一种用于脑部特异性敲低miRNA的简单替代性立体定位注射方法

在此，我们演示了使用一种穿膜肽与修饰过的反义寡核苷酸，特异性敲低小鼠脑内微小RNA的方法。该实验通过设计针对5月29日的抗义寡核苷酸（antigo）实现。在本研究中，我们使用了带有锁核酸修饰的抗义寡核苷酸雄性小鼠，以靶向微小RNA。

即在五个不同位置引入了LNA修饰。这种LNA修饰的引入可增强其与microRNA的结合亲和力。同时，它还能提供核酸酶抗性，从而提高对microRNA的靶向效率。

将ANTIGO MAR与肽的复合物在体外制备后，通过尾静脉注射入小鼠体内。该microRNA的敲低导致行为改变，提示此microRNA参与共济失调。连续注射三次后，即可在治疗后观察到步态的明显变化。收集脑组织并确认了microRNA的敲低效果。细胞穿透肽（CPPs）或自穿透肽最近已成为核酸递送的有吸引力的载体。

在此，我们使用了一种富含精氨酸的嗜神经肽，该肽可通过电荷作用与LNA形成复合物。当将其注入体循环后，该复合物可到达其特定靶向部位——本实验中的神经元细胞，并确保LNA在这些细胞内的有效释放。ME29家族成员的序列从mease中获取，16聚体反义链在五个等距位置经锁核酸（LNA）修饰后合成，用于制备复合物。将肽段和反义链溶液分别用无菌10%葡萄糖溶液配制至适当浓度。

在无菌条件下，将 Antigo 溶液缓慢地逐滴加入肽溶液中，并轻轻搅拌。缓慢加入和轻柔搅拌对于形成粒径在三聚体尺度的单一分散复合物至关重要。

抗原分三次等量加入，每次加入后轻柔混匀1分钟，随后静置孵育1分钟不进行混合。快速加入可能导致复合物聚集和沉淀。抗原复合物现可用于注射。

通过尾静脉注射给予复合物。将小鼠放回原来的笼子中。注射后三小时每天进行共济失调的行为学检测。

用手指捏住小鼠尾巴，使其无法接触任何周围物体。观察其后肢外展持续10秒的情况。在横梁行走实验中，小鼠需沿笼子的狭窄横梁行走。

小鼠穿过一条狭窄通道，将染有墨水的后肢在一条厚的吸水纸上留下足迹。为避免四肢足迹造成数据混淆，仅对后肢进行染色。让我们观察抗戈治疗的效果。我们从小鼠中分离出大脑及其他组织，这些小鼠分别接受了治疗和对照处理。

我们发现，R VG 肽能将荧光标记的 siRNA 特异性递送至脑组织，而不会递送至肝脏等其他组织。非嗜神经性对照肽 RVM 则将 siRNA 递送至肝脏。经 ANTIER 29 处理的小鼠表现出后肢功能缺陷。

使用乱序寡核苷酸处理的对照小鼠能够顺利通过窄梁，但在使用针对 MARE 29 的寡核苷酸处理后，小鼠在此实验中表现出轻微的功能缺陷。在足印实验中，处理后的小鼠步长显著缩短。此外，我们通过定量逆转录 PCR 确认，mid 29 A 和 mid 29 B 的表达水平下调，这为基于微小 NNA 的治疗策略的开发提供了依据。

由于血脑屏障的存在，将抗微小RNA（anti microRNAs）靶向递送至脑组织具有挑战性。通过本文所介绍的技术，我们可以避免传统的抗微小RNA脑部递送方法。该方法在技术上实现了微小RNA的敲低，并提高了组织特异性。