Name: 体外试验来测量磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T13:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学习利用利什曼原虫细胞提取物定量测定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活性的体外实验方法。该技术无需纯化酶即可直接测量全细胞提取物中的PEMT活性，为研究寄生虫脂质代谢及磷脂酰胆碱生物合成提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 ARRA RO3 AI078145 和 1SC3GM113743，授予 RZ。

1. 细胞提取物制备
<ol>
	<li>在26 ºC条件下，将Leishmania细胞培养于带有密封盖的无菌塑料瓶中，培养基为添加了20 mM HEPES（pH 7.4）、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素、5 µg/ml血红素、0.35 g/L NaCO2H、0.1 mM腺嘌呤和2 µg/ml生物蝶呤的1× M199培养基，不进行振荡。当细胞密度达到1–2 × 107/ml时，在4 ºC下以1,500 g离心5分钟收集细胞。</li>
	<li>用移液器弃去上清液，并用血清学移液管将细胞沉淀重悬于相当于原培养液体积一半的冰冷磷酸盐缓冲液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4，pH 7.4）中进行洗涤。根据生物安全二级（BL2）指南处理细胞上清液。</li>
	<li>再次在4 ºC下以1,500 g离心5分钟。用移液器弃去上清液。立即进行下一步操作，或将细胞沉淀在液氮中速冻，于-80 ºC长期保存（最长三个月）。</li>
	<li>配制2×裂解缓冲液（0.5 M蔗糖、0.1 M TrisHCl，pH 7.5、2 mM EDTA和2×蛋白酶抑制剂混合物），并在冰上置于4 ºC保存。</li>
	<li>将细胞沉淀（新鲜或冻存）用等体积的2×裂解缓冲液重悬。加入等体积的玻璃珠，在4 ºC下剧烈涡旋振荡10分钟。</li>
	<li>加入两倍体积的1×裂解缓冲液并混匀。在4 ºC下以1,500 × g离心10分钟，使未破裂的细胞和细胞核形成沉淀。</li>
	<li>用移液器将上清液转移至新的预冷离心管中，并将细胞提取物置于冰上，直至实验完成。</li>
</ol>
2. 使用蛋白定量试剂盒（如二辛可宁酸法）测定细胞提取物的蛋白浓度
<ol>
	<li>按体积比49:1混合BCA溶液与硫酸铜（II），配制二辛可宁酸（BCA）工作液（每管1 ml）。</li>
	<li>将10 mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）储备液用BCA工作液稀释，配制成0、10、20、30、40、50和60 µg/ml的蛋白标准品，每份体积为1 ml。</li>
	<li>取2 µl细胞裂解物，加入1 ml BCA工作液中，每个样品设两个复孔。将标准品和待测蛋白样品置于预热至60 °C的水浴中孵育10分钟。</li>
	<li>将样品转移至冰上冷却3分钟，使用分光光度计在562 nm波长下测定标准品和蛋白样品的吸光度。</li>
	<li>参照试剂盒说明书，以BSA标准曲线为对照计算细胞裂解物的蛋白浓度，并用1×裂解缓冲液将细胞裂解物稀释至蛋白浓度为10 mg/ml。</li>
</ol>
3. 每管200 μl的酶学检测
注意：以下步骤需在化学通风橱中进行。
<ol>
	<li>在15 ml锥形管中，每个样品设置两个重复。每管准备20 μl 1 M TrisHCl（pH 7.5），并置于冰上。每管在室温下准备2 ml氯仿/甲醇（1:1（v/v）；终止溶液）。</li>
	<li>在冰上，向每个15 ml锥形管中加入20 μl 1 M TrisHCl（pH 7.5）。</li>
	<li>从此步骤起遵循放射性安全操作规范。每管加入等效于0.06 μM（0.2 μCi）S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine 和50 μM非放射性SAM，使SAM总浓度为50.06 μM。每管加入x μl冷蒸馏水，其中x = 200 -（20（缓冲液）+ 20（细胞提取物）+ 非放射性与放射性SAM的总体积）。</li>
	<li>将每根锥形管转移至预热至30 ºC的水浴中。向每管加入20 μl细胞提取物（相当于200 μg蛋白），以启动反应。孵育所需时间（0至45分钟）。</li>
	<li>通过向每管加入2 ml氯仿/甲醇（1:1；v/v；终止溶液）终止反应。将锥形管转移至室温（20–25 ºC）。</li>
</ol>
4. 脂质提取
注意：以下步骤需在化学通风橱中进行。
<ol>
	<li>向含有酶促反应样品的每个试管中加入 700 μl 水。剧烈涡旋振荡 30 秒。室温下以 1,500 × g 离心 5 分钟，以分离有机相和水相。</li>
	<li>用移液管将下层有机相转移至新的15 ml锥形管中。向每管中加入1 ml水 &#34;下相&#34; 将含有样品的离心管剧烈涡旋振荡30秒。再次以1,500 × g离心5分钟，以分离有机相与水相。</li>
	<li>用移液管将下层有机相转移至闪烁瓶中。在氮气流下干燥样品。2按照放射性物质处理规范，处置含有未掺入的放射性SAM及放射性锥形管的水相。</li>
	<li>每管加入 2 ml 闪烁液。根据制造商说明书和仪器使用指南，用闪烁计数器测定掺入的放射活性。</li>
	<li>使用以下通用公式计算酶活性（单位：nmol/mg 蛋白）： 
	cpm 值 × 103 x [SAM 总浓度（放射性与非放射性，mM）] x 5 放射性 SAM 的比活性（Ci/mmol）x [放射性 SAM 浓度（mM）] 
	注意：上述方案可根据S-腺苷甲硫氨酸（SAM）浓度依赖性或蛋白质依赖性PEMT酶活性测定的需要进行调整。对于SAM浓度依赖性酶学测定，反应时间保持恒定（15分钟，处于线性范围），并在反应体系中加入不同量的非放射性SAM；而对于蛋白质依赖性PEMT测定，则保持SAM浓度（我们选用0.05 mM）和反应时间（15分钟）恒定。此外，若某些PEMT酶具有不同的最适pH值，可依据需要调整缓冲液的pH。</li>
</ol>

<ol><li>Keogh, M. R., Courtney, P. D., Kinney, A. J., Dewey, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+phospholipid+N-.methyltransferases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of phospholipid N-.methyltransferases from Arabidopsis and soybean.</a> J Biol Chem. 284 (23), 15439-15447 (2009).</li>
<li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim Biophys Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+lipogenesis+in+white+adipose+tissue+contributes+to+the+resistance+to+high+fat+diet-induced+obesity+in+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Decreased lipogenesis in white adipose tissue contributes to the resistance to high fat diet-induced obesity in phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-deficient mice.</a> Biochim Biophys Acta. 1851 (2), 152-162 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+alters+plasma+VLDL+phospholipids+and+attenuates+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase alters plasma VLDL phospholipids and attenuates atherosclerosis in mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (9), 1349-1355 (2009).</li>
<li>Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+methylation+in+mammals%3A+from+biochemistry+to+physiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipid methylation in mammals: from biochemistry to physiological function.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (6), 1477-1487 (2014).</li>
<li>Nishimaki-Mogami, T., Suzuki, K., Takahashi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+phosphatidylethanolamine+methylation+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins+by+cultured+rat+hepatocytes%3A+rapid+inhibition+of+phosphatidylethanolamine+methylation+by+bezafibrate+increases+the+density+of+apolipoprotein+B48-containing+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of phosphatidylethanolamine methylation in the secretion of very low density lipoproteins by cultured rat hepatocytes: rapid inhibition of phosphatidylethanolamine methylation by bezafibrate increases the density of apolipoprotein B48-containing lipoproteins.</a> Biochim Biophys Acta. 1304 (1), 21-31 (1996).</li>
<li>Noga, A. A., Zhao, Y., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+requirement+for+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An unexpected requirement for phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase in the secretion of very low density lipoproteins.</a> J Biol Chem. 277 (44), 42358-42365 (2002).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+repression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+%28PEMT%29+in+BRCA1-mutated+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Epigenetic repression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase (PEMT) in BRCA1-mutated breast cancer.</a> Oncotarget. 5 (5), 1315-1325 (2014).</li>
<li>Cui, Z., Houweling, M., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+rat+hepatoma+cell+growth+by+expression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of rat hepatoma cell growth by expression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-2.</a> J Biol Chem. 269 (40), 24531-24533 (1994).</li>
<li>Cui, Z., Shen, Y. J., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+correlation+between+expression+of+phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2+and+growth+rate+of+perinatal+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Inverse correlation between expression of phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2 and growth rate of perinatal rat livers.</a> Biochim Biophys Acta. 1346 (1), 10-16 (1997).</li>
<li>Minder, A. C., de Rudder, K. E., Narberhaus, F., Fischer, H. M., Hennecke, H., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+levels+in.Bradyrhizobium+japonicum.+membranes+are+critical+for+an+efficient+symbiosis+with+the+soybean+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine levels in.Bradyrhizobium japonicum. membranes are critical for an efficient symbiosis with the soybean host plant.</a> Mol Microbiol. 39 (5), 1186-1198 (2001).</li>
<li>Kodaki, T., Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+phosphatidylethanolamine+methylation+pathway.+Cloning+and+characterization+of+two+distinct+methyltransferase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast phosphatidylethanolamine methylation pathway. Cloning and characterization of two distinct methyltransferase genes.</a> J Biol Chem. 262 (32), 15428-15435 (1987).</li>
<li>Tanaka, Y., Amano, F., Maeda, M., Nishijima, M., Akamatsu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine+N-.methyltransferase%2C+the+enzyme+catalyzing+the+second+and+the+third+steps+in+the+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+system%2C+from+mouse+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Med+Sci+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine N-.methyltransferase, the enzyme catalyzing the second and the third steps in the phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase system, from mouse liver microsomes.</a> Jpn J Med Sci Biol. 43 (3), 59-73 (1990).</li>
<li>Bibis, S. S., Dahlstrom, K., Zhu, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Leishmania+major+phosphatidylethanolamine+methyltransferases+LmjPEM1+and+LmjPEM2+and+their+inhibition+by+choline+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Leishmania major phosphatidylethanolamine methyltransferases LmjPEM1 and LmjPEM2 and their inhibition by choline analogs.</a> Mol Biochem Parasitol. 196 (2), 90-99 (2014).</li>
<li>deRudder, K. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+meliloti.+mutants+deficient+in+phospholipid+N-.methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rhizobium meliloti. mutants deficient in phospholipid N-.methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J Bacteriol. 179 (22), 6921-6928 (1997).</li>
<li>Aktas, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+the+enzyme+properties+of+the+phospholipid+N-.methyltransferase+PmtA+from+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of the enzyme properties of the phospholipid N-.methyltransferase PmtA from Agrobacterium tumefaciens.</a> J Bacteriol. 191 (7), 2033-2041 (2009).</li>
<li>Ridgway, N. D., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase from rat liver.</a> Methods Enzymol. 209, 366-374 (1992).</li>
<li>Gaynor, P. M., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+methyltransferase+and+phospholipid+methyltransferase+activities+from+Saccharomyces+cerevisiae.+Enzymological+and+kinetic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine methyltransferase and phospholipid methyltransferase activities from Saccharomyces cerevisiae. Enzymological and kinetic properties.</a> Biochim Biophys Acta. 1045 (2), 156-163 (1990).</li>
<li>Arondel, V., Benning, C., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+expression+in+Escherichia+coli.+of+a+gene+encoding+phosphatidylethanolamine+methyltransferase+%28EC+2.1.1.17%29+from+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional expression in Escherichia coli. of a gene encoding phosphatidylethanolamine methyltransferase (EC 2.1.1.17) from Rhodobacter sphaeroides.</a> J Biol Chem. 268 (21), 16002-16008 (1993).</li>
<li>Wessel, M., Klusener, S., Godeke, J., Fritz, C., Hacker, S., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Agrobacterium+tumefaciens.+requires+phosphatidylcholine+in+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Virulence of Agrobacterium tumefaciens. requires phosphatidylcholine in the bacterial membrane.</a> Mol Microbiol. 62 (3), 906-915 (2006).</li>
<li>Klusener, S., Aktas, M., Thormann, K. M., Wessel, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+physiological+relevance+of+Agrobacterium+tumefaciens.+phosphatidylcholine+biosynthesis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Expression and physiological relevance of Agrobacterium tumefaciens. phosphatidylcholine biosynthesis genes.</a> J Bacteriol. 191 (1), 365-374 (2009).</li>
<li>Henderson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+encoding+Leishmania+donovani.S.-adenosylhomocysteine+hydrolase%2C+a+potential+target+for+antiparasitic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene encoding Leishmania donovani.S.-adenosylhomocysteine hydrolase, a potential target for antiparasitic chemotherapy.</a> Mol Biochem Parasitol. 53 (1-2), 169-183 (1992).</li>
<li>Koszalka, G. W., Krenitsky, T. A. 5'-Methylthioadenosine (MTA) phosphorylase from promastigote of Leishmania donovani. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoszalka%2C+GW+%22Purine+and+Pyrimidine+Metabolism+in+Man+V%2C+Adv+Exp+Med+Biol%22">Purine and Pyrimidine Metabolism in Man V, Adv Exp Med Biol</a>. Nyhan, W. L., Thompson, L. F., Watts, R. W. E. 131, Springer US. 559-563 (1986).</li>
<li>Biastoff, S., Teuber, M., Zhou, Z. S., Dräger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+activity+measurement+of+a+recombinant+putrescine+N.-methyltransferase+from+Datura+stramonium%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Med%22%5BJournal%5D)">Colorimetric activity measurement of a recombinant putrescine N.-methyltransferase from Datura stramonium.</a> Planta Med. 72 (12), 1136-1141 (2006).</li>
<li>Hendricks, C. L., Ross, J. R., Pichersky, E., Noel, J. P., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+colorimetric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled colorimetric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 326 (1), 100-105 (2004).</li>
<li>Cannon, L. M., Butler, F. N., Wan, W., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereospecific+colorimetric+assay+for+%28S.%2CS.%29-adenosylmethionine+quantification+based+on+thiopurine+methyltransferase-catalyzed+thiol+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A stereospecific colorimetric assay for (S.,S.)-adenosylmethionine quantification based on thiopurine methyltransferase-catalyzed thiol methylation.</a> Anal Biochem. 308 (2), 358-363 (2002).</li>
<li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S.-adenosyl-L-methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S.-adenosyl-L-methionine.</a> Biochemistry. 25 (15), 4444-4449 (1986).</li>
<li>Wu, S. E., Huskey, W. P., Borchardt, R. T., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+instability+at+sulfur+of+S.-adenosylmethionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chiral instability at sulfur of S.-adenosylmethionine.</a> Biochemistry. 22 (12), 2828-2832 (1983).</li>
<li>Dorgan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 350 (2), 249-255 (2006).</li>
</ol>

这种简单快速的PEMT检测方法利用全细胞裂解物作为蛋白质来源，通过将放射性甲基基团从SAM转移至PE，实现对甲基化形式PE的定量分析。该方法快速、灵敏、可重复，同样适用于纯化的酶 17如果目标甲基转移酶对单甲基-磷脂酰乙醇胺（monomethyl-PE）或二甲基-磷脂酰乙醇胺（dimethyl-PE）具有底物特异性，而非对磷脂酰乙醇胺（PE）本身，则可在检测中添加单甲基-PE或二甲基-PE。 12,13,18,19若使用纯化的PEMT酶，可在测定中添加PE。本方案的一个局限性在于无法鉴定反应产物（单甲基-PE、二甲基-PE或PC）。然而，反应产物（单甲基-PE、二甲基-PE、PC）的身份可通过一维薄层色谱进一步分析，具体方法如所述。 20,21此外，一些SAM的降解产物，例如 S-S-腺苷高半胱氨酸和5'-甲硫基腺苷可能通过反馈抑制来抑制PEMT活性。然而， 利什曼原虫 具有一个 SS-腺苷同型半胱氨酸水解酶 22，可切割 S-腺苷同型半胱氨酸转化为腺嘌呤和 S...

磷脂酰乙醇胺甲基转移酶（PEMT）催化一个或多个甲基从甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）共价连接到磷脂酰乙醇胺（PE）、单甲基-PE 或二甲基-PE 上，生成单甲基-PE、二甲基-PE 和/或磷脂酰胆碱（PC）。这类酶几乎普遍存在于动物细胞和真菌中。此外，它们也存在于某些植物1以及约10%的细菌中，尤其是那些与真核生物相互作用的细菌2。
PEMT不仅通过参与磷脂酰胆碱（PC）的合成而与细胞生物学密切相关——PC是动物细胞中的主要脂质类别，同时还具有其他重要的细胞功能。在哺乳动物中，PEMT主要在肝脏中表达，对于极低密度脂蛋白的正常分泌至关重要，并且还参与饮食诱导的肥胖3、动脉粥样硬化4以及胰岛素抵抗5。此外，哺乳动物的PEMT也在脂肪细胞中表达，尽管表达水平较低，但仍参与脂肪沉积6,7。PEMT在癌症发生8、细胞凋亡9和细胞生长10中的作用也已有报道。在细菌中，PEMT酶已被证明对正常细胞生长2、毒力2以及与宿主植物的共生关系11具有重要作用。
本实验方案的目标和原理是从全细胞提取物中直接测定PEMT活性，而无需纯化该酶。目前已开发出两种不同的方法来测定PEMT活性。第一种也是最常用的方法是通过检测放射性标记的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）中的氚标记甲基基团转移至磷脂酰乙醇胺（PE）的量来测定，这也是本文的主题。该方法最初是为测定酵母中的PEMT活性而开发的 12 和哺乳动物细胞（肝脏） 13 以了解这些细胞中磷脂酰胆碱（PC）的生物合成过程，并确定这些酶的特异性。此后，该技术已被应用于其他细胞类型，例如细菌。 2 （尽管使用基础pH值进行检测） 15以及原生动物寄生虫 14该技术可用于全细胞提取物以及纯化酶，并可潜在地应用于任何细胞提取物系统。此外，还设计了一种非放射性检测方法，该方法依赖于对产物的酶法定量分析 S-腺苷同型半胱氨酸，SAM的转甲基化产物 16后者检测方法可能更为便捷，因其不涉及放射性，但仅适用于纯化的酶。

<table><tbody><tr><td>S-[甲基-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]腺苷-L-蛋氨酸（比活度为 5–15 Ci/mmol）</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155050UC</td><td>分装试剂并于 -20 &amp;deg;C 冻存；使用该试剂时需遵循放射性安全操作规范</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche Life Sciences</td><td>11836170001</td><td>新鲜配制稀释液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>玻璃珠，酸洗，425–600 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>双辛可宁酸溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铜（II）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2284</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta2 单检测器闪烁计数仪</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>2450-0010</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计 Biomate 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>840208300</td><td></td></tr><tr><td>BSA 储存液（10 mg/ml）</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>闪烁液&amp;nbsp;</td><td>Research Product International Corp</td><td>111198</td><td></td></tr><tr><td>S-(5'-腺苷基)-L-蛋氨酸氯化物（盐酸盐）&amp;nbsp;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13956</td><td>用 20 mM HCl 稀释试剂，并将分装样品于 -80 &amp;deg;C 冻存&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

体外测定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活性的实验方法

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

磷脂酰乙醇胺甲基转移酶是一类生物合成酶，可催化将甲基从 S-腺苷-L-甲硫氨酸转移至磷脂酰乙醇胺、单甲基磷脂酰乙醇胺或二甲基磷脂酰乙醇胺，生成单甲基磷脂酰乙醇胺、二甲基磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。这类酶普遍存在于动物细胞和真菌中，也见于约10%的细菌中。除在脂质代谢中的直接作用外，它们还在胰岛素抵抗、糖尿病、动脉粥样硬化、细胞生长或毒力等细胞生理过程中发挥多种重要功能。本文报告了一种简单的无细胞酶学检测方法，利用全细胞提取物作为酶源，通过检测氚标记的甲基从S-[甲基-3H]腺苷-L-甲硫氨酸转移至磷脂酰乙醇胺的过程来测定酶活性。反应生成的甲基化磷脂酰乙醇胺具有疏水性，因此可通过有机溶剂萃取将其与水溶性的S-[甲基-3H]腺苷-L-甲硫氨酸分离。该方法原则上可适用于其他各类细胞，并可用于筛选针对特定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶的抑制剂或药物，而无需预先纯化该酶。

图1显示了一个时间依赖性的PEMT测定，该测定以Leishmania全细胞提取物作为酶源，以内源性PE作为底物进行。通过闪烁计数法对有机相中的放射性进行了定量。所得数据用于计算转移到PE上的氚标记甲基基团的量。PEMT活性在约20分钟内呈线性增长，随后在约30分钟时达到平台期，并在此后保持恒定约15分钟。如预期所示，在未添加细胞提取物的测定中未检测到PEMT活性（图2）。此外，在存在100 μM十八烷基三甲基溴化铵（一种L. major PE甲基转移酶LmjPEM1和LmjPEM2的抑制剂14）的情况下，该活性被完全抑制。PEMT活性还依赖于蛋白浓度，且与酶学测定中所用蛋白量呈线性正比关系（图3）。最后，进行了S-腺苷甲硫氨酸（SAM）浓度依赖性PEMT测定，测试了不同浓度的SAM（图4）。当SAM浓度达到约0.5 mM时，PEMT活性趋于饱和。...

本报告描述了一种 体外 使用酶法测定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活性 利什曼原虫 细胞提取物。该实验基于放射性甲基从 S-[甲基-3H]腺苷-L-甲硫氨酸转移至内源性磷脂酰乙醇胺。

磷脂酰乙醇胺甲基转移酶是一类生物合成酶，可催化将一个或多个甲基从……转移

本方法的总体目标是从全细胞提取物中定量磷脂酰乙醇胺甲基转移酶（PEMT）的活性。通过该方法，我们能够回答脂质代谢领域中的一些关键问题，例如磷脂酰乙醇胺甲基转移酶在磷脂酰胆碱生物合成中的重要性。本方案的主要优势在于，可直接利用全细胞提取物进行检测，无需对酶进行纯化。因此，该实验方案可为了解寄生虫如何合成其最丰富的脂质——磷脂酰胆碱提供一定见解。该方案也可应用于其他细胞类型，如哺乳动物细胞和细菌。在26°C条件下，将利什曼原虫细胞培养于补充了添加剂的M199培养基中，使用无菌塑料瓶并以密封盖封闭，静置培养。在4 °C条件下，以1500 × g离心5分钟收集细胞。当细胞密度达到每毫升1000万至2000万个细胞时进行操作。用移液器吸除上清液后，用半倍培养体积的冷磷酸盐缓冲液通过血清学移液管重悬细胞沉淀，以洗涤细胞。在4 °C条件下，以1550 × g离心细胞5分钟。用移液器弃去上清液。继续进行下一步操作，或将细胞沉淀在液氮中速冻，于-80 °C长期保存。接着，将细胞沉淀重悬于等体积的2倍裂解缓冲液中。加入1倍体积的玻璃珠，在4摄氏度下剧烈涡旋震荡10分钟。再加入2倍体积的1倍裂解缓冲液并混匀。然后在4°C条件下以1500×g离心细胞裂解物10分钟，以沉淀未破碎的细胞和细胞核。用移液器将上清液转移至新的预冷离心管中，并将细胞裂解物置于冰上直至实验结束。取2 µL细胞裂解物加入1 mL双辛可宁酸溶液中，重复一份。 将标准品和蛋白质样品在预热至60摄氏度的水浴中孵育10分钟。将样品转移至冰上放置3分钟。使用分光光度计在562纳米波长下测定标准品和蛋白质样品的吸光度。根据制造商说明书，使用牛血清白蛋白标准品作为参考，测定细胞裂解物的蛋白浓度。用1×裂解缓冲液将细胞裂解物稀释至蛋白浓度为10毫克/毫升。在化学通风橱中，于15毫升锥形管中对每个样品及其重复样进行检测。每管准备 20 µL 1 M TrisHCl（pH 7.5），置于冰上。另为每管在室温下准备 2 mL 氯仿-甲醇终止液。将 20 µL 1 M TrisHCl 加入预置于冰上的每个 15 mL 尖底管中。然后根据辐射安全指南，每管加入相当于0.06 µM的氚标记SAM和50 µM的非标记SAM，SAM总量为50.06 µM。此时，每管加入根据文本方案计算好的非标记水体积。将每个锥形管转移至预热至30 °C的水浴中。向每个试管中加入 20 微升细胞提取物以启动反应。将样品孵育所需时间。通过向每个试管中加入 2 毫升氯仿-甲醇来终止反应。将锥形管转移至室温。在化学通风橱中，向每支含有酶促反应样品的试管中加入700微升水。剧烈涡旋振荡30秒。然后在室温下以1500×g离心五分钟，以分离有机相和水相。在转移下层相时，关键是要避免吸入任何水相，否则会影响检测结果的计算。使用移液器将下层有机相转移至新的15毫升锥形管中。向每个含有下层相的离心管中加入一毫升水，剧烈涡旋振荡30秒。然后，在1500×g条件下再次离心5分钟，以分离有机相和水相。用移液器将下层有机相转移至闪烁计数管中。在氮气流下干燥样品。根据放射性物质处理指南，处置含有未掺入的放射性 SAM 及放射性锥形管的水相。随后，每管加入 2 毫升闪烁液。根据制造商的说明书和所用仪器，使用闪烁计数器测量掺入的放射活性，并利用文本方案中列出的公式计算酶活性，单位为每毫克蛋白的纳摩尔数。图中显示的是利用利什曼原虫全细胞提取物作为酶源、以内源性磷脂酰乙醇胺作为底物进行的时间依赖性 PEMT 测定。通过闪烁计数法测定有机相中的放射性量，并用于计算转移至磷脂酰乙醇胺（PE）上的氚标记甲基基团的量。PEMT 活性在约 20 分钟内呈线性增加，随后在约 30 分钟时达到平台期，并在此后保持恒定达 15 分钟。与预期一致，当未添加细胞提取物时未检测到 PEMT 活性，而在检测体系中加入细胞提取物后则可检测到该活性。此外，在存在100微摩尔十六烷基三甲基溴化铵的情况下，该活性被完全抑制，该化合物是利什曼原虫主要磷脂酰乙醇胺甲基转移酶LMJ PEM One和LMJ PEM two的特异性抑制剂。PEMT活性也依赖于蛋白浓度，且该活性与酶学测定中所用蛋白量呈线性正比关系。最后，进行了S-腺苷甲硫氨酸（SAM）浓度依赖性PEMT测定实验，检测了不同递增浓度的SAM。PEMT 活性在 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）浓度约为 0.5 毫摩尔时达到平台期。掌握本方案后，可根据样本数量在三至五小时内完成实验。在实施本方案时，必须使用近期购买的 SAM，因为该化合物不稳定。请务必注意，处理病原体和放射性物质可能具有极高的危险性。因此，遵循安全指南并穿戴适当的实验设备至关重要。

in-vitro-assay-to-measure-phosphatidylethanolamine-methyltransferase

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

体外试验来测量磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活

本方案描述了用于Entamoeba histolytica...

体外 tRNA 甲基化实验：使用溶组织内阿米巴 DNA 和 tRNA 甲基转移酶 Dnmt2 (Ehmeth) 酶

本视频演示了一种基于薄层色谱的酶活性测定方法，通过使用放射性标记的核苷酸来检测焦磷酸激酶活性。该方法可深入了解核苷酸合成及磷酸转移反应。...

基于薄层色谱的酶活性检测法：利用薄层色谱测定体外焦磷酸激酶活性的技术

蛋白质精氨酸甲基化，由一类酶催化 即， 蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）是指在蛋白质中精氨酸残基上通过酶促反应添加一个或多个甲基基团的过程。 体外...

体外 甲基化实验用于研究蛋白质精氨酸甲基化

我们描述了一种用于定量的基本实验方案 体外...

测量 体外 用于酶学表征的ATP酶活性

目前需要使一类新型“孤儿药”——药理学伴侣药物的临床前检测具有可重复性、快速且高效。我们开发了一种简单、高度标准化且用途广泛的基于细胞培养的检测方法，可用于筛选合适的患者以及新的药理学伴侣药物。...

体外酶活性检测用于评估法布里病和庞贝病对药物伴侣治疗的反应性

本文介绍了一种纯化组氨酸标签焦磷酸激酶酶的方法，并利用放射性标记底物及产物的薄层色谱分析来检测其酶活性。...

一种纯化与 体外 一种(p)ppGpp合成酶的活性检测 艰难梭菌

本文描述了一种无需抗体的体外检测方法，用于直接分析甲基转移酶在合成RNA或体外转录RNA上的活性。...

无需抗体的RNA甲基转移酶活性分析检测法

本文介绍了一种基于96孔板中钼蓝反应的筛选方法，用于筛选来自Thermotoga...

筛选 Thermotoga maritima 膜结合型焦磷酸酶抑制剂

棕榈酰化是指以可逆方式将一个16碳的棕榈酰基团结合到靶蛋白的半胱氨酸残基上。本文中，我们描述了一种生物化学方法——酰基-聚乙二醇交换凝胶迁移（APEGS）检测法，用于研究小鼠脑组织裂解液中任何目的蛋白的棕榈酰化状态。...

用于定量测定脑膜蛋白棕榈酰化的酰基-PEG化交换凝胶迁移实验

本文介绍了一种灵敏的荧光检测方法，利用二酰基甘油肽和炔基磷脂作为底物，结合点击化学反应，用于监测载脂蛋白N-酰基转移酶的活性。...

基于点击化学的荧光检测法用于载脂蛋白N-酰基转移酶的酶学表征及高通量筛选

DNA甲基转移酶是潜在的抗癌药物靶点。本文介绍了一种评估小分子抑制DNA甲基转移酶活性的实验方案。该检测方法利用一种限制性内切酶将DNA甲基化与荧光信号生成偶联，从而实现对酶活性的实时监测。...

基于连续荧光的核酸内切酶偶联DNA甲基化检测法筛选DNA甲基转移酶抑制剂

学习利用利什曼原虫细胞提取物定量测定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活性的体外实验方法。该技术无需纯化酶即可直接测量全细胞提取物中的PEMT活性，为研究寄生虫脂质代谢及磷脂酰胆碱生物合成提供重要工具。

体外测定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活性的实验方法

探索更多视频