以细胞特异性方式破坏小鼠LINC复合物模型的验证

本实验的总体目标是展示一种转基因小鼠模型的实用性，该模型能够实现荧光标记的EGFP-CaChe两肽在体内的可诱导和靶向表达，并导致内源性连接复合物的破坏。在本实验中，荧光标记的CaChe两肽的表达将被靶向至小脑浦肯野细胞。这种遗传学方法可用于回答关于连接复合物在不同组织细胞核定位中所起关键作用的重要科学问题。

E-G-F-P-K 二型的可诱导和靶向表达具有多个优势。首先，该方法仅需将 cay 小鼠与任何现有的 cruise 品系进行一次杂交育种。其次，该策略避免了在线粒体复合物组分的生殖系突变小鼠模型中所观察到的围产期致死性。

最后，该方法可用于研究特定细胞或组织内连接复合物的生理学特性。在活体条件下。实验室成员 Chloe Potter 将向您展示在小脑浦肯野细胞中可视化 E-G-F-P-K 2 的各个步骤。

首先将clac Z小鼠与PCP two CRE小鼠杂交，以获得PCP two CAG C two小鼠，具体操作如先前发表的文献所述。当子代小鼠出生后，进行基因型鉴定。按照此前所述方法，筛选出同时携带EGFP和Cree转基因的小鼠。配制50毫升含30%蔗糖的PBS溶液，并于负20摄氏度保存，直至在适当年龄进行组织取材。在组织采集当天，对小鼠在麻醉状态下进行经心灌注，以按照书面实验方案所述方法制备脑组织。将解剖所得脑组织置于含10毫升PBS的10厘米组织培养皿中，并将小脑与大脑分离。

接下来，使用解剖刀沿矢状面解剖小脑，并将切片转移至30%蔗糖溶液中，于4°C条件下过夜保存。制备干冰与2-甲基丁烷的混合物。让浴液温度平衡5分钟。

接下来，用OCT包埋剂填充冷冻模具，然后在解剖显微镜下用一对镊子将解剖好的小脑半侧放入模具中。将小脑组织置于模具内，使其靠近小脑中线的解剖切面朝上。随后将冷冻模具转移至干冰乙醇混合液中，放置5分钟，直至OCT包埋剂在组织周围形成坚实的白色基质。

将包埋好的样本保存在负20摄氏度，直至需要时使用。标记经预处理的多聚赖氨酸载玻片用于收集组织切片，并用新鲜OCT包埋剂将小脑组织块固定在组织夹持器上。待组织块牢固附着后，安装组织夹持器，并切去40微米厚的切片以去除多余的OCT，直至暴露组织。

将厚度设为15微米，并通过轻轻接触OCT切片与载玻片的多聚赖氨酸包被面来收集切片。将组织切片置于负20摄氏度保存，直至进行染色和成像。准备继续实验时，在避光条件下解冻小脑切片，以防止荧光蛋白褪色。

使用疏水屏障笔在组织切片周围画一个矩形。向切片中加入约 500 微升 4% 多聚甲醛，固定 5 分钟以进行后固定。然后使用真空装置吸取固定液，特别注意避免移液器扰动组织切片。

轻轻将 PBS 加到载玻片上，避免扰动组织切片。五分钟后，使用真空多道移液器小心吸去液体，重复 PBS 漂洗共三次。接着，向载玻片加入约 500 µL 封闭液，并孵育 10 分钟。

移除封闭液，然后替换为含有钙结合蛋白抗体或nesin two抗体一至300倍稀释液的相同溶液。随后移除抗体溶液，用PBS清洗载玻片3次。将载玻片在室温下避光孵育1小时。

接下来，在封闭液中分别制备抗-US Alexa Fluor 594 一至一千倍稀释液用于标记牛结合位点的切片，以及抗-Alexa Fluor 594 一至一千倍稀释液用于标记Nesprin-2的切片，并将这些溶液避光保存直至使用。轻柔地去除最后的PBS洗涤液，用稀释后的二抗溶液覆盖组织切片，在避光条件下孵育1小时。孵育结束后，移除二抗溶液。

然后在 PBS 中加入终浓度为 300 纳摩尔的核染料（如 DPI）染色 5 分钟。随后，用 PBS 再冲洗切片两次。尽可能去除 PBS 溶液，并在组织切片上滴加一滴封片剂。

将玻璃盖玻片置于组织切片上，避免产生气泡，并在室温避光条件下静置15至30分钟。随后使用荧光显微镜观察抗体染色和荧光蛋白。对于小脑切片，使用20倍或40倍物镜。

要观察此处所示的 E-G-F-P-C 两个核膜，可在小脑切片的 Fitzy 通道中直接可视化 E-G-F-P-C 二。此外，EGFP 与标记浦肯野细胞的 cow binding 共定位，证实 E-G-F-P-C 二的表达局限于浦肯野细胞内的细胞。EGFP 缓存二靶向定位于核膜，表现为在细胞核周围观察到的 EGFP 阳性、类似核膜孔复合体（RIM）的环状信号模式。

在此示例中，超过70%的Cow binding阳性Perkin细胞中检测到EGFP cache 2的表达。EGFP cache 2通过占据可利用的sun结构域，使内源性nesprin从核膜上发生置换。因此，在表达EGFP cache 2的Perkin细胞中，内源性NESIN 2被从核膜上置换下来。

与预期对照一致，不表达E-G-F-P-C2的Perkin细胞在核膜上保留内源性nesin2；而不表达CRE重组酶的细胞则在整个bikini细胞群体1中均显示核膜上存在NESIN2。因此，可获得CT组织块。E-G-F-P-K2可在约四小时内被可视化。

在进行该实验操作时，重要的是要记住，PFF固定和/或包埋条件的程度会显著影响目标表位的抗原性。因此，确定能够保存特定表位的最佳固定条件至关重要。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用CK二元转基因小鼠模型，实现VGFP腰果蛋白在特定组织中的靶向表达。