Name: 描述了微RNA转录的转录因子依赖调节 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 了解转录因子如何通过数据挖掘、shRNA转染和生物信息学分析调控微RNA转录组。该方法整合多源数据，为研究转录因子与微RNA基因表达的相互作用提供全面框架。

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本研究由慢性淋巴细胞白血病全球研究基金会的资助支持。德克萨斯大学MD安德森癌症中心的部分支持来自美国国立卫生研究院的癌症中心支持基金（P30CA16672）。

1. 利用数据挖掘方法鉴定微小RNA基因启动子中的转录因子结合位点
<ol>
	<li>利用加州大学圣克鲁斯分校（UCSC）基因组浏览器提取作为DNA元件百科全书（ENCODE）项目一部分生成的染色质免疫沉淀（ChIP）测序数据。
	<ol>
		<li>在 UCSC 基因组浏览器中打开表格浏览器。</li>
		<li>使用以下参数提取表格：进化分支：(哺乳动物)，基因组：(人类)，组装版本：(Feb2009(GRch37/hg18))，分组：(调控)，轨迹：(TxnFactorChIP)，表格：(weEncoderesTFbsCo7steredv3)，区域：(基因组)，输出格式：(从选定表格中获取全部基因)</li>
		<li>将 1.1.2 步骤的输出结果保存为 .txt 文件，并导入电子表格中。</li>
		<li>筛选并过滤目标转录因子（例如，STAT2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基于 Baeer 可获取的 H3K4me3 表观遗传标记的 microRNA 启动子列表进行分析 等9将此列表复制到一个 .txt 文件中。</li>
	<li>根据人类基因组上的坐标进行匹配，将1.1和1.2步骤获得的数据进行比对例如，STAT3 在假定的 microRNA 启动子上的结合）并使用补充编码文件 1 中所述的 C# 代码确定中位结合亲和力。</li>
</ol>
2. 使用shRNA下调目的转录因子的表达
<ol>
	<li>将293人胚肾细胞系的1.5 × 106个细胞以约50%汇合度接种于10 cm培养皿中（使用含10%胎牛血清的DMEM培养基）。</li>
	<li>使用贴壁细胞转染试剂，按照制造商说明书，将293人胚肾细胞系细胞与5 µg含靶向目的转录因子shRNA的绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒以及5 µg包装质粒共转染。</li>
	<li>作为对照，按照制造商说明书，将293人胚肾细胞系细胞与乱序shRNA及包装质粒共转染。</li>
	<li>将转染混合物作用于细胞16小时（37 °C，CO2培养箱），然后更换为10 ml新鲜的含10% FBS的DMEM培养基。</li>
	<li>转染后48小时，离心收集细胞培养物（300 × g，5分钟），收集感染性上清液。使用0.45 µm注射器滤器（25 mm无表面活性剂醋酸纤维素膜）过滤上清液，以去除任何悬浮细胞。</li>
	<li>使用截留分子量为100 kDa的超滤离心装置浓缩上清液并收集慢病毒。在950 × g条件下离心30–60分钟，直至体积浓缩至小于250 µl。将浓缩后的病毒储存于-80 °C。</li>
	<li>使用慢病毒感染细胞。从-80 °C冰箱中取出冷冻慢病毒，室温融化。将100 µl病毒上清液转移至新的1.5 ml微量离心管中。
	<ol>
		<li>用低血清培养基将管中液体体积补至1 ml。向1 ml病毒悬液中加入六亚甲基溴化铵，终浓度为10 ng/ml，轻轻混匀后室温静置5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每进行一次转导，取5 × 106个细胞离心，轻柔地将细胞沉淀重悬于含病毒的0.5 ml培养基中。将细胞置于培养箱中孵育4–24小时，然后加入0.5 ml含20% FBS的培养基，使FBS终浓度为10%。</li>
	<li>转导后48至72小时，按照制造商说明书，用碘化丙啶（PI）和绿色荧光蛋白（GFP）对细胞进行染色。避光操作，使用流式细胞分选仪检测GFP+/PI-细胞的比例。由于PI仅染色死细胞，该比例可反映活细胞中的转染效率。</li>
	<li>如前所述10，通过流式细胞分选仪对GFP阳性细胞群体（GFP+）进行分选。</li>
	<li>如前所述10，采用Western免疫印迹法检测目标细胞（例如CLL细胞）在感染特定shRNA前后目的转录因子的表达水平。</li>
</ol>
3. 测定转染转录因子shRNA的细胞中microRNA转录组的表达水平
<ol>
	<li>根据制造商的说明书，使用商业试剂盒提取 RNA。</li>
	<li>对 RNA 进行标记，并将其与 microRNA 芯片进行杂交11。</li>
	<li>确定转染转录因子-shRNA 或空载体对照5的细胞中差异表达的 microRNA。</li>
	<li>使用实时 PCR 验证芯片结果中差异表达最显著的 microRNA5。</li>
</ol>
4. 确定生物信息学方法与shRNA方法在描述转录因子依赖性转录组方面的重叠性
<ol>
	<li>为了确定 预期 和 观察到 对启动子区含有转录因子结合位点且在转录因子-shRNA转染细胞中表达下调的microRNA基因的比例，执行以下操作：
	<ol>
		<li>从步骤1.3生成的列表中获取含有目标转录因子的基因数量与总microRNA数量的比值。该列表为 预期 比率（例如，具有STAT3结合位点的microRNA基因数 / 检测的microRNA基因总数 = 0.25）</li>
		<li>确定在3.3步骤生成的列表中，转录因子-shRNA转染细胞中表达下调的基因数量 与 含有1.3步骤中生成列表内的目的转录因子结合位点的基因数量 / 下调基因总数 观察到 比率（例如，含有STAT3结合位点的microRNA基因数/下调的microRNA总数 = 0.6）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 χ2 统计量比较上述生成的观察值与期望值比例，确定在转录因子-shRNA 转染细胞中下调的基因列表是否在其启动子区域富集有转录因子结合位点。</li>
</ol>

<ol><li>Bentwich, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hundreds+of+conserved+and+nonconserved+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs.</a> Nat Genet. 37, 766-770 (2005).</li>
<li>Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+are+highly+enriched+within+microRNA+precursor+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences.</a> Biol Direct. 6, 61(2011).</li>
<li>Rozovski, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29-3+regulates+microRNA+gene+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells.</a> Mol Cancer. 12, 50(2013).</li>
<li>Turner, M. J., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+microRNA+expression+in+C.+elegans%3A+promoting+better+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding.</a> RNA Biol. 6, 49-53 (2009).</li>
<li>Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+preferentially+target+the+genes+with+high+transcriptional+regulation+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).</li>
<li>Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34%2C+SIRT1+and+p53%3A+the+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop.</a> Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).</li>
<li>Baer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter+DNA+hypermethylation+and+hypomethylation+is+associated+with+aberrant+microRNA+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).</li>
<li>Hazan-Halevy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+is+constitutively+phosphorylated+on+serine+727+residues%2C+binds+DNA%2C+and+activates+transcription+in+CLL+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells.</a> Blood. 115, 2852-2863 (2010).</li>
<li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TARBP2+mutation+in+human+cancer+impairs+microRNA+processing+and+DICER1+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function.</a> Nat Genet. 41, 365-370 (2009).</li>
<li>Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+STAT+family+proteins%3A+lessons+from+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice.</a> Stem Cells. 17, 138-146 (1999).</li>
<li>Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+from+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+contain+signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29+1+and+STAT3+constitutively+phosphorylated+on+serine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues.</a> J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS biology. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Miranda, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pattern-based+method+for+the+identification+of+MicroRNA+binding+sites+and+their+corresponding+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes.</a> Cell. 126, 1203-1217 (2006).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489, 57-74 (2012).</li>
<li>Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+imprinted+epigenetic+modifications+of+the+human+NDN+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene.</a> Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).</li>
<li>Corcoran, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+mammalian+microRNA+promoters+emerge+from+polymerase+II+chromatin+immunoprecipitation+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data.</a> PLoS One. 4, e5279(2009).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+transcription+start+site+prediction+with+multi-objective+feature+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

依赖RNA聚合酶II的蛋白质编码基因转录机制已被广泛研究。尽管这些元件仅占人类基因组的1%至2%，但来自ENCODE项目的证据表明，人类基因组中超过80%的部分可能经历转录过程17，而调控非编码DNA元件转录的机制在很大程度上仍不清楚6。
多项研究表明，RNA 聚合酶 II（Pol II）还负责转录一些非蛋白质编码基因，包括微小 RNA（microRNAs）6，这促使我们开发了一种策略，整合公共可用资源的数据、计算算法以及体外（in vitro）研究，以解析特定转录因子在调控 microRNA 转录中的潜在功能。本文所提出的策略包括两个关键步骤。第一步，我们利用公共可获取的数据来鉴定转录因子在 microRNA 启动子区域的结合情况。为此，我们采用 ENCODE 联合体发布的 ChIP-seq 数据，识别转录因子的结合位点以及表征启动子的表观遗传标记，作为 microRNA 启动子的间接标志。通过整合这些数据集的基因组坐标，可大致估算出特定转录因子结合于 microRNA 启动子的频率。第二步，利用...

microRNA 是内源性的小分子非编码调控 RNA，通常在转录后水平上作为 mRNA 表达的负调控因子发挥作用。人类基因组中已发现约 1,000 种长度为 20 至 25 个核苷酸的非编码 microRNA1,2。microRNA 通过其种子序列（seed sequence）与靶 mRNA 3' 非翻译区（UTR）中互补的种子匹配序列之间的经典碱基配对来调控基因表达。总体而言，microRNA 调控超过 30% 的蛋白质编码基因3，但目前对 microRNA 从 DNA 转录的机制仍知之甚少。有研究认为，microRNA 转录的调控机制与 mRNA 相似4,5。特别是，类似于转录因子在促进蛋白质编码基因转录中的作用，它们也被认为可激活 microRNA 的转录6。转录因子与 microRNA 之间的相互作用已被报道为基因表达的调节因子7，并可能形成反馈环路和前馈环路。例如，Yamakuchi et al. 报道了一个反馈环路：p53 诱导 microRNA34a 的表达，而 microRNA34a 进而抑制 p53 抑制剂 SIRT 的翻译，从而增强 p53 的活性8。
尽管已有转录因子依赖性调控microRNA表达的具体实例报道，但目前尚缺乏一种被广泛接受的方法来系统揭示特定转录因子如何调控microRNA转录组的表达。本文所提出的实验方案旨在深入描述转录因子依赖性调控microRNA转录组的机制。通过整合公开可用的数据、生物信息学工具并结合微阵列技术，研究人员依据本方案可从基因组水平全面解析任意感兴趣转录因子在特定细胞类型中对microRNA转录组表达的调控作用，并进一步探究转录因子-mRNA在调控microRNA表达中的潜在贡献。

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>截留分子量为 100&amp;nbsp;kDa 的 Amicon 超滤离心滤器</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Life Tachnologies (Invitrogen)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>人 293 细胞系</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85120602</td><td></td></tr></tbody></table>

描述转录因子依赖性调控microrna转录组

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

尽管蛋白质编码基因的转录调控已被广泛研究，但转录因子如何参与非编码RNA（特别是microRNA）转录的过程仍知之甚少。本文提出一种策略，利用公开可用的数据、计算资源和高通量数据，研究转录因子在调控microRNA转录中的潜在作用。我们采用H3K4me3表观遗传标记来鉴定microRNA的启动子区域，并利用ENCODE项目中的染色质免疫沉淀测序（ChIP-sequencing）数据，识别富含转录因子结合位点的microRNA启动子。通过使用靶向特定转录因子的shRNA转染目标细胞，并对细胞进行microRNA芯片分析，研究该转录因子对microRNA转录组的影响。作为示例，我们引用了关于STAT3对慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中microRNA转录组影响的研究。

STAT3 是一种转录因子，通常可诱导具有抗凋亡和促增殖作用的基因转录12。目前尚不清楚 STAT3 是否也影响非编码 RNA 转录组。在所有慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中，STAT3 在丝氨酸 707 位点发生持续性磷酸化10,13。磷酸化丝氨酸的 STAT3 转运至细胞核，结合 DNA，并激活在其他细胞类型中已知由酪氨酸磷酸化 STAT3 激活的基因10。由于 CLL 的特征是 microRNA 网络的全局性失调14，我们推测丝氨酸磷酸化 STAT3 的存在会影响 CLL 细胞中 microRNA 的表达。
为了验证这一假设，需要鉴定出含有STAT3结合位点的microRNA启动子。通过整合Baer et al. 9 提供的H2K4me3组蛋白修饰区域数据（该修饰特征性地标记启动子区域）与ChIP-seq实验鉴定出的S...

本文提出一种策略，利用公共可获取的数据、计算资源以及在转染靶向特定转录因子的小发夹（sh）RNA后通过microRNA芯片获得的高通量数据，研究该转录因子对microRNA转录组的影响。

描述转录因子依赖性调控microRNA转录组

尽管蛋白质编码基因的转录调控已被广泛研究，但转录因子如何参与……的机制仍知之甚少

本方法学的总体目标是描述一个感兴趣的转录因子如何调控microRNA转录组。该方法有助于回答一个关键科学问题：调控蛋白编码基因转录的转录因子是否也参与microRNA的转录调控。该方法学的主要优势在于，它整合了数据挖掘、实验数据和生物信息学分析，从而全面描述依赖于特定转录因子活性的microRNA基因转录情况。尽管该方法可揭示 microRNA 基因转录与转录因子活性状态之间的相互作用，但需注意此方法属于描述性方法，此类关联的确认应通过其他实验进一步验证。首先，打开基因组浏览器（例如加州大学圣克鲁兹分校基因组浏览器），以提取染色质免疫沉淀测序数据。进入网站后，点击顶部菜单，选择“Tools”（工具），然后打开“Table Browser”（表格浏览器）。按照此处所示规格，将其输入相应的框中，然后选择“获取输出”以提取表格。将输出结果保存为文本文件，然后将该文件导入电子表格中。在电子表格程序中，对名称列进行排序，并筛选目标转录因子（例如 STAT2）。然后，根据 H3K4me3 表观遗传标记复制 microRNA 启动子的列表，并将该列表粘贴到一个 txt 文件中。接着，使用补充数据文件中提供的 SQL 编写的补充代码，对收集的数据进行映射，并确定中位结合亲和力。首先，将150万个HEK293细胞接种至一个10厘米培养皿中，并加入含10% FBS的DMEM培养基。培养细胞24小时，直至细胞汇合度达到约50%。接着，更换培养基。随后，根据生产商说明书，加入转导试剂，并加入5 µg含有靶向shRNA的绿色荧光蛋白慢病毒以及5 µg包装载体。作为对照，使用乱序shRNA和包装载体对另一块相同的细胞培养板进行转导。将转导混合物与细胞共同孵育16小时，然后更换培养基为10 mL新鲜DMEM培养基，添加10% FBS。转染后48小时，移除细胞培养基。随后离心5分钟以收集感染性上清液。使用0.45微米注射器滤器过滤上清液，去除任何悬浮细胞。接着，将培养基加入截留分子量为100千道尔顿的超滤离心过滤装置中。离心浓缩慢病毒，直至体积小于250微升。将剩余液体转移至冻存管中，并在-80摄氏度保存浓缩后的病毒，直至后续使用。准备继续操作时，从-80 °C冰箱中取出冷冻的慢病毒，将冻存管置于室温下解冻。取100 µL病毒上清液转移至新的1.5 mL离心管中，并加入900 µL无血清培养基。随后，向1 mL病毒悬液中加入10 ng/mL的六亚甲基溴化物（hexadimethrine bromide）。轻轻混匀试管，室温静置五分钟。按每个预定转导反应收集五百万细胞，然后将细胞沉淀轻轻重悬于含有病毒的0.5毫升培养基中。将细胞转移至12孔板，孵育四至24小时。然后，加入额外的 0.5 毫升含 20% FBS 的培养基。在转导后 48 至 72 小时，收集细胞，并根据制造商说明书用碘化丙啶进行染色。染色后，避光保护细胞，并通过检测 GFP 阳性、碘化丙啶阴性细胞的比例，利用流式细胞术评估转导效率。然后，收集分选后的GFP阳性细胞群体并提取其蛋白质。最后，通过蛋白质印迹法检测感染指定shRNA前后靶向转录因子的表达水平。在用STAT3 shRNA转导CLL细胞后，STAT3 mRNA和STAT3蛋白的水平均显著降低。此外，对CLL细胞进行的microRNA芯片分析显示，有23个microRNA在转染STAT3 shRNA的CLL细胞与转染空载体的CLL细胞之间的表达水平存在显著差异。通过定量RT-PCR验证了其中七个基因的结果，如图所示。在此基础上，可进一步采用染色质免疫沉淀、电泳迁移率变动分析以及差异分析等方法，以验证该转录因子是否结合并激活特定mirror基因的启动子区域。观看本视频后，您应该能够充分理解如何整合生物信息学分析、公开可用的数据以及利用shRNA技术沉默转录因子，以研究该转录因子如何调控microRNA基因的表达。

describing-transcription-factor-dependent-regulation-microrna

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生物工程

描述了微RNA转录的转录因子依赖调节

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microRNA（miRNA）是基因表达的重要调控因子，已被证明在多种生物学过程中发挥作用。为了更深入地理解miRNA与非翻译区（UTR）之间的相互作用，我们构建了一个全基因组范围的3'...

利用3'非翻译区报告基因构建体和microRNA模拟物在贴壁细胞中使用LightSwitch荧光素酶检测系统鉴定人类microRNA靶标

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凝血因子VIII在脂质纳米管上的螺旋状排列

本文介绍了制备囊泡、包封转录与翻译系统以及监测蛋白质生成的简单方法。所获得的无细胞体系可作为构建日益复杂的细胞模拟物的起点。...

无细胞转录与翻译体系在囊泡中的封装用于构建细胞模拟物

了解转录因子如何通过数据挖掘、shRNA转染和生物信息学分析调控微RNA转录组。该方法整合多源数据，为研究转录因子与微RNA基因表达的相互作用提供全面框架。

描述转录因子依赖性调控microRNA转录组

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