Name: 小鼠模型的验证扰乱LINC配合物在细胞特异性的方式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 了解利用Cre/Lox转基因小鼠模型诱导性靶向表达荧光标记EGFP KASH2肽，特异性破坏小脑浦肯野细胞中内源性LINC复合物，研究其在核定位中的作用机制。

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作者感谢圣路易斯华盛顿大学医学院形态学与影像核心、分子遗传学核心（眼科与视觉科学系）以及小鼠遗传学核心工作人员的支持。本研究得到麦克唐奈细胞与分子神经生物学中心小型资助项目、霍普神经疾病中心、美国国立眼科研究所（资助号：#R01EY022632，授予 D.H.）、美国国立眼科研究所中心核心资助（资助号：#P30EY002687）以及防盲研究组织向眼科与视觉科学系提供的无限制资助的支持。

伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得圣路易斯华盛顿大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 小鼠繁殖与基因分型
<ol>
	<li>将 Tg(CAG-LacZ/EGFP-KASH2) 小鼠与 Tg(PCP2-Cre) 小鼠杂交，以获得 Tg(PCP2CreCAG-EGFP/KASH2) 小鼠19,20。注意：尽管本方案其余部分重点使用 Tg(PCP2-Cre) 小鼠品系以将 EGFP-KASH2 的表达限制在小脑的浦肯野细胞中，但也可采用类似步骤与其他任何 Tg(Cre) 小鼠品系进行实验（图 2A）。</li>
	<li>进行基因分型，以鉴定同时携带 EGFP 和 Cre 转基因的仔鼠，方法如前所述19。</li>
</ol>
2. 解剖和组织采集所需材料的准备
<ol>
	<li>配制 100 ml 含 30% 蔗糖的 PBS 溶液（30 g 蔗糖/100 ml 1×PBS），并于 -20°C 保存。组织取材当天，将溶液解冻，并将约 30–35 ml 蔗糖溶液装入 35 ml 注射器中，用于心脏灌注。</li>
	<li>配制 40 ml 含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液（10 ml 16% 多聚甲醛与 30 ml PBS 混合）。将约 30–35 ml 4% 多聚甲醛溶液装入 35 ml 注射器中，用于心脏灌注。</li>
	<li>在 10 cm 组织培养皿中加入 10 ml PBS，用于组织解剖。</li>
	<li>配制含 16 mg/ml 氯胺酮和 3 mg/ml 赛拉嗪的混合麻醉剂。</li>
	<li>准备 70% 乙醇溶液用于解剖操作。</li>
</ol>
3. 解剖与组织采集
<ol>
	<li>使用1 ml注射器，按每25克体重500 µl的剂量注射氯胺酮/赛拉嗪混合溶液，等待约15分钟。或者，使用其他机构批准的、适用于目标生物系统的镇静方法。</li>
	<li>动物镇静后，轻轻捏压后肢足掌以确认无痛觉反应，将四肢固定于泡沫板上，使小鼠背部朝下。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒腹部，从下腹部至肋骨顶部做切口，以暴露心脏。</li>
	<li>在心脏右心房做一小切口，将装有30%蔗糖溶液的注射器插入左心室。</li>
	<li>以约2–5 ml/min的速度灌注溶液。注射器排空后取出，并更换为4%多聚甲醛（PFA）溶液重复灌注。</li>
	<li>解除泡沫板上的固定，取下小鼠头部以暴露脑组织。</li>
	<li>使用镊子和剪刀去除头部周围的皮肤。用针头在颅骨后部刺一小孔，再用剪刀和解剖镊小心剥离颅骨。</li>
	<li>待脑组织充分暴露后，用镊子取出小脑并置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。用手术刀沿矢状面将小脑切成两半，转移至30%蔗糖溶液中，4°C下过夜。注意：如需制备石蜡切片，应在组织包埋与切片前，先将小脑在4% PFA中4°C固定过夜。</li>
</ol>
4. 组织处理与切片
<ol>
	<li>制备干冰与2-甲基丁烷的混合物，使浴液温度平衡5分钟。</li>
	<li>将OCT包埋剂填充至冷冻模具中，并将半侧小脑组织放入模具内。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用镊子调整小脑的位置，使组织的剖切面（靠近小脑中线处）朝上。</li>
	<li>将冷冻模具转移至干冰混合液中5分钟，直至OCT包埋剂在组织周围形成坚实的白色基质。注意：如需保存，冷冻样本可置于-20°C环境中。</li>
	<li>标记经多聚赖氨酸预处理的载玻片，用于收集组织切片；按照制造商说明书设置冷冻切片机，以获取15 µm厚的小脑切片。收集切片时，小心地将切片与载玻片的多聚赖氨酸涂层面接触。为保持切片的方向性，此步骤中切勿旋转载玻片。</li>
	<li>将组织切片储存于-20°C，直至进行染色与成像操作。</li>
</ol>
5. 小脑切片的染色与成像
<ol>
	<li>在组织染色前配制以下溶液： 
	~50 ml&#160; PBS 
	~5-10 ml&#160; 含4% PFA的PBS溶液 
	~10-20 ml&#160; 含0.5% Triton X-100和10%驴血清的PBS溶液</li>
	<li>解冻小脑切片。重要的是，应尽量减少其暴露于任何持续强光的光源下，以防止EGFP荧光褪色。</li>
	<li>使用疏水屏障笔在组织切片周围画出矩形区域。</li>
	<li>用4% PFA对切片进行后固定5分钟。加入足量液体以覆盖疏水屏障所划定的整个区域（通常约为500 µl）。使用真空泵或移液器小心去除固定液，注意不要扰动组织切片。</li>
	<li>用移液器将PBS轻柔地加至载玻片上，避免扰动组织切片。5分钟后，使用真空泵或移液器小心吸除液体。重复PBS漂洗共三次。</li>
	<li>用移液器小心加入适当稀释的一抗溶液（每900 µl溶液中加入3 µl Calbindin 和/或 Nesprin2 抗体），溶剂为含0.5% Triton X-100和10%驴血清的PBS。室温避光孵育1小时。 
	注意：EGFP-KASH2可在冷冻切片上通过直接荧光显微镜观察，无需使用抗EGFP抗体。然而，若制备的是石蜡切片，则对EGFP-KASH2的成像需使用抗EGFP抗体进行免疫检测。</li>
	<li>去除一抗溶液，并用PBS漂洗三次。</li>
	<li>将Alexa-Fluor二抗按1:1,000比例稀释于含0.5% Triton X-100和10%驴血清的PBS中，并避光保存。</li>
	<li>轻柔地去除最后一次PBS漂洗液，加入二抗稀释液，避光孵育1小时。</li>
	<li>去除二抗溶液，漂洗并洗涤切片三次。如需进行核染色，可在第一次加入PBS时加入核染料（如DAPI，~300 nM）。</li>
	<li>彻底清除组织周围的PBS溶液，在组织切片上滴加约5–7 µl封片剂。将玻璃盖玻片覆盖于组织切片上，室温避光静置约15–30分钟。</li>
	<li>使用配备适当滤光片的荧光显微镜观察EGFP以及步骤5.8/5.9中所用二抗对应的其他波长荧光信号。在小脑切片中，使用20倍物镜观察EGFP-KASH2的核膜边缘结构。</li>
</ol>

<ol><li>Hutchison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins%3A+building+blocks+or+regulators+of+gene+expression%3F+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).</li>
<li>Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+lamins%3A+their+structure%2C+assembly%2C+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions.</a> Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).</li>
<li>Haque, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1+interacts+with+nuclear+lamin+A+and+cytoplasmic+nesprins+to+provide+a+physical+connection+between+the+nuclear+lamina+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton.</a> Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).</li>
<li>Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sun2+is+a+novel+mammalian+inner+nuclear+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).</li>
<li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+and+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">KASH and SUN proteins.</a> Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).</li>
<li>Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprins+LINC+the+nucleus+and+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton.</a> Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).</li>
<li>Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+dynein+at+the+nuclear+envelope+mediate+the+bidirectional+migrations+of+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei.</a> The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).</li>
<li>Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-83+is+a+nuclear-specific+cargo+adaptor+for+kinesin-1-mediated+nuclear+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration.</a> Development. 136, 2725-2733 (2009).</li>
<li>Padmakumar, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enaptin%2C+a+giant+actin-binding+protein%2C+is+an+element+of+the+nuclear+membrane+and+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton.</a> Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).</li>
<li>Roux, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+4+is+an+outer+nuclear+membrane+protein+that+can+induce+kinesin-mediated+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).</li>
<li>Wilhelmsen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+outer+nuclear+membrane+protein%2C+associates+with+the+cytoskeletal+linker+protein+plectin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin.</a> The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).</li>
<li>Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprins+anchor+kinesin-1+motors+to+the+nucleus+to+drive+nuclear+distribution+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells.</a> Development. 142, 218-228 (2015).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+protein+Syne-2%2FNesprin-2+and+SUN+proteins+SUN1%2F2+mediate+nuclear+migration+during+mammalian+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development.</a> Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li>
<li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1%2F2+and+Syne%2FNesprin-1%2F2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li>
<li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180(2012).</li>
<li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

成功研究LINC复合物作用的最关键步骤 体内 使用Tg(CAG-LacZ/EGFP-KASH2)模型的关键在于筛选合适的Cre小鼠品系。事实上，若Cre在参与类似通路的其他细胞类型中也具有活性，则可能使实验结果的解读变得复杂。因此，有必要对邻近细胞进行检测，如此处所示的小脑分子层和颗粒层中的细胞图2B同样，为了最大限度地呈现任何具有生理相关性的表型，重要的是要选择一种在目标细胞类型中具有广泛表达的Cre小鼠品系。此外，对所研究系统中LINC复合物组分在发育过程中的表达模式进行深入表征也至关重要。事实上，Tg(CAG-LacZ/EGFP-KASH2)小鼠模型的一个局限性在于，它无法提供有关在特定生物系统中涉及哪些Sun蛋白或Nesprin异构体的信息。然而，通过在转录和蛋白水平上进行严谨的表征，可以克服这一问题。事实上，已有多个研究在这一方面开展了工作，揭示了特定LINC复合物组分在中枢神经系统（CNS）发育与稳态过程中的重要作用。21,22.
最后，尽管本实验方案主要针对固定中枢神经系统组织的使用，Tg(CA...

核膜（NE）将核质与细胞质分隔开来。它由内层和外层核膜（分别称为 INM 和 ONM）组成，二者在核孔处相连。由这两层膜所界定的腔隙称为核周间隙（PNS）。外层核膜是粗面内质网（ER）的延伸结构，而内层核膜则紧贴核纤层，后者是由 A 型和 B 型核纤层蛋白代表的第 V 型核中间丝构成的网状结构1,2。连接核骨架与细胞骨架的 LINC 复合物（LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton）是一类跨越整个核膜的大分子组装体，可将细胞核内部与细胞骨架丝及分子马达在物理上连接起来（图 1A）。这类复合物依赖于两组核膜整合跨膜蛋白家族中进化上保守基序之间的相互作用：Sun（Sad1/Unc84）蛋白和 Nesprin（Nuclear Envelope SPectRINS）蛋白。在哺乳动物中，Sun1 和 Sun2 是位于内层核膜的跨膜蛋白，其 N 末端的核质区域可直接与 A 型和 B 型核纤层蛋白相互作用3-5。在内层核膜的另一侧，即核周间隙内，Sun 蛋白含有一个进化上保守的约 150 个氨基酸残基组成的 C 末端区域，称为 SUN 结构域。SUN 结构域可直接与进化上保守的 KASH（Klarsicht/Anc-1, Syne Homology）结构域结合，后者是 Nesprin 蛋白的分子特征。KASH 结构域由约 30 个 C 末端氨基酸残基组成，伸入核周间隙，随后连接一个跨膜结构域6。至少存在四个不同的 Nesprin 基因（Nesprin1-4），它们编码含有 KASH 结构域并定位于核膜的蛋白质7。Nesprin 蛋白的胞质区域大小不一，从小约 50 kDa（Nesprin4）到惊人的 1,000 kDa（Nesprin1 巨型蛋白）不等，其中包含多个血影蛋白重复序列以及特定的基序，使其能够与肌动蛋白、plectin 和分子马达等细胞骨架组分相互作用8-13。
在脊椎动物和无脊椎动物中的研究表明，Lamin/Sun/Nesprin/分子马达构成了一条在进化上保守的“轴”，调控细胞核的迁移与锚定。已有多个LINC复合物组分的基因敲除（KO）小鼠模型被报道，这些模型为理解Sun蛋白和Nesprin蛋白在哺乳动物发育过程中于核膜（NE）所发挥的作用提供了重要框架9,14,15。然而，这些模型存在若干显著缺陷，主要包括：1）由于细胞非自主效应，表型解读困难；2）难以区分含KASH结构域与不含KASH结构域的Nesprin异构体在表型中的各自贡献16；3）在多种细胞类型中，核膜上的Sun蛋白和Nesprin蛋白存在功能冗余，需通过复杂的育种策略才能在小鼠中完全阻断所有SUN-KASH相互作用17；4）同时缺失Nesprin1和Nesprin2的KASH结构域的小鼠在围产期致死，因而无法分析成年个体的表型18。
本方案描述了一种旨在破坏所有SUN-KASH相互作用的新型小鼠模型 在&#160;体内以细胞自主且发育调控的方式实现，从而规避了上述诸多缺陷。该基于 Cre/lox 的小鼠模型依赖于两个关键概念：1）已知任何Nesprin蛋白的KASH结构域均足以在细胞培养系统中将EGFP靶向定位于核膜；2）SUN结构域可广泛地与KASH结构域相互作用，因此任何KASH结构域的过表达都将饱和所有内源性SUN结构域，并以显性负性方式使LINC复合物失活。 17 (图1B）本方案描述了用于验证小脑浦肯野细胞中所有SUN-KASH相互作用均被阻断的组织取材与处理步骤。

<table><tbody><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% 戊二醛溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>组织粘附载玻片</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>免疫笔（ImmuEdge Pen）</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>抗钙结合蛋白抗体（Anti-Calbindin Antibody）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>抗增强型绿色荧光蛋白抗体（Anti-EGFP Antibody）</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>抗Nesprin2抗体（Anti-Nesprin2 Antibody）</td><td></td><td></td><td>先前在参考文献21中描述</td></tr><tr><td>荧光封片介质</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

以细胞特异性方式破坏小鼠linc复合物模型的验证

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

细胞核在发育中及成体组织内的迁移与锚定，高度依赖于一类被称为核骨架与细胞骨架连接体（LINC复合物）的大型大分子蛋白复合物。这些蛋白支架跨越核膜，将细胞核内部与周围细胞质骨架的组分连接起来。LINC复合物由两类在进化上保守的蛋白家族组成：Sun蛋白和含有C端分子特征基序（分别为SUN结构域和KASH结构域）的Nesprin蛋白。Sun蛋白是位于内层核膜的跨膜蛋白，其N端位于核质内的结构域与核纤层相互作用，而其C端的SUN结构域则伸入核周间隙，并与Nesprin的KASH结构域相互作用。经典的Nesprin异构体具有长度可变的N端，该部分伸入细胞质并和细胞骨架的组分相互作用。本实验方案描述了一种显性负性转基因小鼠策略的验证方法，该策略可特异性地在特定细胞类型中破坏内源性的SUN/KASH相互作用。我们的方法基于Cre/Lox系统，规避了生殖系LINC复合物失活模型所伴随的围产期致死性和细胞非自主性表型等多种缺陷。因此，该模型为研究LINC复合物在多种组织发育与稳态过程中的功能提供了有力工具。

本方案展示了利用 Tg(PCP2-Cre) 小鼠将 Tg(CAG-LacZ/EGFP-KASH2) 小鼠模型中 EGFP-KASH2 的表达限制于小脑浦肯野细胞的实用性。在 Tg(PCP2CreCAG-EGFP/KASH2) 后代中，Cre 重组酶在出生后第6天（P6）切除 LacZ/V5 开放阅读框，从而导致 EGFP-KASH2 特异性地在浦肯野细胞中表达（图 2A）。如预期所示，EGFP-KASH2 定位于核膜，表现为细胞核周围 EGFP 阳性的环状信号（图 2B）。为最大化任何生理表型的可检测性，需通过计算与细胞特异性抗体标记共染色的 EGFP-KASH2 阳性细胞所占百分比，以确认在大多数靶细胞中实现了 EGFP-KASH2 的表达。在此示例中，超过 70% 的钙结合蛋白（Calbindin）阳性浦肯野细胞中检测到 EGFP-KASH2 表达（图 2B）。在这些条件下，我们在 10 月龄的 Tg(PCP2CreCAG-EGFP/KASH2) 小鼠中未观察到明显的组织学或行为学表型<s...

核膜蛋白在许多基本生物学过程中发挥着核心作用，并与多种人类疾病相关。本方案描述了一种基于 Cre/Lox 的新型小鼠模型，可实现对 LINC 复合物破坏的时空特异性调控。

以细胞特异性方式破坏小鼠LINC复合物模型的验证

细胞核在发育及成体组织中的迁移与锚定，高度依赖于一类被称为核膜连接蛋白复合物（LInkers of the ...）的大型大分子蛋白组装结构。

本实验的总体目标是展示一种转基因小鼠模型的实用性，该模型可在体内诱导并靶向表达荧光标记的EGFP-Cache Two多肽，并导致内源性连接复合物的破坏。在本实验中，荧光标记的Cache Two的表达将靶向小脑浦肯野细胞。这种遗传学方法可用于探讨连接复合物在不同组织细胞核定位中的关键作用。E-G-F-P-K 2 的诱导型靶向表达具有多项优势。首先，该方法仅需将 cay 小鼠与任意现有的 cruise 品系进行一次杂交育种。其次，该策略可避免在线粒体复合物组分生殖系突变小鼠模型中所观察到的围产期致死现象。最后，该方法可用于在体内研究特定细胞或组织内连接复合物的生理学特性。实验室成员 Chloe Potter 将向您展示在小脑浦肯野细胞中可视化 E-G-F-P-K 2 的各个步骤。首先将clac Z小鼠与PCP二CRE小鼠杂交，以获得PCP二CAG C二小鼠，具体方法见先前发表的文献。当子代小鼠出生后，进行基因型鉴定。按照先前所述方法，鉴定出携带EGFP和Cree转基因的小鼠。配制50毫升含30%蔗糖的PBS溶液，并于负20摄氏度保存，直至在适当年龄进行组织收获的当天使用。在麻醉条件下对小鼠进行经心灌注，以按照书面实验方案所述方法制备脑组织。将分离出的脑组织置于含有10毫升PBS的10厘米组织培养皿中，并将小脑与大脑分离。接下来，使用解剖刀沿矢状面解剖小脑，并将切片转移至30%蔗糖溶液中，于4°C下保存过夜。准备干冰与异戊烷的混合物。让浴液温度平衡5分钟。接下来，用OCT包埋剂填满冷冻模具，并在解剖显微镜下用镊子将解剖好的小脑半侧放入模具中。将小脑放置于模具内，使其靠近小脑中线的被解剖面朝上。然后将冷冻模具转移至干冰异戊烷混合液中，持续五分钟，直至OCT包埋剂在组织样本周围形成坚实的白色基质。将包埋的标本储存于负20摄氏度，直至需要时使用。用标签标记经预处理的多聚赖氨酸载玻片，用于收集组织切片，并将小脑组织块用新鲜OCT包埋剂固定在组织夹持器上。待组织块牢固附着后，安装组织夹持器，并切去40微米厚的切片以去除多余的OCT，直至暴露组织。 设定厚度为 15 µm，并通过轻轻接触 OCT 包埋块与载玻片的多聚赖氨酸包被面来收集切片。将组织切片在 −20 °C 下保存，直至进行染色和成像。准备继续实验时，于避光条件下解冻小脑切片，以防止荧光蛋白褪色。使用疏水性屏障笔，在组织切片的周围绘制一个矩形。向切片中加入约 500 µL 的 4% 多聚甲醛，固定 5 分钟以进行后固定。然后使用真空装置吸取固定液，特别注意避免移液枪头扰动组织切片。轻轻将 PBS 加到载玻片上，避免扰动组织切片。五分钟后，使用真空多道移液器小心吸去液体，重复 PBS 洗涤共三次。接着，向载玻片加入约 500 µL 封闭液，孵育 10 分钟。移除封闭液，然后加入含有钙结合蛋白抗体或Nesin二抗（1:300稀释）的相同溶液进行替换。随后移除抗体溶液，用PBS缓冲液洗涤切片3次。将切片置于室温下避光孵育1小时。接下来，在封闭液中为标记了抗-US Alexa Fluor 594 的玻片配制 1:1000 稀释的抗体溶液，为标记了抗-Alexa Fluor 594 的 Nesprin-2 玻片配制相应稀释的抗体溶液，并将这些溶液避光保存至使用前。轻轻吸去最后一次 PBS 洗涤液，将切片用稀释后的二抗溶液覆盖，在避光条件下孵育一小时。孵育结束后，移除二抗溶液。然后在 PBS 中加入终浓度为 300 纳摩尔的核染料（如 DPI）染色 5 分钟。随后，用 PBS 再冲洗切片两次。尽可能吸除 PBS 溶液，并在组织切片上滴加一滴封片剂。将玻璃盖玻片置于组织切片上，避免产生气泡，并在室温避光条件下静置15至30分钟。然后使用荧光显微镜观察抗体染色和荧光蛋白。对于小脑切片，使用20×或40×物镜。要观察此处所示的 E-G-F-P-C 两个核膜，可在 Fitzy 通道的 cerebellar 切片中直接可视化 E-G-F-P-C 两个。此外，EGFP 与 cow binding 的共定位（后者特异性标记 Purkinje 细胞）证实，E-G-F-P-C 两个的表达局限于 Purkinje 细胞内的细胞。EGFP cache 两个靶向定位于核膜，这由在细胞核周围观察到的 EGFP 阳性、呈 RIM 样模式所表明。在此示例中，超过70%的结合阳性Perkin细胞中检测到EGFP KASH2的表达。EGFP KASH2通过占据可利用的SUN结构域，使内源性nesprin从核膜上被置换。因此，在表达EGFP KASH2的Perkin细胞中，内源性Nesprin2从核膜上被移除。与预期对照一致，不表达E-G-F-P-C2的Perkin细胞仍将在核膜上保留内源性nesin2；而不表达CRE重组酶的细胞，则在整个bikini细胞群体1中均显示核膜上存在NESIN2。因此，可获取CT组织块。E-G-F-P-K2可在约四小时内被可视化。在进行该实验操作时，需牢记 PFF 固定和/或包埋条件的程度可能显著影响表位的抗原性。因此，确定能够保存特定表位的最佳固定条件至关重要。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用 CK 二元转基因小鼠模型，实现 VGFP 开心果蛋白在特定组织中的靶向表达。

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小鼠模型的验证扰乱LINC配合物在细胞特异性的方式

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成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

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通过诱导小鼠大脑皮层中的 Cre-lox 重组 子宫内 电穿孔

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本方案描述了显微注射及 体内...

利用体细胞基因组编辑小鼠模型 体内 显微注射与电穿孔

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