腹膜内卵巢癌转移的定量

卵巢癌转移的特征是许多弥漫性腹膜内病变，因此难以准确目视量化肿瘤负荷。 在此，我们描述了一种使用红色荧光蛋白 （RFP） 标记的肿瘤细胞和光学成像对转移性肿瘤负荷进行原位和离体定量的方法。

本实验的总体目标是确定同基因原位异种移植小鼠模型中腹膜内卵巢癌转移的相对肿瘤负荷。这种对相对肿瘤负荷进行成像和量化的新方法可以帮助我们回答卵巢癌转移调节的关键问题。该技术的基本优点是，通过解开荧光光谱，从图像中去除组织自发荧光，从而能够测量标准化的相对肿瘤负荷。

这项技术有助于了解人类卵巢癌转移，对监测治疗效果具有重要意义。这种方法的视觉演示至关重要，因为我们将强大的成像技术与分析程序相结合，以从图像中提取定量数据。今天演示该程序的是 Stack Lab 的实验室项目经理 Yuying Liu。

肿瘤细胞生长 10 周后，将每只麻醉小鼠的身体放入小动物光学成像系统中，一次一只。在每个时间点扫描队列中的所有小鼠。要观察荧光标记的肿瘤细胞，请执行多光谱采集以收集总共五张图像。

选择 15 秒的标准曝光、2 x 2 像素合并、16 厘米的视野和 1.1 的 F 制光圈。接下来，使用来自开放激发滤光片的白光、开放发射滤光片、0.2 秒的标准曝光和 2 x 2 像素合并和 16 厘米的视野（F 档为 2.8）获取整个动物的反射图像。安乐死后，使用尖头解剖剪刀沿小鼠腹侧中线向前切割皮肤，从大腿顶部到肋骨底部。

轻轻地将皮肤与腹膜组织分开，确保不要刺穿腹膜壁。然后沿胸腔底部和大腿顶部横向切割，形成两个皮瓣。将鼠标放在扫描仪的腹侧，使腹膜腔朝下，皮瓣拉开。

使用以前用于实时鼠标的相同参数，在原位扫描鼠标及其器官。现在，通过使用标准技术提取肝脏、网膜、胰腺、胃、隔膜以及小肠和大肠来继续解剖小鼠。此外，切除左右腹膜、卵巢、肾脏、肠系膜，最后去除脂肪垫。

观察、列举和记录器官上每个可见的肿瘤。使用卡尺测量每个肿瘤的直径。将直径小于 2 毫米的肿瘤指定为小肿瘤，将直径在 2 到 5 毫米之间的肿瘤指定为中等肿瘤，将直径大于 5 毫米的肿瘤指定为大肿瘤。

接下来，将器官放在器官扫描模板上，如随附文本协议的图 4 所示，并在下次扫描期间使用它来组织每个器官的位置。使用 PBS 保持器官湿润。使用小动物光学成像系统和以前使用的参数扫描每张器官。

扫描后，将器官置于 10% 甲醛中，并使用标准技术对其进行组织学处理。为了减少每次多光谱扫描中的自发荧光量，首先加载红色荧光蛋白体内光谱文件，然后在未混合图像窗口中加载自动地板体内红色文件，然后选择取消混合。然后以 16 位未缩放的 dot tif 格式导出 dot bip 文件，并将它们加载到图像 J 中，方法是转到文件，打开，然后选择正确的 16 位 dot tif 文件。

接下来，转到图像菜单，然后选择 调整，然后选择 亮度对比度，并将最小显示值设置为零，将最大显示值设置为加 35353。然后再次在图像菜单下，转到查找表，然后选择 red hot。不同的动物模型需要不同的亮度水平，但在整个给定研究中保持亮度一致非常重要。

使用自由手选择工具，在每个器官周围绘制自由形式的感兴趣区域选择。感兴趣的自由形状区域应靠近器官边界。然后，键入 control 和 M 以使用测量工具计算每个器官的表面积。

将此数据记录在电子表格中。使用在每个器官周围绘制的感兴趣区域，右键单击并选择 Duplicate（复制）以仅包含该器官。然后，在图像下，转到 调整，然后 阈值，并将阈值下限设置为加 1， 200，将阈值上限设置为加 1， 700。

此外，检查深色背景，然后选择 确定。这将仅选择最亮的荧光区域。图像可能需要手动作图像 J 中的阈值滑块，以便为分析步骤选择先前最亮的区域，如上所示。

不同的疾病模型需要不同的阈值约束，但在整个给定研究中保持阈值水平一致非常重要。在 analyze（分析）下，选择 analyze particles（分析粒子），然后将像素的平方大小更改为 10 到 infinity。选择 显示轮廓，并选中以仅选择 display results，然后单击 确定。

这将测量被视为肿瘤的明亮区域的面积和原始积分密度。将每个肿瘤选择的表面积和原始积分密度的值一起记录在包含器官表面积的同一电子表格中。然后，在 analyze（分析）下，选择 tools（工具），然后转到 calibration bar（校准栏）。

将校准比例尺添加到器官的图像中。蒙太奇可以包含更多或更少的器官，具体取决于给定的研究。接下来，在 file 下，转到 Save as，并将蒙太奇另存为 dot tif 和 dot jpeg。

然后，打开器官的 dot jpeg 文件，然后转到 插入 菜单为每个图像添加一个文本框。通过在三行器官的每行下方创建一个文本框来添加器官标签。按鼠标编号的顺序将全身扫描的每个 16 位 dot tif 文件打开到 Image J 中。

然后，转到图像菜单，选择调整，然后选择亮度对比度。将最小显示值设置为零，将最大显示值设置为加 35353。接下来，返回图像菜单，查找表，然后选择 red hot。

完成后，将蒙太奇另存为 dot tif 和 dot jpeg 文件。在成像前 8 周注射到小鼠体内的 ID10 小鼠卵巢癌细胞系在红色通道中发出荧光，并在整个生长过程中持续发光。使用小动物光学成像系统进行实时成像能够查看小鼠中扩增的 ID8 细胞，并提供比简单地称量小鼠以评估肿瘤负荷更准确的方法。

在安乐死和去除腹侧皮肤层后，可以更详细地查看完整的器官。然而，放置在器官扫描模板上的单个器官清楚地显示了每个器官的肿瘤负荷。左图所示的小鼠网膜和胰腺、卵巢和肠系膜的肿瘤负荷远大于右图所示的小鼠的相同器官。

肿瘤服务区域和肿瘤信号强度方面定量证实了差异肿瘤负荷的观察。一旦掌握，这项技术可用于每小时对多达 18 只活老鼠进行成像。每个样本对单个器官进行解剖和离体成像大约需要 20 分钟。

按照这个程序，可以执行定量磁共振等其他方法来解决假设，例如肥胖对卵巢癌转移的影响，正如我们 2015 年的癌症研究文章所示。