小鼠模型的验证扰乱LINC配合物在细胞特异性的方式
December 10th, 2015
核包膜蛋白在许多基本生物过程中起着核心作用，并与多种人类疾病有关。 该协议描述了一种新的基于 Cre/Lox 的小鼠模型，该模型允许对 LINC 复合物破坏进行时空控制。
本实验的总体目标是说明转基因小鼠模型的有用性，允许荧光标记的 EGFP 缓存的诱导和靶向表达、体内两个肽以及由此产生的内源性连接复合物的破坏。在这个实验中，荧光标记的缓存 2 的表达将靶向小脑 Perkin 细胞。这种遗传方法可以解决有关连接复合物在不同大多数组织内核定位中的作用的关键问题。
E-G-F-P-K 二的诱导性和靶向表达具有几个优点。首先，它需要一个单一的 cay 鼠与任何现有 cruise 品系的繁殖方案。其次，这种方法绕过了在链接复合物成分种系突变小鼠模型中观察到的围产期年龄。
最后，该方法允许研究特定细胞或组织内连接复合物的生理学。体内。实验室成员 Chloe Potter 将向您展示在小脑 Burkin G 细胞中可视化 E-G-F-P-K 2 所需的不同步骤。
开始用 PCP 繁殖 clac Z 小鼠，两只 CRE 小鼠产生 PCP 两只 CAG C 两只小鼠，如以前的出版物中所述。当产生的幼崽出生时，进行基因分型。为了识别那些如前所述同时携带 EGFP 和 Cree 转基因的那些，在 PBS 中制备 50 毫升 30% 蔗糖溶液，并在零下 20 摄氏度下储存，直到适当年龄组织收获之日，在麻醉下对小鼠进行跨式心脏灌注，以便按照书面方案中的描述准备用于解剖的脑组织， 将解剖的大脑放入含有 10 毫升 PBS 的 10 厘米组织培养板中，并将小脑与大脑分开。
接下来，用手术刀在矢状面上解剖小脑，并将切片转移到 30% 蔗糖溶液中，并在 4 摄氏度下储存过夜。准备干冰和两个甲基丁烷的浆液。让浴槽的温度平衡 5 分钟。
接下来，用 OCT 化合物填充冷冻模具，并使用解剖显微镜和一对镊子将解剖的小脑的一半放入模具中。放置小脑，使靠近小脑中线的 bi 解剖表面在模具中朝上。然后将冷冻模具转移到干眼浆液中 5 分钟，直到 OCT 化合物在组织样本周围形成固体白色基质。
将包埋的标本储存在零下 20 摄氏度，直到需要为止。标记预处理的聚赖氨酸载玻片以收集组织切片，并用新鲜的 OCT 将小脑组织块安装在组织支架上。块牢固连接后，安装组织支架并剃除 40 微米切片以去除多余的 OCT，直到达到组织。
将厚度设置为 15 微米，并通过小心地将 OCT 切片与载玻片的聚赖氨酸涂层侧接触来收集切片。将组织切片储存在零下 20 摄氏度，直到进行染色和成像。准备继续时，在黑暗中解冻小脑切片以防止荧光蛋白褪色。
使用疏水屏障笔，在组织切片的周边画一个矩形。向切片中加入约 500 微升 4% 多聚醛 5 分钟以后固定组织。然后使用真空吸出固定剂，特别小心不要用移液管干扰组织切片。
将 PBS 轻轻涂抹在载玻片上，不要干扰组织切片。五分钟后，使用真空移液器小心地去除液体，重复 PBS 冲洗共 3 次。接下来，向玻片中加入约 500 μL 封闭溶液并孵育 10 分钟。
去除封闭溶液，然后用含有 1 至 300 稀释度的 cal 结合或 nesin 两种抗体的相同溶液替换。然后去除抗体溶液并用 PB S3 冲洗玻片 3 次。将玻片在室温下避光孵育 1 小时。
接下来，为奶牛结合标记的载玻片制备 1 至 1000 稀释的抗 US Alexa 地板 5 94 和用于 Nesprin 的两个标记载玻片的抗 Alexa Fluor 5 94 稀释液在封闭溶液中，并将溶液储存在黑暗中，直到需要为止。轻轻去除最终的 PBS，冲洗干净，并用稀释的二抗覆盖切片，在黑暗中放置 1 小时。孵育后，去除二抗溶液。
然后在 PBS 中涂上 300 纳摩尔的核染色剂（如 DPI）5 分钟。然后，在 PBS 中再冲洗切片两次。去除尽可能多的 PBS 溶液，并用一滴封固剂覆盖组织切片。
将玻璃盖玻片放在组织切片的顶部，避免气泡，并在室温下避光放置 15 至 30 分钟。然后使用荧光显微镜观察抗体染色和荧光蛋白。对于小脑切片，请使用 20 x 或 40 x 物镜。
要查看如图所示的 E-G-F-P-C 两个核边缘，E-G-F-P-C two 可以直接在 Fitzy 通道的小脑切片中可视化。此外，EGFP 与 cow 结合的共定位（特异性标记 Perkin 细胞）证实了 E-G-F-P-C 两种表达仅限于 Perkin 细胞内的 perkin 细胞。EGFP 缓存 2 靶向核膜，如在细胞核周围观察到的 EGFP 阳性 RIM 样模式所示。
在这个例子中，在超过 70% 的奶牛结合阳性 Perkin 细胞中检测到 EGFP 缓存 2 表达。EGFP 缓存 2 通过可用太阳结构域的饱和从核膜中置换内源性 nesprin。因此，内源性 NESIN 2 从表达 EGFP 缓存 2 的 Perkin 细胞的核包膜中置换出来。
虽然不表达 E-G-F-P-C 2 的 Perkin 细胞如预期的那样在核膜处保留内源性 nesin 2，但不表达 CRE 重组酶的 NESIN 2 在整个比基尼细胞群的核膜上显示 NESIN 2。所以组织 CT 块是可用的。E-G-F-P-K 2 可以在大约 4 小时内可视化。
在尝试此程序时，重要的是要记住 PFF 固定和/或包埋条件的程度会极大地影响表位的抗原性。因此，确定保留特定表位的最佳固定条件非常重要。看完这个视频，您应该对如何使用 CK 双转基因小鼠模型将 VGFP 腰果的表达靶向特定组织有一个很好的了解。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本研究介绍了一种转基因小鼠模型，该模型能够诱导和定向表达带荧光标签的EGFP cache。该模型旨在破坏内源性连接复合物，提供有关其在核定位中作用的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 细胞生物学
背景
- 核膜蛋白对于各种生物过程至关重要。
- LINC复合物的破坏与多种人类疾病有关。
- 现有模型因生殖细胞突变而面临局限性。
- 本研究旨在用新方法克服这些局限性。
研究目的
- 开发用于研究LINC复合物的小鼠模型。
- 实现对连接复合物破坏的时空控制。
- 调查连接复合物在核定位中的作用。
所用方法
- 创建基于Cre/Lox的转基因小鼠模型。
- 诱导表达带荧光标签的EGFP cache。
- 靶向表达至小脑Purkinje细胞。
- 分析对内源性连接复合物的影响。
主要结果
- 成功将带荧光标签的cache two靶向到特定细胞。
- 证明该模型能够破坏连接复合物。
- 对LINC复合物在细胞过程中作用的见解。
- 解决核生物学关键问题的潜力。
结论
- 转基因小鼠模型为研究提供了有价值的工具。
- 可诱导表达允许实验中的精确控制。
- 这种方法可能导致对核定位的更好理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cell-specific disruption of LINC complexes using a transgenic mouse model enables precise interrogation of nuclear-cytoskeletal interactions in development and tissue homeostasis. This approach overcomes the limitations of germline knockout models, supporting mechanistic de-risking and target validation in disease-relevant systems. The model's inducibility and specificity provide predictive confidence for early discovery and translational research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of LINC complex components in specific cell types.
- Supports mechanistic de-risking by isolating nuclear positioning pathways.
- Facilitates hypothesis testing for nuclear-cytoskeletal linkage roles in tissue biology.
- Improves predictive confidence for target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Provides validated biological systems for downstream phenotypic screening.
- Enables reproducible, quantitative imaging of nuclear envelope disruptions.
- Supports assay standardization through cell-type specific genetic control.
- Prepares platforms for reliable compound evaluation targeting nuclear architecture.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying nuclear positioning defects.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation in tissue-specific contexts.
- De-risks translational biomarker strategies by enabling cell-autonomous analysis.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for nuclear envelope targets.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation, enabling cell-specific hypothesis testing and quantitative readouts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking of nuclear-cytoskeletal interactions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay development.
- Analytics: Provides measurable displacement of endogenous proteins for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical work in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable genetic platform adaptable to diverse cell types and tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in nuclear positioning studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of genetic disruption models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling targeted validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of nuclear envelope targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic mouse breeding and Cre/Lox genetic systems.
- Needs access to fluorescence imaging and quantitative analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and staining protocols.
- Adaptation to other cell types may require additional Cre driver lines.
- Fixation and embedding conditions must be optimized to preserve antigenicity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Preparation of Mice and Materials for Dissection and Tissue Collection
2:06
Dissection and Tissue Collection
2:38
Tissue Processing and Sectioning
4:06
Staining and Imaging of Cerebellum
6:41
Results: Disruption of Endogenous LINC Complexes in Cerebellar Purkinje Cells
8:07
Conclusion
