干细胞生物学导论

顾名思义，干细胞是许多不同类型细胞的前体来源。它们的特征在于其多能性，即能够分化为三个胚层的所有细胞类型，以及其自我更新能力，即能够产生更多的干细胞。为了推动发育生物学和再生医学领域的发展，干细胞研究人员正致力于揭示这些独特细胞如何实现如此重要功能的机制。

本视频将介绍干细胞生物学领域的重要发现、该领域科学家关注的关键科学问题、干细胞研究中常用的重要方法，以及干细胞研究的应用前景。

在介绍了干细胞概念之后，让我们深入探讨干细胞研究的丰富历史。

20世纪60年代，Ernest McCulloch 和 James Till 博士发现了成年哺乳动物骨髓中存在造血干细胞的首批确凿证据。这些细胞具有自我更新能力，并且是多能性的，即能够分化为多种但有限类型的细胞，主要是血液和免疫系统的细胞。

1988年，Irving Weissman 及其同事完善了一种从小鼠骨髓中纯化造血干细胞的方法。

1981年，Gail Martin教授提出了“胚胎干细胞”这一术语。与造血干细胞不同，胚胎干细胞具有多能性，能够分化为体内所有类型的细胞。她与科学家Martin Evans和Matthew Kaufman各自独立地同时开发了从小鼠囊胚中提取内细胞团并进行培养的方法 体外 干细胞

1998年，即小鼠胚胎干细胞被分离出来十多年后，James Thomson 博士成功建立了首批人类胚胎干细胞系。

2006年，山中伸弥博士提出诱导性多能干细胞技术，实现了重大突破。山中伸弥在约翰·格登工作的基础上，开发出一种利用逆转录病毒诱导一组少量转录因子表达的方法，使已分化的细胞重编程为多能状态。这组转录因子现被称为“山中因子”。由此产生的细胞被命名为“诱导性多能干细胞”（induced pluripotent stem cells, iPSCs）。这些实验被认为具有根本性重要意义，山中伸弥与格登因此荣获2012年诺贝尔奖。

目前，我们已拥有了多种人类疾病的iPSC模型，以及多种组织的再生平台。

目前，干细胞研究主要围绕几个核心问题展开。

其中最重要的问题之一是：干细胞如何维持其多能性和自我更新能力？干细胞具有两个相关的特性，使其具备这些性质。第一个特性是表达对干性（stemness）和自我更新至关重要的特定基因；第二个特性是干细胞对调控因子具有响应能力，这些因子可影响上述基因的表达。

接下来一个合乎逻辑的问题是：如何引导干细胞的分化？当干细胞发育为成熟细胞时，特定分化通路的激活会引发基因表达的变化，关闭干细胞相关基因，同时开启组织特异性基因，从而导致细胞功能和形态的逐步特化。

最后，让我们探讨推动干细胞研究经费投入的核心问题：干细胞能否用于治疗疾病？再生医学正从两个方向应对这一挑战：1）在实验室中重新生长器官；2）通过移植方式递送干细胞，以治疗组织退行性疾病。

在介绍了一些关于干细胞生物学的关键问题后，让我们来回顾一下用于解决这些问题的一些重要方法。

微阵列技术可用于发现赋予干细胞干性和自我更新能力的基因。在该技术中，首先从细胞群体中分离总RNA，以反映当前基因表达的快照。经过一系列步骤，将mRNA转化为荧光标记的探针，并与含有整个人类基因组转录本的芯片进行杂交。对芯片进行扫描可获得相对基因表达谱的读数。如图所示，干细胞表达一组特定的基因，其表达模式不同于分化细胞。 关键词：微阵列技术，干细胞，基因表达，RNA，荧光探针，杂交，基因组，表达谱

另一种检测多能性基因的方法涉及Oct4-GFP检测系统。Oct4是维持细胞自我更新所必需的基因，且在细胞分化过程中会迅速下调。因此，其表达水平可作为“干性”的可靠指标。在本实验中，细胞在Oct4启动子的调控下表达绿色荧光蛋白（GFP）。随后可对这些细胞进行实验处理，通过分析GFP表达水平的变化，鉴定出调控自我更新的新基因或可溶性因子。

为了研究干细胞 体外，我们必须首先了解如何培养这些细胞。干细胞需要特定的微环境以维持其干性。这种微环境可通过将干细胞与饲养层细胞（如小鼠胚胎成纤维细胞，即MEFs）共培养来实现。MEFs分泌多种复杂的因子，这些因子对维持干细胞的多能性和自我更新能力至关重要。

有时需要建立无饲养层的干细胞培养体系。维持无饲养层细胞系的主要方法是在细胞培养基中添加生长因子和抑制因子的储备试剂。

干细胞的分化 体外 可通过多种方法实现。细胞的特化最终由差异基因表达所决定。在此处所示的两步法中，培养的小鼠胚胎干细胞首先被诱导进入神经元命运的预备状态，随后再通过运动神经元诱导培养基进一步分化。这些因子激活特定的基因表达通路，导致细胞发生典型的运动神经元形态学及蛋白质组学改变。

传统方法的一个主要缺点是 体外 分化的一个问题是，培养皿中的平底板会限制细胞的三维生长。悬滴法和微囊法可克服这些问题。在悬滴法中，将少量干细胞悬液滴加到培养皿盖内表面，然后将皿倒置培养，使干细胞聚集形成称为类胚体的细胞聚集体。

在微囊化方法中，将干细胞与一种名为海藻酸盐的生物相容性半透膜材料混合，并以微珠形式接种至细胞培养板中。这两种方法均可进一步诱导分化为特定类型的细胞，例如多巴胺能神经元和心肌细胞。

了解如何引导干细胞分化是将干细胞应用于再生医学的重要一步。干细胞移植疗法旨在通过干细胞修复受损组织，从而治疗和治愈退行性疾病。在本实验中，利用慢病毒感染将山中因子导入患者体细胞，使其重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）。随后，这些细胞从多能状态分化为特定细胞类型，并回输至宿主以修复受损组织。

现在您已经了解了一些用于研究干细胞的方法，接下来让我们看看这些方法在具体实验中是如何应用的。

在此项利用多发性硬化症小鼠模型进行的实验中，研究人员将神经干细胞通过静脉注射注入患病小鼠体内。收集经处理小鼠的脑组织切片，并在显微镜下进行成像，以评估移植效果。利用报告基因LacZ追踪来源于供体神经前体细胞的细胞。如您所见，大量供体干细胞已分化并整合到患病小鼠的中枢神经系统中。

并非所有疾病都可通过全身性注射进行治疗。例如软骨损伤就需要特定的支架结构来支持重建。在此实验中，将间充质干细胞与凝血因子混合培养，形成凝块。随后将该凝块植入兔子受损的膝关节软骨中，并使其自然整合。经过这一过程后，可观察到膝关节软骨被重塑为光滑且具有正常功能的关节结构。

有时，干细胞研究人员与组织工程学家会合作重建整个器官。在此实验中，灵长类动物的肺脏经过冲洗处理以去除细胞成分，仅保留无细胞的结构支架。这种“无细胞肺”随后被转移至生物反应器中，并接种血管和上皮干细胞。为了进一步模拟天然肺脏所经历的压力和生理行为，生物反应器会循环培养基、维持压力和气体水平，并对肺组织进行周期性膨胀。

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