用于成像免疫突触动态的内皮平面细胞模型

该技术的总体目标是利用内皮细胞作为一种新型的平面抗原呈递细胞模型，以研究基本的抗原信号传导过程。该方法有助于我们解答适应性免疫领域中的关键问题，例如免疫突触内亚细胞和分子重塑动态如何在空间和时间上协调进行。该技术的主要优势在于内皮细胞能够形成几乎平面的抗原呈递细胞表面。

这使得在生理环境复杂且具有可塑性的细胞表面背景下，能够实现最佳的时空分辨率成像。尽管本方法聚焦于CD4阳性TH1效应记忆细胞的活化研究，但也可应用于多种T细胞类型、抗原及信号转导过程的分析。今天，Chris和我将向您演示如何通过NU核转染法，将膜定位YFP和可溶性DS Red共转染至原代人肺或皮肤微血管内皮细胞，并将转染后的细胞接种至活细胞成像培养板中。

第二天，将细胞培养基更换为新鲜培养基，并添加干扰素γ，以诱导内皮细胞上MHC II类分子的表达；随后在第三天再加入20纳克/毫升的TNF-α刺激细胞24小时，持续30至60分钟。实验开始前，在37摄氏度条件下，用每毫升各含1微克的细菌超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B和中毒性休克综合征毒素-1处理内皮层。孵育期间，计数目标淋巴细胞培养物中的活细胞数量，并将2×10⁶个细胞转移至15毫升锥形管中。

接着，离心收集细胞，并将沉淀重悬于 2 毫升新鲜配制的缓冲液 A 中，确保无细胞团块残留。然后向 T 细胞样品中加入 2 微摩尔的 RA 2，盖紧管盖并立即反复倒置，使染料在细胞悬液中均匀分布。

在37摄氏度孵育30分钟后，离心标记的淋巴细胞，并用20至40微升新鲜缓冲液A轻柔而充分地重悬细胞，用于活体成像。将细胞置于显微镜系统上，打开相应的图像采集软件。设置自动多通道延时成像的适当参数，采集时间间隔为10至30秒，总时长约为20至60分钟。接下来，向物镜添加新鲜的镜油。

将含有0.5毫升缓冲液A的显微镜培养皿安装到预热至37摄氏度的加热台适配器上，并立即开启适配器。平衡2至3分钟后，使用20微升移液器将静息的负载RA的淋巴细胞加入已安装的显微镜培养皿腔室中，并启动明场成像。选择光路至目镜，使用粗调焦旋钮使物镜接触显微镜培养皿底部。

然后使用目镜和细调焦旋钮定位沉降在培养皿底部的T细胞，并利用XY轴载物台控制装置选择一个包含至少10个细胞的视野。找到合适细胞后，将光源从明场切换至荧光光源，将成像模式从IP成像切换至CCD相机。优化采集参数，随后采集静息状态下的Fura-2 340和Fura-2 380图像。

获得成功结果的关键步骤之一是仔细优化荧光采集参数，确保收集到足够的信号，并在FIRA-2的情况下，使基础的343/380比值接近于1。设定FIRA-2的曝光时间后，使用一次性移液管迅速将T细胞培养皿替换为内皮细胞的显微镜培养皿，快速移除培养基，并用1毫升预温的缓冲液A冲洗细胞一次，随后将冲洗液替换为0.5毫升新鲜的缓冲液A。使用物镜识别出荧光强且形态健康的内皮细胞视野，然后参照前述FIRA-2的设置方法，调整膜定位YFP和DS RED的采集参数。

确保每个通道的平均荧光信号强度位于检测器动态范围的25%至75%之间。在进行活细胞成像实验之前，使用自动软件单独采集内皮细胞的多组时间间隔图像，以建立基线。然后将小体积移液头插入物镜中心附近的培养基中。

缓慢地将五微升浓缩的fira和两个负载的淋巴细胞注入显微镜培养皿成像区域的中央。当淋巴细胞沉降时，精细调节焦距，以确保T细胞与内皮细胞的界面保持在焦平面上。使用40倍和63倍物镜时，每视野10至20个细胞为最佳密度。

在完成所需的观察时间后，继续成像，并立即用移液器将CIN直接加入显微镜培养皿中，使其终浓度为2 µM，以诱导最大化的钙流信号。在对细胞施加处理时，需注意保持内皮细胞顶端膜YFP标记表面的清晰聚焦，以确保免疫突触重塑过程的成像分辨率最佳。

在缺乏超抗原的情况下，内皮细胞上特异性的CD4阳性TH1淋巴细胞会迅速铺展、极化，并在内皮细胞表面进行侧向迁移。在此过程中，淋巴细胞向内皮细胞表面伸出短暂存在的突起结构，即ILP，这些突起在膜YFP荧光下表现为环状信号，类似于“足迹”。在超抗原存在时，由ILP介导的紧密细胞间接触会触发钙离子流的启动，导致免疫突触内稳定化的ILP聚集。此类ILP阵列与持续的钙信号传导相关联。

T细胞与内皮细胞相互作用过程中形成的膜荧光环对应于T细胞突出结构，这些突出结构驱动内皮细胞上离散的凹陷位点，这一点已通过荧光环在空间和动力学上与细胞质被置换和排除的区域相一致得到证实。在内皮细胞与T细胞共孵育数分钟内，在超抗原存在下，与抗原信号相关的黏附分子和信号分子在免疫突触的pota印迹和ILP中共同富集。事实上，T细胞-内皮细胞免疫突触呈现出一种离散的三维结构，其特征是T细胞ILP延伸进入抗原呈递细胞表面，并在其中富集了抗原识别的分子机制。

通过这种方法，可以克服现有抗原呈递细胞（a PC）模型中的关键障碍，从而观察到原本无法检测的三维亚细胞结构以及生理性T细胞与抗原呈递细胞界面的快速重塑。这为深入理解抗原信号传导过程提供了新的可能。