及 体内 植物生长与发育实验。本系统的尺寸构造形成了一个空间，可实现最高达 &#60;25 cm × 25 cm × 25 cm 空间内自然地磁场强度的千分之一3 球形体积（参见 图1A），从而可容纳多个培养皿或一些用于植物生长的小型花盆。
本文所述方法已应用于植物生物学研究；然而，该系统支持多种实验应用，包括病毒学和微生物学，以及线虫研究（例如, 秀丽隐杆线虫）、节肢动物和小型动物（包括小鼠和大鼠）。因此，关于逆转基因甲基化模式能否诱导形态学和转录组变化这一假说的验证，也可拓展至许多其他生物系统，甚至最终可能延伸至人类细胞。
地磁场（GMF）持续处于变化和波动状态。因此，在我们的实验中，一个主要挑战是提供对地磁场的持续补偿，以获得所需的新地磁场值。这只能通过读取磁力计数值并进行电压补偿，来实现对磁场值的连续控制。因此，该系统能够补偿地磁场的缓慢变化部分，但对高频波动则无能为力。
综上所述，使用三轴线圈逆转地磁场矢量对于证明该地磁场矢量的逆转能够诱导植物形态变化和差异基因表达具有重要作用。本方法所得结果为以下假说提供了有力证据：在地质时间尺度上，地磁场的逆转可能是推动植物进化的重要驱动力之一2。

地球磁场（或称地磁场，GMF）是地球上所有生物（包括植物）无法回避的环境因素。地磁场一直是地球的自然特征，因此在进化过程中，所有生物都受到其作用。越来越多的证据表明，地磁场能够影响多种生物过程1。地磁场并非均匀分布，其在地球表面的强度和方向存在显著的局部差异。地表的地磁场强度范围较广，从低于30 µT到接近70 µT不等。地磁场通过磁层偏转太阳风中的大部分带电粒子，从而保护地球及其生物圈免受太阳风的致命影响2。
植物会响应环境刺激；其中对光和重力等非生物因素的经典响应已被充分描述，即所谓的向光性和向重力性反应。尽管已有大量文献报道并综述了植物对磁场的感知与响应机制1，但目前对此仍知之甚少甚至一无所知。与引力场不同，在植物进化过程中，地磁场（GMF）持续发生变化，因此被视为一种重要的非生物胁迫因子，近年来被认为可能是推动植物多样化和物种形成的一种潜在驱动力2。地磁反转（或称地磁漂移）是指地磁场极性的改变。在地球的生命历史中，地磁反转已发生过多次，每次极性转换期间都使地球经历了一段地磁场强度减弱的时期。一些研究者推测，这些地磁场强度较低的过渡阶段可能使太阳风中的电离辐射到达地球表面，从而对生物体造成显著的胁迫，这种胁迫可能足以引发基因改变，最终促进植物的进化2。
对描述磁场对植物影响的实验进行详细分析后发现，存在大量相互矛盾的报告，其特征是缺乏合理的生物物理相互作用机制。许多实验本身极不现实，而另一些实验则缺少可检验的假设，最终缺乏说服力3。近年来，已有综述对磁场对植物影响的研究进展与现状进行了总结2,4-11。最近，有关低强度和高强度磁场效应的研究得到了深入探讨1，尤其关注地磁场（GMF）反转事件在植物进化中的作用2。
证实地磁场（GMF）反转影响植物进化的最直接方法是在实验室中通过测试植物对正常和反向磁场条件的响应，来模拟一次地磁场反转。为了检验该假设，我们构建了一套八边形三轴亥姆霍兹线圈对磁补偿系统（三轴线圈），该系统能够精确地反转正常的地磁场条件。
我们以Arabidopsis thaliana作为模式植物，研究了反向地磁场（GMF）对一些重要基因表达的影响：CRUCIFERIN 3（CRU3），该基因编码一种12S种子贮藏蛋白，可发生酪氨酸磷酸化，其磷酸化状态在Arabidopsis thaliana种子中受脱落酸（ABA）调控12,13；Copper Transport Protein1（COTP1），该基因编码一种属于重金属转运/解毒超家族的蛋白，在土壤铜吸收和花粉发育中发挥主要作用14；以及Redox Responsive Transcription Factor1（RRTF1），该基因编码ERF/AP2转录因子家族B-3亚家族的一个成员，含有一个AP2结构域，可促进基因表达通路的协同共激活，并赋予植物对非生物和生物胁迫的交叉耐受性15。
此外，我们还分析了五个参与氧化应激反应的基因：Fe 超氧化物歧化酶1（FSD1），该基因编码一种细胞质酶，可快速催化超氧阴离子（O2-）和水（H2O）转化为过氧化氢（H2O2）和分子氧（O2）16；过氧化氢酶3（CAT3），该基因编码一种酶，可催化H2O2分解为水和氧气17,18；类囊体抗坏血酸过氧化物酶（TAPX），该基因编码一种叶绿体类囊体过氧化物酶，能够清除H2O219；抗坏血酸过氧化物酶1（APX1），该基因编码一种细胞质过氧化物酶，可清除H2O2，并被认为是NO衍生物分子介导的翻译后修饰的潜在靶点之一20；以及NADPH-呼吸爆发氧化酶蛋白D（RbohD），该基因编码一种生成O2-的酶，在调控拟南芥的生长、发育和应激反应中发挥关键作用21。
我们的地磁场反转方法首次提供了证据，表明地磁场反转可诱导拟南芥（A. thaliana）根和茎在形态及基因表达上的显著变化。本实验方案为评估地磁场反转对植物形态和基因表达的影响提供了一种创新方法，并可用于探讨地磁场反转对植物其他行为特征的潜在影响，从而为讨论地磁场反转在植物进化中的作用提供指导。

<table><tbody><tr><td>三轴磁力计</td><td>Bartington&amp;nbsp;</td><td>Mag-03MC</td><td>三轴通量门磁力计</td></tr><tr><td>磁力计电源</td><td>Bartington&amp;nbsp;</td><td>Mag-03PSU</td><td>三轴通量门磁力计</td></tr><tr><td>磁力计软件</td><td>Bartington&amp;nbsp;</td><td>Mag03DAM</td><td>三轴通量门磁力计</td></tr><tr><td>直流电源&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>E3642A</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钙&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>211389</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>X100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>GroLux 钠蒸气灯&amp;nbsp;</td><td>OSRAM Sylvania</td><td>600W</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 植物RNA提取试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74903</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的DNase&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>高容量cDNA反转录试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>Mx3000P</td><td>Agilent Technologies</td><td>401512</td><td></td></tr><tr><td>2x MaximaTM SYBR Green qPCR 预混液&amp;nbsp;</td><td>Fermentas International, Inc</td><td>K0221</td><td></td></tr><tr><td>封口膜（Parafilm）</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MS基础培养基（Murashige和Skoog）</td><td>Sigma</td><td>M5519&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>方形培养皿（120 × 120 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;）</td><td>Sigma</td><td>Z692344&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

地磁场（gmf）与植物进化：研究地磁场反转对arabidopsis thaliana发育和基因表达的影响

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

植物进化研究中最引人注目的观察结果之一，是地磁场（GMF）倒转（或漂移）事件的发生与被子植物辐射演化时间之间的相关性。这引出了一个假说：地磁场极性的改变可能在植物进化过程中发挥作用。本文描述了一种通过将拟南芥（Arabidopsis thaliana）暴露于人工反转的地磁场条件下以检验该假说的方法。我们使用三轴磁力计采集数据，并据此计算地磁场的强度。三个直流电源连接至三组亥姆霍兹线圈，并由计算机控制以调节地磁场条件。生长在培养皿中的植物被分别暴露于正常和反转的地磁场环境中，同时进行了假暴露实验作为对照。实验过程中对植株进行拍照，并对图像进行分析以测定根长和叶面积。提取拟南芥总RNA，并对以下基因的表达水平进行定量实时PCR（qPCR）分析：CRUCIFERIN 3（CRU3）、copper transport protein1（COTP1）、Redox Responsive Transcription Factor1（RRTF1）、Fe Superoxide Dismutase 1（FSD1）、Catalase3（CAT3）、Thylakoidal Ascorbate Peroxidase（TAPX）、细胞质Ascorbate Peroxidase1（APX1）以及NADPH/respiratory burst oxidase protein D（RbohD）。为标准化qPCR结果，分析了四个不同的参考基因，从中选出最适合作为内参的基因用于后续分析。我们的数据首次表明，利用三轴线圈反转地磁场极性会对植物生长和基因表达产生显著影响。该结果支持地磁场倒转可诱导植物发育变化的假说，这种变化可能导致更高的选择压力，最终推动植物的进化。

本实验方案的目的是提供一种方法，用于评估地磁场（GMF）反转是否会影响植物发育和基因表达 拟南芥 生态型Col 0。如图所示的三轴线圈 图1A 当施加适当的驱动电压时，用于逆转GMF（图1B），按方案第1.5步所述方法获得。三轴线圈的尺寸约为2 x 2 x 2 m3，这在反向地磁场条件下为放置多个培养皿提供了充足空间。对照组在相同的环境条件下生长，且处于正常地磁场值下。经过10天的正常和反向地磁场暴露后，植物表型显示出明显的形态学改变。如图所示 图2，对照植株（即，于正常地磁场条件下培养）的根长表现出显著差异（经Dunn-Sidak和Bonferroni校正后的概率 &lt;0.001；Student’s t = 10.68，df = 31），其数值（29.41 mm；SEM = 1.04；N = 32）高于暴露于反向地磁场（GMF）的植株（17.53 mm；SEM = 0.58；N = 36）。在地磁场反向处理的植株中，地上部分形态也发生改变，表现为小叶展开程度降低。处于正常条件下的植株平均叶面积为4.95 mm2 （标准误 0.025，N = 54），而在反向地磁场条件下暴露的植物表现出显著差异（Dunn-Sidak 和 Bonferroni 校正概率 = &lt;0.001；student’s t = 31.32，df = 53）更低的叶面积值（3.71 mm2；标准误（SEM）= 0.032；N = 54）。因此，拟南芥在反向地磁场条件下暴露后，根长和叶面积均显著减小。
叶片扩展和根系生长依赖于细胞的分裂和伸长27。因此，植物的发育、生产力和整体适应性依赖于最佳的地上部分和根系结构28。在地磁场倒转条件下，植物根长和叶面积减小，表明植物中存在一种感知系统，不仅能够感知磁场强度的变化，还能响应相对于重力方向的磁场“方向”改变。地磁场倒转可能影响植物生长的假说在我们的实验中得到了有力支持，结果表明，地磁场倒转条件可显著影响植物发育。
形态学变化还伴随着基因表达的变化。在管家基因中，表达最稳定的基因为elongation factor 1B alpha-subunit 2。第一组基因（CRU3、COTP1、RRTF1）的基因表达发生了显著改变（图3）。在暴露于保留的GMF条件下的植株中，这三个基因的地上部分表达均显著增加（P &lt;0.05），增幅约为2.5倍。在正常GMF条件下，CRU3在根部的表达上调，但在逆转的GMF条件下则显著下调（P &lt;0.05）。而COTP1和RRTF1的表现相反：在正常条件下表达下调，在GMF逆转条件下表达上调（图3）。
球蛋白12S（cruciferin）是A. thaliana及其他十字花科植物种子中最丰富的贮藏蛋白，其前体在粗面内质网中合成，随后被转运至蛋白质贮藏液泡13。幼苗萌发需要降解cruciferin以提供初始氮源。cruciferin降解的下调会通过干扰细胞结构或细胞组分的发育而抑制胚胎发育29,30。我们的结果表明，CRU3基因的上调与叶片扩展减小和根长缩短相关，表明该基因对地磁场（GMF）反转敏感，且其过表达可能促进植物发育受阻。此外，GMF反转在根中显著下调CRU3的表达，这与根长缩短相关。铜是植物多种关键生理过程所必需的辅因子，但过量时会产生毒害作用；因此，铜转运蛋白的过表达会损害植物生长。GMF反转导致COTP1在茎和根中均显著过表达，从而解释了植物生长受抑制的现象。离子胁迫会破坏叶绿体代谢，而叶绿体代谢与细胞的氧化还原状态密切相关。在拟南芥中，转录因子RRTF1对调控响应氧化还原变化相关基因的表达具有重要作用31。因此，当植物暴露于可改变其生理与发育程序的外界刺激时，预期该重要转录因子将发生过表达。GMF反转在茎和根中均引起RRTF1的显著过表达，表明植物在反转的GMF条件下产生了更强的氧化应激反应。
通过分析参与氧化应激的五个基因，获得了有趣的结果。总体而言，当植物在正常或反转的地磁场（GMF）条件下生长时，从地上部分提取并分析的所有基因均未显示出显著差异（P >0.05）（图4 和 图5）。然而，在暴露于反转GMF条件的植物根部中，始终观察到显著的下调表达。特别是，CAT3 的下调程度最高（图5），其次是按下调顺序排列的 APX1、FSD1、RBOHD 和 TAPX（图4）。
非生物和生物胁迫之间的交叉耐受性由参与多种生化途径的不同基因的激活所提供。RRTF1 转录因子促进这些通路基因表达的协同共激活15,31，并可能参与氧化应激过程32。因此，当清除氧气的能力下降时，预期RRTF1会表达上调。根部清除酶的下调与RRTF1的上调相关，后者是对氧化应激增强的响应机制。CAT3、APX1和TAPX在根部的显著下调表明根细胞清除H2O2的能力降低，同时伴随FSD1的下调，导致超氧阴离子歧化能力减弱。根部的氧化应激响应更强，表明根部可能是逆转的GMF感知的主要位点。
<img alt="带有环境控制装置和显示电压与电流的电气监测设备的植物生长箱。" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 地磁场补偿系统。（A）三轴线圈（每对正交轴向均包含一对八角形线圈），用于反转地磁场矢量。（B）每对亥姆霍兹线圈均连接一个计算机控制的电源。（图中所示电压为任意单位）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Plant phototropism experiment comparing control and reversal setups, illustrating growth patterns." src="/files/ftp_upload/53286/53286fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 地磁场反转对拟南芥形态的影响暴露十天后，对照组植株（即与暴露于反向地磁场条件下的植株相比，暴露于正常地磁场条件下的植株表现出显著更长的根长和更为扩展的小叶。标尺 = 18 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达柱状图；CRU3、COTP1、RRTF1；地上部分与根部；对照组与反转地磁场处理组分析。" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 地磁场反转对拟南芥基因表达的影响。经过十天处理后，提取对照组和实验组植株的总RNA，并通过实时PCR进行基因表达分析。地磁场（GMF）反转导致所有被检测基因的表达发生显著变化。CRU3，Cruciferin 3；COTP1，Copper Transport Protein1；RRTF1，Redox Responsive Transcription Factor1。柱状图中的误差线表示标准误；星号表示暴露于反转地磁场条件与正常地磁场条件下的植株之间存在显著差异（P &lt;0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="基因表达倍数变化柱状图；TAPX、APX1、FSD1、RBOHD；地上部分、根部；GMF效应研究。" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 地磁场反转对拟南芥抗氧化相关基因表达的影响。经过十天处理后，提取对照组和处理组植株的总RNA，并利用实时PCR进行基因表达分析。地磁场（GMF）反转对地上部分的基因表达未引起显著变化；然而，在反转地磁场条件下生长的植株根部中，观察到基因表达的显著下调。 TAPX，类囊体抗坏血酸过氧化物酶；APX1，抗坏血酸过氧化物酶1；FSD1，铁超氧化物歧化酶1；RbohD，NADPH/呼吸爆发氧化酶蛋白D。柱状图表示标准误差；星号表示在反转与正常地磁场条件下植株之间存在显著差异（P &lt;0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达分析，柱状图；在正常地磁场和反向地磁场条件下，CAT3 在地上部分/根部的倍数变化。" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 地磁场反转对 Arabidopsis 过氧化氢酶 3 (CAT3) 基因表达的影响。经过十天处理后，提取对照组和处理组植物的总RNA，并用于实时PCR进行基因表达分析。地磁场（GMF）反转对地上部分的基因表达未引起显著变化；然而，在反向地磁场条件下生长的植物根部中观察到基因表达显著下调。柱形图表示标准误差；星号表示暴露于反向与正常地磁场条件下的植物之间存在显著差异（P &lt;0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了一种用于检验以下假设的方法：有效地磁场（GMF）的逆转会诱导拟南芥（Arabidopsis thaliana）的差异基因表达并改变其形态。实验中采用八角形三轴赫姆霍兹线圈对系统，在植物生长室中人工产生逆转的地磁场条件。

地磁场（Gmf）与植物进化：研究地磁场反转对Arabidopsis thaliana发育和基因表达的影响

植物进化研究中最具启发性的观察之一是地磁场（GMF）倒转（或漂移）事件的发生与……之间的相关性

本实验的总体目标是利用电源控制的赫姆霍兹线圈产生地磁场（GMF）的反向环境。最终结果表明，地磁场反向会影响植物的形态结构和基因表达。该方法有助于回答植物进化领域中的一些关键问题，例如地球磁场反向是否在植物进化与适应过程中发挥了作用。该技术的主要优势在于，它可用于检测弱磁场对一种简单模式生物的潜在生物学效应，该生物可在精确控制的条件下大量重复培养。本次实验操作将由我实验室的阿尔贝托·博科（Alberto Bocco）和一名指导下的学生，以及我实验室的博士生基阿拉·阿（Kiara aa）和我团队中的副教授奇亚拉·贝尔特亚（CIA Bertea）共同演示。首先，打开连接至三组亥姆霍兹线圈对的三个直流电源，并打开三轴磁力计，其探头已插入三轴线圈中。启动计算机并运行磁力计软件，以采集来自三轴磁力计的数据。这些电源还通过A-G-P-I-B接口连接至计算机，以便进行控制。根据文本方案中的描述，调节电源电压，以产生具有反向磁场矢量的所需磁场。将拟南芥（Arabidopsis Aliana ecotype Columbia）种子置于经次氯酸钙溶液处理10至12分钟（25至28摄氏度，持续振荡）灭菌的1.5毫升离心管表面。随后用80%乙醇清洗种子两次，再用100%乙醇洗涤一次。最后，用无菌蒸馏水冲洗。根据文本方案所述，在凝固前配制一升Murrah Shiga和SCOG改良培养基。将80毫升培养基倒入每个方形培养皿中，每皿放置30粒无菌种子。然后用蜡膜密封培养板。将培养板在4°C黑暗条件下水平春化处理两天，以促进并同步萌发。春化处理结束后，通过在聚光灯上覆盖蓝色明胶膜来减少钠灯的红光成分，从而准备钠蒸气灯。准备将培养皿暴露于正常或反向的地磁场（GMF）中。在温度控制为22摄氏度的环境中，将种子垂直放置并进行暴露处理。平行实验同时在三轴线圈外部和内部进行。在8小时黑暗和16小时光照的光周期条件下培养。暴露处理后，拍摄培养皿的照片，以计算根长和叶面积。首先，测量培养皿的边长。然后在 ImageJ 软件中打开培养皿的图像，使用直线工具绘制一条恰好穿过培养皿一侧的直线。在分析菜单中，选择“设置比例尺”，在“已知距离”框中输入实际距离，然后输入长度单位。最后，点击全局选项，使根长的设置对所有测量均生效。使用手绘工具仔细沿根的轮廓进行追踪，然后通过分析菜单中的测量选项测定长度。继续测量图片中的所有根系，并保存文件以供进一步的统计分析。对于图像菜单中的叶面积，使用调整选项，随后选择颜色阈值，选中单个叶片，然后在分析菜单中选择分析颗粒，保存各个测量数据用于统计分析。分别收集30个茎和30个根，并立即用液氮速冻。然后在研钵中用液氮研磨，随后按照文中的实验方案分离总RNA；所有实验均使用含ROX作为内部参比染料的SYBR Green试剂，在实时定量系统上进行，反应体系为25 µL。使用文中列出的引物，并设置无逆转录酶对照以监测基因组DNA污染，同时设置无模板对照。每个退火和延伸阶段结束后读取荧光信号。两个放大镜代表收集的数据，包括退火和解离曲线。导航至分析和设置界面，确保已选中实验解离阶段期间收集的数据集。针对所有运行的分析，通过在热循环程序中包含解离阶段，进行 55 至 95 摄氏度的熔解曲线分析。通过结果选项卡中的解离曲线分析界面查看解离曲线图谱。使用实时PCR仪器配套软件分析所有扩增曲线。为了获得CT值，需使用最适管家基因的表达水平对相对RNA水平进行校准和归一化。通过结果标签页进入扩增曲线分析界面。在分析、选择和设置界面中，选择需要分析数据的扩增阶段（上升期或平台期）。然后从命令面板的荧光菜单中选择基线校正后的归一化荧光值。通过结果选项卡进入孔板样本值界面，以显示所选孔的CT值。使用四种不同的参考基因对实时 PCR 的结果进行标准化。利用分析软件选择排名最高的基因，并选用最稳定的基因进行标准化。简要地在 Excel 工作表中整理输入数据，第一列为基因名称，第一行为样本名称。然后从菜单栏中选择分析软件。使用对话框选择输入数据。接下来，勾选字段样本名称、基因名称，并仅选择简单输出。点击运行按钮以执行分析，选择排名最高的基因为候选基因，该基因表达最稳定。在暴露10天后，对照植物的根长显著更长，小叶展开程度更大，相比之下，暴露于反向地磁场（GMF）条件下的植物在10天暴露后表现出较小的根长和较少展开的小叶。反向地磁场（GMF）的影响导致所有检测基因的表达发生剧烈变化，包括芥子蛋白、三个铜转运蛋白基因之一以及氧化还原响应转录因子1；图中柱状图表示标准误差，星号表示暴露于反向与正常地磁场（GMF）条件下的植物之间存在显著差异。逆转地磁场（GMF）对地上部分基因表达无显著影响。然而，在根部基因表达中观察到显著的下调现象。在逆转GMF条件下，这些基因包括thal、aate过氧化物酶、aate过氧化物酶、一种铁超氧化物歧化酶、一种NADPH呼吸爆发氧化酶蛋白以及catalyst three。一旦掌握，根据实验需求，该技术可在数分钟内完成。观看本视频后，您应能充分了解如何反转或改变地磁场，并对暴露于磁场中的植物进行形态学和遗传学研究。在实施该操作过程中，重要的是移除头盔线圈所包围区域内的任何磁场源。头盔线圈及其发生器不得产生热量或振动，这一点非常重要。在最终数据记录完成之前，研究人员应处于对磁场暴露条件不知情的盲态。该技术已使磁感应领域的研究者能够探索磁场对植物进化、动物行为与导航以及人类细胞系的影响。未来，我们希望在微重力条件下开展类似研究，以评估磁场变化在太空环境中对植物生长的影响。使用产生弱磁场的系统通常被认为没有危险性。然而，您仍应采取常规预防措施，并在使用如亥姆霍兹线圈对的电源等设备前，咨询合格电工的建议。

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