Name: 含有金纳米棒蜂窝车辆的制备及光声分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学习利用肿瘤相关巨噬细胞作为细胞载体，负载金纳米棒进行光声成像的方法。该技术通过体外构建生物界面，实现对肿瘤靶向递送等离子体颗粒，提高成像剂的光学和生化稳定性，为癌症诊断提供新策略。

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本工作部分由托斯卡纳大区和欧洲共同体在ERANET+项目LUS BUBBLE和BI-TRE框架内资助。

注意：所有金纳米棒的浓度均以名义上的金摩尔浓度表示。为便于与其他研究进行比较，请注意，在本实验中，1 M 金大约相当于 20 µM 金纳米棒。
1. 阳离子金纳米棒的制备
注意：本方法首先采用抗坏血酸对 HAuCl4 进行自催化还原，合成由十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）包覆的金纳米棒，该步骤依据 Nikoobakht et al.25 提出的方案，并参照 Ratto et al.26 的方法进行调整。随后，通过结合聚乙二醇链10,11,27,28 和季铵化合物22，对这些金纳米棒进行修饰，以提高其生物相容性及对血浆膜的亲和力。
<ol>
	<li>通过两次离心（12,000 × g，30 分钟）和倾倒操作，纯化 24 ml 浓度为 450 µM Au 的 CTAB 封端金纳米棒。确保本方案中所有离心步骤的残留体积与初始体积之比约为 1/200 或更低。使用 500 µM 水相 CTAB 作为洗涤液，最后将颗粒转移至 6 ml 含有 500 µM CTAB 和 0.005% (v/v) 吐温 20 的 100 mM 乙酸盐缓冲液（pH 5）中。</li>
	<li>加入 30 µl 10 mM 水相 α-甲氧基-ω-巯基聚乙二醇（分子量 ~ 5,000），在 37 °C 下反应 30 分钟。</li>
	<li>加入 30 µl 100 mM 的 (11-巯基十一烷基)-N,N,N-三甲基溴化铵二甲基亚砜溶液，在 37 °C 下静置反应 24 小时。</li>
	<li>随后加入 18 ml 水中含 0.005% (v/v) 吐温 20 的溶液，并通过四次离心（12,000 × g，30 分钟）和倾倒操作纯化这些颗粒。使用水中含 0.005% (v/v) 吐温 20 的溶液作为洗涤液，最后将颗粒转移至 2.4 ml pH 7.4 的无菌 PBS 中。最终金的标称浓度为 4.5 mM。</li>
</ol>
2. 小鼠巨噬细胞加载金纳米棒
<ol>
	<li>使用单核细胞/巨噬细胞系 J774a.1，以及添加了 10% 胎牛血清、1 mM 谷氨酰胺、100 单位/毫升青霉素和 100 µg/ml 链霉素的 DMEM 作为培养基。将 5 × 105 个细胞接种于四个直径为 60 mm 的培养皿中，培养 24 小时，使其在消化前达到亚汇合状态（参见步骤 2.2）。
	<ol>
		<li>在整个实验过程中，将细胞维持在标准培养条件下（37 °C、5% CO2、95% 空气和 100% 相对湿度）。操作细胞时使用层流柜及适当个人防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>24 小时后，用阳离子金纳米棒对细胞进行负载，并准备将其包埋于壳聚糖薄膜中：
	<ol>
		<li>为使颗粒被细胞摄取，向每个培养皿中加入一份 PBS 配制的 4.5 mM 阳离子金纳米棒溶液，使金的终浓度为 100 µM。将培养皿继续孵育 24 小时。</li>
		<li>随后在光学显微镜下观察细胞，确认细胞状态良好且已完成摄取。细胞应呈现正常形态，并含有多个深色的胞内囊泡。用细胞刮刀消化细胞，合并两个培养皿的细胞，以获得后续步骤所需的足够细胞数量（至少 2 × 106 个细胞），然后离心（120 × g，6 分钟）以去除过量的阳离子金纳米棒。细胞沉淀应几乎呈黑色。</li>
		<li>将沉淀重悬于 2 ml PBS 中，使用血细胞计数板进行细胞计数。取含有 2 × 106 个细胞的悬液离心（120 × g，6 分钟），并将细胞沉淀固定于 2 ml 含 3.6%（w/v）甲醛的 PBS 溶液中，室温固定 10 分钟。最后用 PBS 洗涤沉淀三次，每次均通过离心（120 × g，6 分钟）去除固定剂。使用 PBS 作为洗涤液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 将巨噬细胞包埋入壳聚糖薄膜中
注意：利用壳聚糖的特殊性质26,27,28,29 ，可制备含有经阳离子金纳米棒染色的巨噬细胞的仿生体模。与琼脂糖等其他水凝胶相比，壳聚糖能够形成强度更高、厚度更薄的薄膜，这对光声显微成像至关重要6。这些体模的制备基于先前的方案29,30,31，并根据下述内容进行了一些修改30。
<ol>
	<li>制备酸化（pH 4.5，通过添加乙酸获得）且黏稠的3%（w/v）低分子量壳聚糖（平均分子量120 kDa）溶液，充分混合后于40 °C下均质化24小时。</li>
	<li>随后，将含有阳离子金纳米棒的鼠源巨噬细胞（2 × 106 个细胞）与500 µl壳聚糖溶液混合。</li>
	<li>为获得约50 µm厚的仿组织体模，将250 mg上述混合物倒入1.91 cm2的聚苯乙烯模具中，并在氮气流下放置24小时。之后，用500 µl 1 M NaOH处理这些样品以诱导交联，并用10 ml超纯水冲洗。</li>
</ol>
4. 光声转换稳定性的测试
注意：通过使用自制装置进行的PA实验（如参考文献6所述）来研究PA转换的稳定性。
<ol>
	<li>将含有巨噬细胞的壳聚糖膜悬浮于去离子水中，例如使用浸入培养皿中的塑料支架，使膜与培养皿底部保持约 5 mm 的距离。将该培养皿置于微米级 XY 位移台上，以控制样品位置。</li>
	<li>将脉冲持续时间约为5纳秒的激光束聚焦，并使其与金纳米棒的纵向等离激元共振带共振例如，由调Q Nd:YAG激光器的三倍频光泵浦的光学参量振荡器产生，波长范围为400 - 2,500 nm，脉冲持续时间为5 nsec，光斑直径约300 µm，垂直照射薄膜表面。
	<ol>
		<li>在激光出口前方放置一个衰减器以调节激光能量密度，并使用分束器将部分激光束聚焦到能量计上例如，一个热释电探测器）并监测能量密度波动。保持光能量密度低于约1 mJ/cm2 每次脉冲期间进行准直时，请佩戴合适的激光防护眼镜。激光开启时，务必使用适当的激光安全护目镜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将超声换能器（频率范围为1 - 20 MHz）浸入培养皿中，使其距离薄膜表面约2 mm，并通过微米级平移和旋转调节装置调整其位置，以最大化薄膜发出的光声信号。</li>
	<li>确定探针注量 FLO 不会损坏样品6:
	<ol>
		<li>在样品的任意位置以约 1 mJ/cm 的能量密度进行辐照2 每次脉冲至少重复500次。对每次脉冲，使用示波器采集超声换能器对应的光声信号以及能量计测得的激光能量密度。将平均能量密度记为 FLO试验.</li>
		<li>根据脉冲次数计算光声信号的强度，以峰峰值幅度表示。为抵消激光强度波动的影响，将每个光声信号的幅度归一化为其自身能量密度与F的比值。LO试验分析归一化光声强度随脉冲次数的变化趋势，并验证其随时间的稳定性。</li>
		<li>若出现不稳定情况，使用较低的 F 值重复步骤 4.4.1 至 4.4.3LO试验在稳定性情况下，使用 F 值重复进行LO试验 高出约10%，直至出现不稳定性。设定探针光通量FLO 作为F的第二高值LO试验 确保稳定性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量重塑阈值能量密度：
	<ol>
		<li>选择样本的另一个随机点，探测平均PA强度（ILOa超过500次脉冲，频率为FLO.</li>
		<li>设定一个大于 F 的标称注量LO 并递送50次脉冲，将其平均能量密度记为Fexc.</li>
		<li>探测平均PA强度（ILOb超过500次脉冲，频率为FLO 再次计算比值 R = ILOb / ILOaR值小于1表明样品的光学性质发生了不可逆变化。</li>
		<li>使用微米级XY载物台移动薄膜，随机改变样品的测量位置。采用不同的F值，重复步骤4.5.1至4.5.4exc，以便取若干个 R 值，分别位于1以下、接近1以及1以上。15个点是合理的。</li>
		<li>绘制 R 随 F 变化的函数图exc 并确定形变阈值光通量 Fth 即当R值开始因超出统计不确定性而偏离1时的数值。6</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ratto, F., Matteini, P., Centi, S., Rossi, F., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanorods+as+new+nanochromophores+for+photothermal+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Gold nanorods as new nanochromophores for photothermal therapies.</a> J. Biophotonics. (1-2), 4-41 (2011).</li>
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<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reexamination+of+active+and+passive+tumor+targeting+by+using+rod-shaped+gold+nanocrystals+and+covalently+conjugated+peptide+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">A reexamination of active and passive tumor targeting by using rod-shaped gold nanocrystals and covalently conjugated peptide ligands.</a> ACS Nano. 4 (10), 5887-5896 (2010).</li>
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<li>Mazzoni, M., Ratto, F., Fortunato, C., Centi, S., Tatini, F., Pini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+Decoupling+in+Aggregates+of+Silanized+Gold+Nanorods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Partial Decoupling in Aggregates of Silanized Gold Nanorods.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (34), 20018-20025 (2014).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

靶向肿瘤相关巨噬细胞的概念正逐渐成为一种强大的抗癌策略34,35,36。在此，我们并非破坏这些细胞，而是利用其趋向性，将其招募为细胞载体，将金纳米棒递送至肿瘤内部。这一策略需要对颗粒进行精心设计，并考虑其在细胞内的整合与表征。我们发现，负载阳离子金纳米棒的小鼠巨噬细胞的光稳定性并未因颗粒被限制在内吞囊泡中而受到影响，这表明其等离子体耦合和交叉过热效应并不显著。我们推测，聚乙二醇（PEG）链的存在以及非共振形态（如金纳米球）的掺杂，可防止颗粒之间过于紧密的接触——这种接触距离分别约为颗粒直径17（约10 nm）和一个热扩散长度（在5纳秒内约30 nm），而这正是发生等离子体耦合和交叉过热的临界距离。
该方案在粒子设计及其光稳定性研究方面相较于现有方法具有创新性。步骤1中金纳米棒的设计结合了Vigderman et al.22 的观察结果，即季铵化合物能够驱动金纳米棒大量进入内吞囊泡，以及带正电荷特性的细胞穿透剂<s...

在过去十年中，各种等离激元颗粒（如金纳米棒、纳米壳和纳米笼）因其在生物医学光学中的应用而受到广泛关注1,2,3,4。与传统的金纳米球不同，这些新型颗粒在近红外（NIR）窗口具有共振特性，该窗口可实现光在生物组织中的最深穿透，并对内源性成分提供最高的光学对比度1。这一特性激发了其在光声（PA）成像和肿瘤光热消融等创新应用中的研究兴趣。然而，多个问题限制了这些颗粒的临床应用。例如，其光学激发往往导致颗粒过热，并使其功能形态向更接近球形的结构转变，从而引发光不稳定性5,6,7,8,9。另一个在科学界备受关注的问题是这些颗粒向肿瘤部位的系统性递送。具体而言，金纳米棒的尺寸既有利于穿透具有增强通透性和滞留效应的肿瘤组织，又易于与特异性恶性标志物探针偶联，因此被认为可通过直接注射进入血液循环的策略是可行的10,11,12,13。然而，该途径仍存在挑战，大多数颗粒在体内循环过程中会被单核吞噬细胞系统捕获10,11,12。此外，颗粒在体内循环后的光学和生化稳定性也令人担忧14。当颗粒失去胶体稳定性并发生聚集时，其等离激元特性及热传导动力学会受到等离激元耦合15,16,17 和交叉过热18的影响。
近年来，利用肿瘤相关巨噬细胞趋向性的理念已成为一种明智的替代策略19,20,21这些细胞具有天然的高特异性识别和浸润肿瘤的能力。因此，一种研究思路是从患者体内分离这些细胞，并将其负载金纳米棒 体外 然后将其回输至患者体内，旨在利用这些细胞作为负责递送的载体。另一个优势是能够更好地控制颗粒的光学和生物化学稳定性，因为其生物界面将被构建 体外然而，这些细胞载体作为光学对比剂的性能仍需进行深入分析。
在本研究中，我们描述了用于癌症光声成像的含金纳米棒细胞载体的制备方法及其关键问题。聚乙二醇化的金纳米棒通过修饰季铵化合物22，以获得阳离子特性，预期可增强其与质膜的相互作用23,24。这些颗粒可被大多数类型的细胞高效且非特异性地摄取，且有望不会显著干扰细胞的生物学功能。小鼠巨噬细胞每细胞可负载高达200̇,000个阳离子金纳米棒，这些纳米棒被限制在紧密的内吞囊泡中。此种构型可能引发关注，因为等离子体耦合及囊泡内交叉过热的风险存在。因此，将巨噬细胞包埋于模拟生物组织的生物聚合物水凝胶中，以验证从培养基转移到内吞囊泡过程中，颗粒的光声转换稳定性是否大部分得以保留。我们制定了有效的测量标准，以评估在光声成像密切相关条件下光声转换稳定性的表现。在施加典型重复频率为10 Hz的50个激光脉冲序列后，于光学不稳定的初始阶段设定一个形变阈值。
我们相信，这些结果可能为开发将等离子体颗粒递送至肿瘤的新策略提供推动力。

<table><tbody><tr><td>十六烷基三甲基溴化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6269</td><td>用于合成金纳米棒</td></tr><tr><td>三水合氯化金(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td>用于合成金纳米棒</td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6506</td><td>用于合成金纳米棒</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>用于合成金纳米棒</td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>用于合成金纳米晶种</td></tr><tr><td>甲氧基聚乙二醇硫醇（MeO-PEG-SH）</td><td>Iris Biotech</td><td>PEG1171</td><td>用于金纳米棒的聚乙二醇化修饰，分子量约为 5,000 Da。</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>用于金纳米棒的聚乙二醇化修饰及溶解壳聚糖</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>用于金纳米棒的聚乙二醇化修饰</td></tr><tr><td>(11-巯基十一烷基)-&lt;em&gt;N,N,N&lt;/em&gt;-三甲基溴化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>733305</td><td>用于通过季铵化合物修饰金纳米棒</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>用于溶解(11-巯基十一烷基)-&lt;em&gt;N,N,N&lt;/em&gt;-三甲基溴化铵</td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>用于离心聚乙二醇化修饰的金纳米棒</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>用于在细胞孵育前悬浮金纳米棒以及处理细胞沉淀</td></tr><tr><td>J774a.1</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>小鼠单核细胞/巨噬细胞系</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-707F</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td>需添加至细胞培养基中</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>需添加至细胞培养基中</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>需添加至细胞培养基中</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>NEST</td><td>705001</td><td>细胞培养皿</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>EuroClone</td><td>ES7018</td><td>用于剥离细胞</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Fluka</td><td>47630</td><td>用于固定细胞</td></tr><tr><td>低分子量壳聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448869</td><td>脱乙酰度 75-85%，分子量约为 120,000 Da。</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306576</td><td>用于使壳聚糖不溶并形成水凝胶</td></tr><tr><td>聚苯乙烯细胞培养板</td><td>NEST</td><td>702011</td><td>用作制备壳聚糖水凝胶的模具</td></tr><tr><td>由Q开关Nd:YAG激光器三倍频泵浦的光学参量振荡器</td><td>Continuum, Santa Clara, USA</td><td>Surelite OPO plus</td><td>光声测试的光学激发源</td></tr><tr><td>热电探测器&amp;nbsp;</td><td>Gentec, Quebec, Canada</td><td>QE8SP</td><td>用于监测光声测试中的光通量</td></tr><tr><td>预放大针式水听器</td><td>Precision Acoustic, Dorset, UK</td><td>传感器直径1 mm，频率范围1-20 MHz</td><td>用于测量光声信号</td></tr></tbody></table>

含金纳米棒的细胞载体的制备与光声分析

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

金纳米棒因其在近红外窗口具有强光学吸收、低细胞毒性以及靶向肿瘤的潜力，在癌症的光热消融和光声成像等多种生物医学应用中备受关注。然而，金纳米棒向肿瘤部位的有效递送仍然是一个挑战。一种创新策略是利用肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤的趋向性，将金纳米棒负载于这些细胞中实现靶向输送。 体外在此，我们描述了含有金纳米棒的细胞载体的制备及其光声检测方法。聚乙二醇化的金纳米棒经季铵盐化合物修饰，以获得阳离子特性。当这些颗粒与普通培养皿中的小鼠巨噬细胞接触时，可被大量内吞进入内吞囊泡。随后，将这些细胞包埋于生物聚合物水凝胶中，以验证颗粒在纳入细胞载体后仍能保持其光声转换的稳定性。我们相信，这些结果可能为开发将等离激元颗粒递送至肿瘤的新策略提供新的启发。

本文展示了含有金纳米棒的细胞载体用于癌症光声成像的可行性，并展示了该方案的典型实验结果。
透射电子显微镜（TEM）图像 图1 显示步骤1后颗粒的典型形态以及步骤2后的细胞载体情况。颗粒和细胞用于透射电子显微镜成像的制备方法 elsewhere 有描述17阳离子型金纳米棒在巨噬细胞内大量聚集，而巨噬细胞保持正常的形态。这些颗粒被限制在紧密的内吞囊泡内。
图 2a 显示了在第3步之后，含有阳离子金纳米棒并分散于壳聚糖仿组织中的巨噬细胞的光学透射图像。如该显微照片所示，壳聚糖水凝胶包埋并未影响细胞形态。细胞在样品中分布均匀。不含细胞但含有金纳米棒的壳聚糖薄膜对照组呈均质状态。 图2b 表明当金纳米棒被巨噬细胞摄取后，...

我们展示了用于癌症光声成像的含金纳米棒细胞载体的制备方法，并探讨了其可行性。

金纳米棒由于其在癌症的光热消融和光声成像等生物医学应用中的潜力而备受关注，这得益于……

本方案的总体目标是利用含有金纳米棒的细胞载体作为一种创新策略，将等离激元粒子递送至肿瘤。我们的方案有助于回答一些关键问题，推动利用外源性对比剂进行癌症成像和治疗的光声及光热方法的发展。该方法基于肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤的趋向性，实现等离激元粒子向肿瘤的递送。该方法旨在从患者体内分离这些细胞，在体外将等离子体颗粒载入细胞，然后将其重新注入宿主体内，以用作雌激素载体。这种方法的一个优势在于能够更有效地控制颗粒的光学和生物化学稳定性，因为其生物界面完全在体外构建而成。首先，使用两次离心法纯化6毫升以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）封端的金纳米棒，金浓度为450 µM，离心后倾去上清，并用500 µM的十六烷基三甲基溴化铵水溶液洗涤。然后，向含有金颗粒沉淀的容器中加入1.5毫升含西曲溴铵和聚山梨酯20的100毫摩尔/升乙酸盐缓冲液。接着，加入7.5微升10毫摩尔/升的α-甲氧基-ω-巯基聚乙二醇水溶液，在37摄氏度下反应30分钟。随后，加入7.5微升100毫摩尔/升的巯基十一烷基三甲基溴化铵二甲基亚砜溶液。然后，将反应物在37摄氏度下静置24小时。24小时后，加入4.5毫升含0.005%聚山梨酯20的水溶液。接着，使用该温和的聚山梨酯20溶液，通过四次离心和倾倒循环纯化颗粒。最后，将颗粒转移至600 µL无菌磷酸盐缓冲液中。此时金的标称浓度应为4.5 mmol/L。细胞准备：在补充型达尔伯克改良伊格尔培养基中，将五十万个单核巨噬细胞接种于两块60 mm培养皿中，培养24小时。24小时后，将细胞培养基更换为新鲜培养基，并加入制备好的阳离子金纳米棒，使每个培养皿中金的终浓度为100微摩尔（µM）。然后继续培养24小时。次日，在显微镜下观察细胞。细胞应具有正常的形态，并含有大量深色的细胞内囊泡。如果细胞状态良好，用新鲜培养基洗涤，用细胞刮刀刮下细胞，并将两皿细胞合并，以获得至少两百万个细胞进行收集。随后，以120 ×g离心6分钟，以去除多余的阳离子金纳米棒。弃去上清液。细胞沉淀应呈深黑色。用2毫升磷酸盐缓冲液重悬沉淀，使用血细胞计数板进行细胞计数。然后，混合含有两百万个细胞的悬液，并在120 ×g条件下离心6分钟。用2毫升3.6%甲醛磷酸盐缓冲液重悬沉淀，室温下固定细胞10分钟。最后，使用三次磷酸盐缓冲液洗涤去除固定液。在开始本实验前一天，配制500微升酸化低分子量壳聚糖溶液（质量体积比3%）。通过加入乙酸调节pH至4.5。为充分混匀溶液，将其在40摄氏度条件下均质化24小时。第二天，将制备好的负载金纳米棒的小鼠巨噬细胞与500微升壳聚糖溶液充分混合。为获得50微米厚的仿组织体模，将250毫克该混合物加入1.9平方厘米的聚苯乙烯模具中。将样品置于通风橱中静置24小时。第二天，向样品中加入500微升1摩尔的氢氧化钠水溶液，以诱导交联，并用10毫升超纯水冲洗。使用定制的光声显微镜分析光声转换的稳定性，该显微镜包含一个光学参量振荡器、用于调节光通量的衰减器以及一个超声换能器。首先，将含有巨噬细胞的壳聚糖薄膜置于去离子水中，并用浸没在水箱中的塑料支架固定。确定一个不会损伤样品且能产生足够信噪比光声信号的探测光能量密度。设定一个试验性的能量密度和采集参数。对于激光的每一次脉冲，从超声换能器采集相应的光声信号。计算每个脉冲的光声强度与激光能量密度的比值。分析该比值随脉冲次数的变化趋势，并验证其随时间的稳定性。若存在不稳定性，应使用较低的试验能量密度重复此测量。对于稳定性测试，只要其光声发射具有合适的信噪比，即可将试验注量用作探测注量。接下来，测量重塑阈值注量。在样品上任选一点，将激光设为探测注量，测量500个脉冲的平均光声强度A。然后，将标称能量密度提高至超过探测能量密度，并输送50个脉冲。将其平均能量密度记为F_excitation。将激光器重置回探测能量密度，重复测量，对500个脉冲取平均光声信号强度B。现在，计算 B 与 A 的比值 R。R 值小于 1 表明样品的光学性质发生了不可逆变化。接下来，使用微米级位移平台移动薄膜，以随机改变样品的测量位置。然后，针对不同的激发光强度 F 重复测量 R 值，从而获取若干个接近或小于 1 的 R 值。收集约15个R点是合理的数据量。随后，绘制R随激发光通量F的变化曲线，并将R值在无不确定性情况下偏离1时所对应的光通量确定为形变阈值。通常，阳离子型金纳米棒会在巨噬细胞内大量积累，而巨噬细胞则保持其正常形态。发现颗粒被限制在紧密的内吞囊泡内。随着过程的进行，壳聚糖水凝胶中的包埋似乎未影响细胞形态。通过显微照片观察可见，细胞在样品中分布均匀。不含细胞的含金纳米棒壳聚糖薄膜对照组具有均一性。金纳米棒的等离激元吸收带在其细胞载体中得以保留。在这些实验方案中，等离激元耦合效应或不同大小和形状颗粒的摄取差异等因素未产生显著影响。采集数据后，R 随 F 激发的变化趋势可反映数据特征及确定 F 阈值所需的分析方法。此处测得的 F 阈值约为 11 毫焦每平方厘米。在 500 次脉冲中，光声测量结果具有很高的准确性，信噪比大于 20。本方案在粒子设计及其光稳定性研究方面相较于现有方法具有创新性。通过季铵盐阳离子对聚乙二醇化金纳米棒进行修饰，可在保持胶体稳定的同时实现高效的细胞摄取。通过定义重塑阈值来测量光声转换的稳定性，具有定量性和可重复性。由于这些颗粒旨在用作光声成像的对比剂，因此使用光声探针是测试其功能特性的理想方法。等离子体颗粒的细胞载体在光声成像中可作为对比剂被清晰观察到。其光稳定性与游离的等离子体颗粒相同。我们目前工作的重点是这些细胞的生理学特性，特别关注其存活能力与趋化活性。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

含有金纳米棒蜂窝车辆的制备及光声分析

我们采用银种子介导生长法合成了星形金纳米星。纳米星的直径范围为200至300...

银种子介导生长法制备金纳米星

在本视频中，我们介绍了将暗场显微镜（DFM）技术与单颗粒追踪（SPT）分析相结合，用于监测等离激元金纳米棒与特定细胞系细胞膜之间相互作用的方法。结合使用DFM与SPT分析，能够以高时空分辨率可视化纳米棒在细胞膜上的运动过程。...

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我们报道了通过掩模版印刷和光刻技术对纳米多孔金薄膜进行微图形化的方法，以及在微加工图案上培养细胞的技术。此外，我们还描述了利用扫描电子显微镜和荧光显微镜技术对材料及培养细胞的形态进行表征的图像分析方法。...

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我们介绍一种通过硫氰酸钠（NaSCN）还原氯金酸（HAuCl4）来制备高度稳定的金纳米颗粒寡聚簇的简单方法。这些寡聚簇具有较窄的尺寸分布，并可制备出多种不同尺寸和表面包覆的产物。...

一种在常温条件下控制金纳米颗粒稳定寡聚簇尺寸的简便合成方法

本方案介绍了一种利用市售材料制备金纳米颗粒整合型光响应脂质体的简单方法。同时展示了如何测量合成脂质体在脉冲激光处理下微泡空化过程的方法。...

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本文介绍了一种以对苯二酚作为还原剂合成金纳米棒的实验方案，并阐述了调控其尺寸和长径比的各种机制。...

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利用圆偏振光镊可在液体中捕获等离激元金纳米棒并以千赫兹频率进行旋转。引入布朗动力学分析和光散射光谱技术，为众多科学领域的研究与应用提供了一个强大的系统。...

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本文描述了一种可靠且易于重复的方法，用于制备可功能化、近红外发射的光致发光金纳米簇，并通过流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜直接检测其在HeLa细胞内的存在。...

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利用单纳米颗粒暗场显微技术可视化金纳米棒在细胞膜上的扩散动力学

学习利用肿瘤相关巨噬细胞作为细胞载体，负载金纳米棒进行光声成像的方法。该技术通过体外构建生物界面，实现对肿瘤靶向递送等离子体颗粒，提高成像剂的光学和生化稳定性，为癌症诊断提供新策略。

含金纳米棒的细胞载体的制备与光声分析

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