在实时麻醉小鼠成像中性粒细胞和单核细胞在肠系膜静脉用活体显微镜
2015年11月16日
我们详细介绍了一种方案，用于在稳态和炎症条件下使用麻醉小鼠的活体共聚焦显微镜监测肠系膜静脉中性粒细胞和单核细胞的行为。
这种活体内共聚焦显微镜检查程序的总体目标是监测小鼠在稳态和炎症条件下肠系膜静脉中中性粒细胞和单核细胞的动力学。这种方法可以帮助回答免疫学领域的关键问题，例如白细胞迁移、募集和与血管内皮相互作用的分子基础是什么。该技术的主要优点是能够在国家主义状态条件下跟踪和分析 LY 60 低单核细胞的巡逻，并跟踪单核细胞和中性粒细胞到同一血管的募集 在局部炎症刺激证明该程序后，实验室的技术员 Stefan ler 要从骨髓制备单细胞制剂， 用 70% 乙醇对 8 到 12 周龄的小鼠后腿进行消毒，然后用手术刀收获股骨和胫骨，此时所有骨骼都已断开。
用 90% 乙醇冲洗腿部，然后将骨头转移到装满 PBS 的培养皿中。然后在培养罩中，使用手术刀清洁股骨和胫骨，并在膝关节处将它们分开。接下来，切掉骨头的末端，并使用装有 23 号针头的制备培养基制成的 1 毫升注射器将每根骨头的骨髓冲洗到 50 毫升锥形管中。
通过将细胞聚集体通过针尖传回来破坏细胞聚集体，然后用新鲜制剂使细胞悬液的总体积达到 25 毫升，培养基向下旋转细胞，然后复苏。将上颚悬浮在 1 毫升红细胞裂解缓冲液中，然后将细胞转移到冰上的 15 毫升锥形管中。30 秒后，用 10 mL 制备物停止裂解。中等。
再次旋转细胞，然后 Resus 悬浮沉淀。再加入 2 毫升制备培养基，通过阴性选择富集中性粒细胞。首先，将骨髓细胞与 150 μL 小鼠中性粒细胞富集混合物在冰上孵育 10 分钟。
在 10 mL 不含酚红的 DMEM 中孵育结束时。倒置试管一次并向下旋转细胞。将沉淀重悬于 1.75 mL 制备培养基中，并将细胞转移到 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。
然后将细胞与 250 μL 生物素选择混合物在冰上孵育 10 分钟。在孵育结束时，我们将细胞分离试剂盒中的磁性颗粒悬浮 30 秒。然后将细胞与 500 μL 颗粒在冰上孵育 10 分钟。
孵育结束时，将试管放入磁力架中。三分钟后，将磁力架倒置到新的 5 ml 聚苯乙烯圆底管中。要收集未标记的细胞，请将未标记的细胞管放入磁力架中。
三分钟后，将磁力架倒置到 15 mL 锥形管中，以转移未标记的细胞，将最后一滴留在管中。然后用新鲜的不含酚红的 dm 将体积调至 5 mL。现在，在 37 摄氏度下向细胞中加入半微升适当的细胞质染料，例如此处使用的细胞追踪橙。
2 分钟后，在 37 摄氏度下，用 2.5 毫升制备培养基洗涤细胞，然后将沉淀重悬于 1.5 毫升试管中的 1 毫升制备培养基中，计数细胞，然后在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。离心细胞后，我们将沉淀悬浮在 1 毫升 PBS 中，然后在细胞离心时再次离心。使用油将 35 毫米玻璃盖玻片连接到具有 30 毫米直径孔的 10 厘米组织培养皿上。
然后以每 100 微升 PBS 中 7 个细胞的 10 倍重悬沉淀，并在标记后尽快将细胞置于冰上。将标记的中性粒细胞静脉注射到麻醉的 8 至 12 周龄 CX 3 CR 1 GFP 小鼠中，并将小鼠放在加热垫上。然后立即将药膏涂抹在动物的眼睛上，用剪刀打开腹部皮肤，露出腹膜，用剪刀切开腹膜，露出肠道。
然后向腹膜腔中施用 200 微升 37 摄氏度的 PBS，并将小鼠面朝下放在组织培养皿上，以轻轻的压力从腹膜腔中取出肠道。然后，使用无菌棉签小心地将肠道滚动到盖玻片上，露出肠系膜血管，并用用 37 摄氏度 PBS 湿润的薄纸片固定组织，以减少蠕动引起的运动。花时间用 PBS 加权组织小心地固定肠道非常重要。
否则，图像采集过程中蠕动引起的运动会破坏实验。接下来，将组织培养皿和小鼠转移到倒置显微镜的定制痕量台上的 37 摄氏度恒温室中，并在后腿肌肉注射第二轮麻醉剂。现在将适当的激光器设置为必要的最低功率，以避免激光诱导的光毒性，并让鼠标休息 30 分钟。
当动物恢复后，在稳态条件下录制第一部电影 30 分钟。然后，为了引发血管炎症，将含有 100 微克 TLR、2 TLR、1 激动剂、PAM 3、CSK 4 的 20 微升 PBS 滴直接分配到成像血管上。最后获取第二部电影，注意控制添加激动剂后的焦点，因为炎症会引起内皮宽度的变化，改变 Z 轴的焦点，在这里，在稳态条件下获取的电影的第一个时间点的图像处理的不同步骤，如刚刚所示，在本电影中展示。
绿色LASIK 纤毛单核细胞在稳态条件下的巡逻可以通过观察到血液中循环的红色中性粒细胞来可视化。这里。在添加 PAM 3 CSK 4 后 90 分钟显示相同的感兴趣区域，导致中性粒细胞和单核细胞大量募集到内皮壁，单核细胞使用适当的软件仔细扫描，单核细胞和中性粒细胞的确切路径。可以在炎症开始之前和之后跟踪巡逻内皮。
需要注意的是，Z 轴上的焦点丢失或 XY 位移可能是肠道运动破坏实验的结果。该技术可以通过使用不同的转基因小鼠模型或注射阻断抗体或药物来确定感兴趣的特定分子在白细胞行为中的作用来进一步修改。看完这个视频，你应该对如何监测肠系膜静脉中饱和白细胞的动力学有了很好的了解。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文详细描述了一种使用体内共聚焦显微镜在麻醉小鼠中监测肠系膜静脉中中性粒细胞和单核细胞行为的协议。该方法适用于稳态和炎症条件下。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 显微镜技术
背景
- 理解白细胞动力学对免疫学至关重要。
- 中性粒细胞和单核细胞在炎症和免疫反应中起关键作用。
- 体内显微镜允许实时观察细胞行为。
- 肠系膜静脉对于研究白细胞与血管内皮的相互作用很重要。
研究目的
- 监测体内中性粒细胞和单核细胞的动力学。
- 研究白细胞迁移和招募的分子基础。
- 分析炎症过程中白细胞与血管内皮的相互作用。
使用的方法
- 对麻醉小鼠进行体内共聚焦显微镜检查。
- 从骨髓中制备单细胞悬液。
- 小鼠股骨和胫骨的消毒和采集。
- 将骨髓冲入锥形管以进行分析。
主要结果
- 成功追踪稳态条件下LY 60低单核细胞。
- 观察到单核细胞和中性粒细胞在炎症后招募到同一血管。
- 洞察局部炎症刺激下白细胞行为的反应。
- 证明体内显微镜在研究免疫反应中的有效性。
结论
- 该协议为研究白细胞动力学提供了宝贵的工具。
- 体内显微镜增强了对免疫细胞行为的理解。
- 研究结果可能为未来的炎症和免疫反应研究提供信息。
常见问题
Executive Industry Relevance
This intravital microscopy technique enables real-time visualization of leukocyte dynamics in mesenteric veins, providing critical insights into neutrophil and monocyte recruitment under inflammatory conditions. By capturing time-lapse movies of fluorescently labeled cells interacting with the vascular endothelium, the method supports mechanistic de-risking in immunology target validation and phenotypic screening campaigns. The approach offers translational value for preclinical models of inflammation by delivering quantitative, reproducible data on leukocyte-endothelial interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding leukocyte migration and endothelial interaction mechanisms.
- Operational Value: Provides direct visualization of monocyte patrolling and neutrophil recruitment in live tissue under controlled inflammatory stimulation.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking molecular perturbations to observable changes in leukocyte behavior in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements such as leukocyte velocity, adhesion frequency, and extravasation rates under defined stimuli.
- Operational Value: Establishes a standardized, reproducible platform for screening immunomodulatory compounds or blocking antibodies in a physiologically relevant context.
- Scalability: Compatible with transgenic mouse models and pharmacological interventions to assess target engagement and functional outcomes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models leukocyte trafficking in mesenteric veins, a site relevant to gastrointestinal inflammation and systemic immune responses.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings with in vivo behavior, enabling risk-adjusted advancement decisions in preclinical pipelines.
- Mechanistic De-risking: Clarifies the role of specific molecules (e.g., TLR2/TLR1 agonists) in leukocyte recruitment, reducing ambiguity in target mechanism.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis validation in early discovery, assay readiness in screening, and mechanistic insight in translational research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of leukocyte-endothelial interaction pathways using real-time imaging of defined cell populations.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (e.g., cell flux, adhesion duration) that enable comparison across experimental conditions.
- Analytics: Provides statistical analysis-ready data on leukocyte dynamics, enabling objective comparison of control vs. treatment groups.
- Translational Research: Connects molecular interventions to observable cellular phenotypes in a preclinical model of inflammation.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable intravital imaging capability applicable across multiple leukocyte populations and inflammatory stimuli.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in leukocyte recruitment pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined surgical preparation, imaging parameters, and inflammatory induction protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering direct, visual evidence of target-mediated effects on immune cell behavior.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on functional outcomes in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, intravital microscopy, and fluorescent cell labeling.
- Dependent on inverted confocal microscopy systems with environmental control (37°C, anesthesia maintenance).
- Necessitates standardization across teams for tissue immobilization, agonist delivery, and focus control during inflammation induction.
- Adaptation considerations include transgenic model selection, dye compatibility, and stimulus optimization for specific leukocyte subsets.
- Practical limitations include susceptibility to motion artifacts from peristalsis and phototoxicity from prolonged laser exposure.
