金属氧化物纳米颗粒的组织学样品鉴定增强暗场显微镜和高光​​谱遥感制图

该程序的总体目标是通过暗场显微镜和高光谱映射来识别组织学样本中的金属氧化物纳米颗粒。这是通过首先在含有纳米颗粒的阳性对照样品中识别感兴趣区域并捕获暗场图像来实现的。第二步是使用高光谱相机创建感兴趣区域的高光谱影像或数据立方体。

接下来，从阳性对照数据立方体创建一个参比谱库，该数据库根据阴性对照进行过滤以去除任何假阳性。最后一步是使用参考光谱库与实验样品进行映射，以识别和定位相同成分的纳米颗粒。最终，增强的暗场显微镜和高光谱映射用于以比电子显微镜等其他技术更快、资源消耗更少的方式识别组织学样本中的金属氧化物纳米颗粒。

与传统的纳米材料成像和表征技术（如电子显微镜）相比，这种方法具有多项优势。在这种情况下，样品制备通常最少且无损。图像采集和分析时间和成本密集，可用于各种基质中的纳米颗粒成像。

人们知道该方法有时很困难，因为创建适当的阳性对照样品和参考光谱库既具有挑战性又耗时。但是，一旦这些初始步骤完成，就可以很快地评估实验样品。虽然这种方法可以深入了解纳米颗粒的皮肤渗透情况，但它也可以应用于其他生物样品，例如支气管肺泡灌洗液和血涂片，以及非生物样品，例如职业暴露评估中使用的过滤器。

演示这项技术的将是 Plar Sosa，他是我实验室的一名医学生，首先插入并打开光源、载物台控制器、光学相机、高光谱相机和计算机系统。然后将载物台和聚光镜提升到作位置，小心地将三到五滴 A 型浸油滴在聚光镜上。如果产生任何气泡，请擦去油并将其重新涂抹在镜头上。

接下来，将样品放在载物台上并缓慢升高冷凝器，直到浸油与载玻片的底部接触。这将通过油与载玻片接触的快速增亮的照明环来明显。聚光镜就位后，切换到 10 倍物镜，然后聚焦并对齐聚光镜以最大限度地提高亮度（如果需要），调整聚光镜对齐旋钮以使亮点居中。

打开光学成像软件。使用精细物镜聚焦旋钮聚焦样品。然后找到感兴趣的区域。

根据需要调整聚光镜焦距以平衡照明。单击菜单栏中的设置选项卡，然后单击图像捕获按钮。对于 capture 事件。

选择所需的图像格式并为图像分配文件名。此外，选择默认的延时值，最后单击 确定。接下来，转到曝光菜单并选择创建最高对比度图像的曝光设置。

在这里，电平设置为 0.0%增益设置为 2.8 分贝，快门速度设置为 56 毫秒秒。通过单击菜单栏中的 image 按钮捕获图像。将目标更改为 40 x 和 100 x。

以更高的放大倍率捕获图像，确保光导指向高光谱相机，然后打开高光谱成像软件以在软件中采集 HSI 数据立方体，在菜单栏中打开高光谱显微镜并选择 HSI 显微镜控件。在这里设置客观的放大倍率和安全路径。接下来，在设置中更改区域捕获，并更改行数。

在这项研究中，我们使用了 720 设置曝光时间。这里我们使用了 0.25 秒。将其他所有内容保留为默认值，然后单击预览 HSI 以查看图像。

观察生成的强度图，该图表示当用户在相机视场中心的 x 轴上移动时最高波长的强度。移动光标以生成图形的准确轮廓。这将导致左侧出现数字强度指示器。

通过调整精细物镜焦距来锐化此图像中的峰值，从而根据此预览聚焦图像。接下来，通过调整光源亮度聚光镜焦点来优化光线强度，或者在软件中取消预览并调整曝光时间。单击 capture 并观察四个具有可用名称的新窗口。

Bands 列表。第一缩放。出现数字 1、滚动和数字 1 RGB 带。

最大化第一个 RGB 波段窗口，因为这是数据立方体，将用于所有将来的引用。右？单击此数据立方体，将其另存为 tiff 文件，然后单击 Ok.右键单击数据立方体图像窗口，然后左键单击 Z 剖面光谱。

当弹出的光谱图窗口出现在左侧时，单击数据立方体目标上感兴趣的像素。最亮的那些是那些可以自信地识别为代表感兴趣材料的那些。在粒子分析菜单下，选择粒子过滤器工具以识别数据立方体中存在的粒子。

在新的弹出窗口集中，光谱最大值必须超过值，因此它高于背景像素，但低于感兴趣的材料。有效数据最大值为 16， 000。在粒子过滤器查看工具窗口中，单击 select all （全选）。

然后单击 export to spectral library （导出到谱库） 并为您的谱库分配名称。选择样品作为阴性对照后，从样品中获取多个数据立方体。使用高光谱相机，至少需要一个，但可以捕获更多。

要在打开阴性对照数据立方体的情况下提高选择性，请单击过滤器光谱库在主程序工具栏上的分析菜单下，单击打开新文件，然后选择之前为阳性对照创建的光谱库作为输入文件，单击确定。在过滤器 cyto viva 光谱库窗口中。单击图像并选择参考光谱库的输出文件名，然后单击确定。

接下来，单击阴性对照数据立方体的文件名作为源图像。该软件将分析谱库并删除与阴性对照数据立方体的任何谱图匹配的每个谱图。在实验数据立方体打开的情况下，从实验样品中获取数据立方体。

单击映射方法子菜单中的光谱菜单打开光谱角度映射器。在弹出窗口中选择实验数据多维数据集的名称，然后单击 确定。如果未列出任何文件名，请单击 Open new file （打开新文件） 并选择实验数据多维数据集。

然后点击 确定 在名为 End Member collection， SAM 的弹出窗口中，单击 import 在菜单栏中。然后从 Spectral Library 文件中进行选择。打开之前创建的参考光谱库，然后单击 确定。

在名为 Input Spectral Library 的新弹出窗口中，单击 select all items，然后单击 okay。然后右键单击颜色并选择。将默认颜色应用于所有 单击 全选 后跟 应用，然后选择输出文件名并单击 好.

打开数据多维数据集窗口中的叠加菜单，然后选择 classification。然后导航到输出文件名并单击 Ok.在交互式类工具窗口菜单中，打开选项菜单并选择合并类以创建统一的配色方案。

更轻松地使用其他软件分析数据，请从基类列表中选择单个光谱。然后选择除 unclassified 之外的所有类以合并到基础类中。然后点击 Ok.

接下来，单击所选的基色，所有匹配的光谱都将以该颜色显示。要获得将在黑色背景上显示匹配光谱的非动像图像，请单击未分类的颜色框，该框为黑色默认情况下，该技术最显着的优势是它能够通过暗场显微镜和高光谱映射来识别组织学样品中的金属氧化物纳米颗粒。这些图像使用组织学皮肤样本演示了这一过程。

虽然一些颗粒在暗场中很容易看到，但光学图像、其他颗粒是使用高光谱成像检测到的。这里显示的是表皮层中的猪皮肤组织，它暴露于 Illumina 纳米颗粒中。发现高对比度的纳米颗粒簇沉积在真皮层的角膜层上，该层暴露于二氧化硅纳米颗粒中。

可以看到多个高对比度纳米颗粒沉积在结缔组织上。最后，在皮下组织中，暴露于叙利亚纳米颗粒。使用这种方法，可以看到多个高对比度分散的纳米颗粒沉积在脂肪细胞纳米颗粒上。

在其他组织样本如肺、肝、脾、肾和淋巴结中是可能的。按照此程序，可以进行图像分析以回答其他问题，例如颗粒计数和颗粒位置。必须权衡某些考虑因素和缺点，例如需要高度专业化的控制和对光子成像分辨率的限制。

在选择最合适的分析技术来研究特定的研究问题时，我们选择展示这种特定的应用，因为它有可能补充当前和未来的纳米毒理学研究。它还可以为纳米颗粒在整个器官和组织中的吸收、分布、代谢和排泄的研究提供信息。