高通量斑马鱼能量消耗分析

这种基于刃天青的高通量荧光测定的总体目标是监测遗传或药理学作对 NADH2 产生的影响，NADH2 是代谢率的量度。这种方法可以帮助我们回答肥胖领域的关键问题，例如给定药物或基因对代谢率的影响。此外，该测定可用于筛选整个动物系统中潜在的药物-药物或药物-基因相互作用。

相对于耗氧量测定，该测定的主要优点是高通量和信号随时间累积，这使用户能够检测代谢率的微小差异。演示此程序的是我实验室的研究生 Caroline Foy。根据文本方案制备 60X E3 培养基储备液后，通过稀释 16.5 mL 储备液和 1 L 双蒸水制备 1X E3 培养基。

然后加入 100 微升 1% 亚甲蓝。要制作用于鸡蛋和鱼类转移的火焰抛光一次性移液器，请使用剪刀在 0.25 毫升刻度处剪下刻度的一次性转移移液器。然后，要去除粗糙的边缘，请使用本生灯对切割尖端进行火焰抛光。

设置斑马鱼过境点并收集鸡蛋后，让鸡蛋沉淀到盘子底部，然后倒掉水。使用一次性细头移液管去除任何残留的水。然后重新添加 E3 培养基。

在 28.5 摄氏度至受精后 4 天或 DPF 下孵育胚胎鱼。每天两次使用火焰抛光刻度一次性移液管去除任何未受精的卵子或死胚胎。然后每天一次倒出 E3 培养基。

使用细吸头移液管去除任何剩余的培养基，并更换为预热至 28.5 摄氏度的新鲜 E3。要进行能量消耗测定，请按照下表制备测定溶液。使用 0.22 微米过滤器过滤对溶液进行消毒，并在水浴中加热至 28.5 摄氏度进行测定。

在培养皿中，混合离合器中所有活的斑马鱼胚胎。对 75 毫升 E3 培养基进行过滤灭菌后，使用一次性细头移液管从培养皿中去除尽可能多的 E3 培养基。加回 20 毫升无菌 E3。然后取出并更换无菌 E3 两次。

接下来，使用火焰抛光的刻度塑料一次性移液管，将单个胚胎鱼转移到 96 孔板的孔中。一次使用一列板，从第一列的八个孔中取出 E3 培养基，注意不要用移液管接触胚胎。然后向每个孔中加入 300 微升测定溶液。

对板的所有 12 列重复此作。为了包括药物处理，在制备所需化合物的 100X 溶液后，向每个处理孔中加入 3 μL。然后将 3 微升载体控制添加到鱼的控制井中。

为了确保对化合物的荧光反应是鱼体内活性的结果，请在 96 孔板中对三个空白孔各设置药物和载体处理。现在，使用激发波长和发射波长分别为 530 纳米和 590 纳米的荧光读板器读取鱼板的孔。将板放入 28.5 摄氏度的加湿培养箱中。

根据测定和被测化合物的稳定性，在预定时间点再次读取荧光。为了评估荧光的相对变化，计算对照孔的荧光平均变化。然后将每个孔的荧光变化除以对照孔的平均荧光变化。

以下是使用 96 孔板的两根色谱柱的示例。A 列孔包括载体处理的对照斑马鱼，而 B 列孔包括胰岛素处理的斑马鱼。在表 A 中，显示了在时间零处测得的荧光。

表 B 包含 24 小时后测得的荧光。在表 C 中，从 24 小时的荧光中减去时间零处的荧光，以评估荧光的变化。接下来，计算对照孔中荧光的平均变化。

表 D 是每个孔的荧光变化除以对照孔的平均变化。您可以在此处看到，10 微摩尔的胰岛素处理导致斑马鱼在 24 小时内产生的信号增加了 2.77 倍，P 值小于 0.0001。如图所示，在没有胚胎的情况下，检测溶液不会改变颜色或绝对荧光水平。

然而，该测定对孔内代谢率的微小变化高度敏感。该图表示胚胎罗非鱼在孵化 24 小时后产生的信号。粉红色的井表示新陈代谢率高的鱼。

紫色井包含新陈代谢率中等的鱼，蓝色井代表低代谢率。这也显示了该测定和跨硬骨物种应用的多功能性。由于 NADH2 诱导的 alamar 蓝还原是不可逆的，因此信号会随着时间的推移而积累，从而可以放大微小的变化。

这里显示的是 1 到 5 条鱼在 1 小时、2 小时和 4 小时诱导的荧光的相对变化。随着鱼数的每次增加，荧光的相对变化随时间显著增加，鱼数越多，荧光随时间变化的幅度越大。一旦掌握，每天最多可以对 5， 000 条胚胎鱼进行这项技术。

在尝试此程序时，请务必记住小心避免伤害胚胎鱼。进行此测定后，可以执行其他程序，如中性脂质的尼罗红测量，或通过摄入荧光测定标记的草履虫来测量吞噬驱动。这使我们能够比较代谢率与脂质代谢或代谢率与吞噬驱动力之间的关系。

开发后，这项技术为能量代谢和代谢疾病领域的研究人员研究斑马鱼的能量消耗铺平了道路，而不受通量限制。看完这个视频，你应该对如何使用荧光试剂刃天青来测量斑马鱼体内 NADH2 的产生有了很好的了解。