通过定量实时PCR评估小鼠乳腺肿瘤模型中的肺转移

本实验的总体目标是检测肺部肿瘤细胞中特定 mRNA 的含量，以此作为分析转移的方法。该技术的主要优势在于其能够对转移程度进行定量测量。进行肺部肿瘤解剖时，根据实验方案使用致死剂量的异氟烷处死小鼠后，将小鼠仰卧置于泡沫板上，四肢展开，并用解剖针将其固定在板上。

使用乙醇喷洒小鼠后，用镊子夹住动物腹部中央的下部区域，用剪刀沿皮肤向上剪至颈部，注意不要刺破小鼠的腹膜腔。接着，夹住动物尾端的腹膜，开始向上剪至颈部基部。小心沿肋骨两侧剪开，注意不要切断可能引起胸腔出血的血管。

通过切开膈肌及肋骨笼的上部，在左右两侧去除肋骨。然后用镊子夹住小鼠的气管并向前牵拉，使用解剖剪剪断气管，再将肺组织从小鼠体内取出。用 PBS 轻柔冲洗肺组织。

随后，根据文本方案对肺组织进行大体评估，如果需要立即分析肺组织，则进行RNA提取。从组织中提取RNA时，首先使用文本方案中列出的方法之一对组织进行匀浆。准备RNA提取试剂盒中的裂解缓冲液，并在每毫升裂解缓冲液中加入20 µL的肿瘤巯基乙醇。

每30克组织用300微升裂解缓冲液重悬，使用超声破碎仪（设置为30%振幅）对组织进行10秒超声处理。在590微升TE缓冲液中加入10微升蛋白酶K，并将600微升该缓冲液加入300微升已超声处理的组织中。室温孵育10分钟。

接下来，以大于或等于13,000 ×g的离心力离心10分钟，以去除杂质。然后将上清液转移至新的离心管中。每900 µL上清液中加入450 µL乙醇，以沉淀RNA。

然后将700微升裂解液与乙醇的混合物转移至RNA柱中。在不低于13,000 × g的条件下离心一分钟，使RNA结合到柱上。随后弃去液体废液，将剩余的上清液加入柱中，再次离心。

接下来，向柱子的上部加入 350 µL 洗涤缓冲液一，将样品离心 30 秒。弃去液体废液，并将柱子放回收集管中。每份样品按如下方法配制 DNase：将 5 单位的 DNase 一酶与 5 µL 10X DNase 缓冲液以及 40 µL 无 DNase 和 RNase 的水混合。

向每个柱中加入 50 µL DNase 混合液，在室温下孵育 15 分钟。然后向柱中加入 350 µL 洗涤缓冲液一，离心样品 30 秒。弃去废液后，加入 600 µL 洗涤缓冲液二，再离心 30 秒。

加入250微升洗涤缓冲液二之前，弃去液体，然后离心两分钟。将柱子转移至新的收集管中，向柱子中加入50至100微升无RNase和DNase的水。孵育一分钟后，离心一分钟。

将收集的洗脱液重新通过层析柱，以提高RNA得率。如需立即使用，请将样品置于冰上。如需后续使用，则在干冰或液氮中速冻，并于-80摄氏度保存，直至使用。

使用分光光度计定量 RNA。然后，在无 RNase 和 DNase 的无菌 PCR 管或板中，使用 0.5 至 2 微克总 RNA，按照本表所示配制第一链合成反应体系。混匀后，轻轻离心，并使用此处所示程序设置标准 PCR 仪。

当反应完成后，使用无菌、无核酸酶的水将反应产物稀释至所需体积。为进行实时 PCR，使用阳性对照 cDNA（如人 HER2）通过配制 cDNA 的 1 至 4 倍系列稀释液，为每对引物建立包含五个标准点的标准曲线。接着，计算总样本数量，应包括标准曲线样本和实验样本。

然后，在无 RNase 和 DNase 的无菌离心管中，为每个目标实验基因以及内参基因（如 gapdh）配制相应的主混合液。准备一块检测板，每份标准品或实验样品均加入一微升 C DNase。每个引物探针至少分配一份 C DNA 样品至一个孔中。

每孔每对引物探针加入 19 微升预混液。该生物发光实验表明，经 ACT1（靶向缝隙连接蛋白 Connexin 43）处理的小鼠肺组织未显示荧光素酶活性，提示组织中无肿瘤细胞存在。然而，肺组织 H&E 切片分析显示存在微转移灶，而这些病灶未被荧光素酶成像检测到，提示荧光素酶成像的灵敏度不足以检测少量肿瘤细胞。

图中显示了使用特异性针对 HER2 的探针进行 qRT-PCR 实验的结果，用于检测最初移植到小鼠乳腺脂肪垫的细胞所来源的人 HER2 阳性 JIMT1 肿瘤细胞在肺组织中的存在情况。尽管在任何肺组织表面均未观察到明显的转移灶，但在 11 个样本中的 2 个样本中，qRT-PCR 检测到了转移。在本图中，通过标准曲线分析确定了相对于小鼠肺组织 gapdh 归一化后的相对 HER2 水平，并以细胞数量系列进行校准。

结果表明，使用 HER2 探针的 qRT-PCR 能够灵敏地检测低至 10 个细胞中的 HER2 水平。最后，该回归分析显示了每份肺组织样本中的相对细胞数量，包括阳性和阴性对照。一旦掌握，该技术若操作得当，可在 6 至 8 小时内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要注意采取预防措施，以在RNA提取和逆转录反应过程中保持RNA的完整性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过定量实时PCR在整块肺组织中检测转移灶。