胚胎干细胞培养与分化

胚胎干细胞（ES 细胞）具有一些独特的特性，使其区别于普通的成体细胞。因此，科学家们设计了特殊的培养技术，以维持或利用这些特性。在适当培养条件下，ES 细胞能够无限分裂，实现自我增殖。同时，通过改变培养条件，ES 细胞可被诱导分化为人体内几乎任何类型的细胞；这种能力被称为“多能性”。

在本视频中，您将学习如何培养和传代 ES 细胞以保持其独特特性，如何诱导 ES 细胞分化形成特定细胞类型，以及当前研究人员如何应用并改进 ES 细胞的培养与分化技术。

在详细介绍胚胎干细胞（ES细胞）培养的操作步骤之前，首先需要了解哪些因素会抑制或促进ES细胞的分化。为了使ES细胞保持其多能性和自我更新的独特特性，必须在含有特定因子的培养基中进行培养，以抑制其自发分化。

最常用的方法是将ES细胞培养在一层“饲养层”细胞上，通常是小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。饲养层细胞可向ES细胞提供某些因子（如激活素A），帮助维持ES细胞的未分化状态。

近年来，科学家还开发了无饲养层的培养方法，即在成分明确的培养基中添加必要的因子来培养ES细胞。这种方法减少了实验变异性，并去除了ES细胞培养中的非人源成分，这是临床应用的前提条件。

ES细胞的另一个特点是它们天然倾向于以细胞簇或克隆的形式生长，并且在被解离为单个细胞时存活率较低，尤其是人类ES细胞。因此，传代培养人类ES细胞通常需要通过机械“挑取”法，将细胞以完整的细胞团块形式保留下来。

当ES细胞在非黏附条件下培养时，会形成三维聚集体，称为拟胚体（embryoid bodies, EBs），在其中ES细胞可分化为各种不同类型的细胞。通过改变分化条件，例如在培养基中添加特定的生长因子，科学家正在开发引导ES细胞定向分化为特定细胞类型的方法。

现在您已经了解了胚胎干细胞（ES细胞）维持与分化的原理，接下来我们来看看如何在MEF饲养层上培养和传代ES细胞。

MEF来源于早期小鼠胚胎，随后通过化学试剂或辐射处理使其失活，以防止其进一步分裂。失活后的MEF应在开始培养ES细胞前至少一天接种至明胶包被的组织培养皿中。当饲养层细胞完全贴壁后，将冻存的ES细胞解冻并接种到培养皿中。

在接下来的几天内，ES细胞将生长形成较大的细胞集落。在集落开始相互接触并融合之前，应对ES细胞培养物进行传代。应观察ES细胞的形态，判断是否出现分化迹象。未分化的ES细胞集落通常边界清晰、形态均一，而分化后的细胞则呈现暗淡、不规则的“鹅卵石”样外观。

如果集落中分化细胞比例达到70%或更高，或者细胞稀疏，应通过机械方法切下未分化的集落，并转移至新的饲养层培养皿中。否则，可直接去除已分化的区域或集落，然后继续进行传代操作。

在清除分化集落后，加入蛋白酶（如胶原酶），在37°C孵育适当时间以使细胞从培养皿上脱落。随后加入新鲜ES细胞培养基以终止酶反应。通过机械吹打将集落从培养皿上分离，并转移至离心管中，通过轻柔吹打将其分散为所需大小的细胞团块。ES细胞经离心收集后，重悬于ES培养基中，接种至预先准备好的饲养层培养皿中。

学习了如何传代胚胎干细胞后，让我们来看一种更常用的将胚胎干细胞分化为拟胚体的技术——悬滴法。

首先，借助胶原酶等蛋白水解酶将胚胎干细胞解离，并用含有特定谱系分化因子的培养基稀释至所需浓度。然后将胚胎干细胞悬液以液滴形式滴加到细菌培养皿的皿盖上。迅速将皿盖倒置并放置在培养皿上，使培养液滴倒挂，从而让拟胚体得以发育。

大约两天后，可收集含有拟胚体的液滴，并接种至非黏附性培养板中进行进一步培养。在目标细胞谱系所需的适当时间点，将拟胚体重新接种至明胶包被的黏附性组织培养皿中，以继续分化。

在了解了胚胎干细胞（ES 细胞）培养与分化的基本技术之后，接下来我们探讨如何根据特定的实验需求对其进行优化与调整。

如前所述，在不同的培养条件下，可引导 ES 细胞向特定的细胞类型分化。在本实验中，科研人员利用人 ES 细胞成功生成了运动神经元。该过程首先是在正在分化的拟胚体中添加特定因子，引导其向神经谱系发育，随后通过特定化学物质及培养条件，进一步将这些细胞特异性地转化为运动神经元。采用类似的方法，研究人员也已成功将 ES 细胞分化为具有节律性搏动功能的心肌细胞。

由于 ES 细胞的分化过程模拟了胚胎在自然发育过程中所经历的事件，因此我们也可利用这些细胞来研究早期胚胎发育的生物学机制。目前研究的其中一个现象是 X 染色体失活（X-chromosome inactivation, XCI），即在雌性哺乳动物的每个细胞中，两条 X 染色体中的一条被沉默的至关重要过程。通过在发育中的拟胚体（EBs）中观察特定 RNA 和蛋白质的分布，科学家已获得了关于 XCI 生物学机制的宝贵见解。

最后，为了提高 ES 细胞实验的一致性与效率，科研人员正不断尝试开发更优的 ES 细胞培养技术。其中一种方法是将 ES 细胞以单层形式培养，称为非克隆型单层培养（non-colony type monolayer culturing, NCM）。

请记住，人 ES 细胞在不以三维聚集体形式生长时往往状态不佳？研究人员已证实，一类名为 ROCK 抑制剂的化学物质可提高解离后 ES 细胞的存活率，使其能够以单细胞悬液的形式传代，并以高密度接种。NCM 技术的优势在于，每个细胞都能更均匀地接触培养基中的生长因子和营养物质，从而降低细胞群体内的异质性，同时更便于大规模培养 ES 细胞。

您刚刚观看了 JoVE 关于如何培养和分化胚胎干细胞的视频。您现在应该了解了维持胚胎干细胞未分化状态所需的关键因素，以及如何利用胚胎干细胞的多能性在体外生成特定的细胞类型。未来，科学家们将致力于开发更高效且定义明确的培养与分化条件，以产生可用于再生医学应用的特化细胞类型。感谢您的观看！