Name: 亚细胞钙荧光和生物发光成像 2+老年海马神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: 了解利用荧光和生物发光成像技术检测老年大鼠海马神经元胞质与线粒体钙离子动态的方法。该技术可追踪钙重塑过程，为研究兴奋毒性与神经退行性疾病提供重要工具。

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本工作由西班牙经济与竞争力部（BFU2012-37146）以及卡斯蒂利亚-莱昂自治区政府（BIO103/VA45/11、VA145U13 和 BIO/VA33/13）资助。MCR 得到卡斯蒂利亚-莱昂自治区政府（西班牙）和欧洲社会基金的支持。我们感谢已故的 Philippe Brûlet 博士（1947–2013）提供线粒体 GFP Aequorin 质粒。

伦理声明：涉及动物受试者的实验程序均依照欧洲委员会第123/Council of Europe号公约和欧盟指令86/609/EEC的规定，经巴利亚多利德大学动物饲养设施批准的方案进行。
1. 大鼠海马神经元的短期与长期培养
<ol>
	<li>聚-D-赖氨酸包被的12 mm玻璃盖玻片的制备
	<ol>
		<li>将直径为12 mm的玻璃盖玻片在乙醇中灭菌至少24小时。在无菌条件下使其干燥。</li>
		<li>将盖玻片均匀分布在培养皿中的一条石蜡膜上，每个盖玻片表面覆盖200 μL溶液。 &#181;1 毫升 1 毫克/毫升多聚-D-赖氨酸。置于过夜孵育。</li>
		<li>次日，在无菌条件下，用双蒸馏无菌水每15分钟洗涤盖玻片一次，持续90分钟。</li>
		<li>用500 μL将四孔多孔培养板加满 &#181;每孔加入 l Neurobasal 培养基。Neurobasal 培养基应添加 10% 胎牛血清、2% B27、1 &#181;g/ml 庆大霉素和 2 mM L-谷氨酰胺。</li>
		<li>将盖玻片放入多孔培养板中，置于37℃湿润环境中孵育。 &#186;C 和 5% CO2 孵育器中保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从新生大鼠中分离海马神经元
	<ol>
		<li>准备1.8 ml木瓜蛋白酶溶液（直接购买），置于小瓶中（20 &#181;l/ml）下无菌操作：以获得20的终浓度 &#181;l/ml 加入约 40 &#181;1.8 ml Hank's 液加 0.6% BSA 中的木瓜蛋白酶&#181;l 应根据供应商的条件进行计算。Hank's 0.6% BSA 的配制方法为：将 85 ml HBSS 培养基与 15 ml 4% 牛血清白蛋白（BSA，通过将 4 g BSA 溶解于 100 ml HBSS 中制备）混合。在无菌操作台中进行配制。</li>
		<li>将木瓜蛋白酶在含0.6% BSA的Hank's液中37℃孵育30分钟 &#186;使用前将溶液在 0.22 μm 滤膜过滤 &#181;m 滤膜，使用前过滤。</li>
		<li>在900 ml双蒸灭菌水中加入杜尔贝科改良伊格尔培养基粉末（13.5 g/L），配制Ham's F-12培养基。然后加入6 g HEPES和336 mg NaHCO₃3 使用 4 N NaOH 将 pH 值调节至 7.42。加入无菌水定容至 1 L，然后使用 0.20 μm 滤膜过滤。 &#181;m 聚醚砜（PES）瓶顶滤器。该操作需在无菌操作台中进行。最后用 CO 饱和溶液2 使用前需在无菌条件下操作。将溶液于4℃保存。 &#186;C，并冷藏使用。</li>
		<li>通过断头法处死新生（P0）大鼠幼崽，并用无菌HBS培养基清洗头部。使用无菌剪刀打开颅骨。用刮勺取出脑组织，并迅速在Ham's F-12培养基中清洗。</li>
		<li>使用解剖刀在每个半球上进行斜切图1B），并将其转移至含有Ham's F-12培养基的培养皿中。</li>
		<li>在解剖镊和放大镜的辅助下，小心地去除脑膜。</li>
		<li>使用放大镜在大脑皮层上一个典型的凹陷位置识别海马体。然后，用眼科剪刀小心地从一侧边缘开始分离海马体，将其从皮层上逐步剥离并取出。</li>
		<li>将海马组织转移至含有无钙无镁无菌Hank's培养基的4孔板中2+ 和 Mg2+ 加入0.6% BSA并洗涤海马组织。使用同一把眼科剪刀，在不移除培养基的情况下将组织切成小块（约2 × 2 mm）。</li>
		<li>将海马组织块转移至含有1.8 ml预过滤木瓜蛋白酶溶液的样品瓶中，随后在37℃孵育 &#186;C，偶尔轻轻摇动。15 分钟后，加入 90 &#181;DNase I 溶液的体积（50 &#181;g/ml 终浓度），再孵育 15 分钟。</li>
		<li>将组织转移至一个10 ml离心管中，用新鲜的Neurobasal培养基洗涤组织碎片。通过5 ml塑料移液管反复吹打组织碎片，获得细胞悬液。</li>
		<li>在160 × g下离心细胞悬液5分钟。使用无菌塑料巴斯德吸管弃去上清液，并用1 ml自动化移液器在1 ml神经基础培养基中小心重悬沉淀。</li>
		<li>使用血球计数板测量细胞密度。将盖玻片覆盖在血球计数板上，加入10 μL细胞悬液。 &#181;细胞悬液。确保细胞悬液均匀进入计数室，避免产生气泡。在显微镜下计数细胞数量，并进行相应计算，以获得适宜的细胞滴度（40–80个细胞/滴） &#181;l 含 30 x 103 细胞。细胞总数取决于所使用的动物数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大鼠海马神经元的短期与长期培养
	<ol>
		<li>在含有500的四孔多孔培养板上 &#181;预先准备好并置于培养箱中保温的 Neurobasal 培养基，接种约 30 × 103 约50微升液滴中的细胞 &#181;向多孔板的每个孔中加入 l，孔内含一片经多聚-D-赖氨酸包被的 12 mm 直径玻璃盖玻片。</li>
		<li>在37℃、湿润的培养箱中培养原代海马神经元细胞 &#186;C 和 5% CO₂2 2-5 天的培养箱培养 体外 （DIV，短期，年轻培养物）或 &#62;实验前培养15天（长期、老化培养），期间不更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞质 Ca 2+ 浓度的荧光成像
<ol>
	<li>荧光成像用测试溶液的制备。
	<ol>
		<li>配制外部 HEPES 缓冲盐溶液（HBS），其中含有（单位：mM）：NaCl 145、KCl 5、MgCl2 1、CaCl2 1、葡萄糖 10、钠-HEPES 10（pH 7.42）。</li>
		<li>配制无 Mg2+ 的 HEPES 缓冲盐溶液（HBS），其中含有（单位：mM）：NaCl 146、KCl 5、CaCl2 1、葡萄糖 10 和 HEPES 10（pH 7.42）。</li>
		<li>将 NMDA 溶于无 Mg2+ 的 HEPES 缓冲盐溶液（HBS）中，终浓度为 100 µM，并加入 10 µM 甘氨酸。</li>
		<li>通过溶解以下成分（单位：mM）配制以 KCl 替代 NaCl 的 HBS 溶液：KCl 145、MgCl2 1、CaCl2 1、葡萄糖 10 和 HEPES 10（pH 7.42）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用荧光钙探针 fura2/AM 负载海马神经元细胞。
	<ol>
		<li>从培养箱中取出含盖玻片的细胞培养物，在室温下用 HBS 培养基洗涤，将其转移至新的四孔多孔板中，每孔加入 500 µl HBS 培养基。</li>
		<li>在室温（25 ºC）避光条件下，用 4 µM fura2/AM（溶于相同 HBS 培养基中）孵育细胞 60 分钟。</li>
		<li>60 分钟后，用新鲜 HBS 培养基洗涤盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录培养细胞胞质内 [Ca2+] 的荧光图像。
	<ol>
		<li>打开光源、显微镜、灌流系统、荧光相机和计算机。</li>
		<li>将盖玻片置于倒置显微镜载物台上专用于开放式 12 mm 玻璃盖玻片的温控平台上，使用 40X 物镜（油镜，NA:1.3）选择观察视野。持续用预热至 37 ºC 的 HBS 培养基对细胞进行灌流，可选择性加入待测物质。维持灌流速度约为 5–10 ml/min。 
		注：活细胞灌流系统安装在适用于开放式 12 mm 玻璃盖玻片的温控平台上。采用配备阀门控制器的 8 通道重力驱动灌流系统进行溶液灌流。真空泵用于吸除多余液体。溶液通过管内加热系统进行加热。</li>
		<li>在两个激发波长下关闭快门，采集背景图像。</li>
		<li>以 340 nm 和 380 nm 激发波长交替照射细胞，使用荧光相机每 5–10 秒记录一次 520 nm 发射光，该信号经 fura-2 二向色镜过滤。</li>
		<li>记录结束后，将 520 nm 发射光的完整图像序列保存至计算机，用于后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录的荧光图像分析。
	<ol>
		<li>打开实验文件。在 aquacosmos 软件中点击“Ratio”（比值），选择所需的比值范围。对所得图像进行逐像素比值计算，生成一系列比值图像。</li>
		<li>通过调整“背景消除”功能扣除背景信号，点击“开始计算”。</li>
		<li>点击“all times sequence”（全部时间序列）按钮，清除原有的感兴趣区域（ROIs）。为对单个细胞进行定量分析，建立新的与单个神经元对应的感兴趣区域（ROIs）。对每个 ROI 内所有像素在每幅图像中的比值进行平均，获得各 ROI（细胞）的比值荧光记录。</li>
		<li>为绘制单个记录曲线，将各 ROI 对应的比值荧光值导出至绘图软件。</li>
		<li>使用合适的数据分析与绘图软件，进行相应计算，以评估每次刺激所引起的比值荧光上升幅度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 线粒体 Ca2+ 浓度的生物发光成像
<ol>
	<li>转染培养的海马神经元与 mitGAmut 质粒。 
	注意：首先将含有线粒体靶向序列和缺失Ca²⁺的突变型水母发光蛋白（aequorin）的mitGAmut质粒转染至细胞中2+ 结合位点与绿色荧光蛋白（GFP）融合。该构建体可检测线粒体Ca²⁺水平的显著升高2+ 摄取，并可通过GFP荧光鉴定转染细胞。该质粒由P. Brûlet及其同事开发并惠赠。 18 （法国国家科学研究中心，巴黎）
	<ol>
		<li>制备不含胎牛血清、B27、庆大霉素和2 mM L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基（Neurobasal TF）。</li>
		<li>准备50 &#181;神经基础培养基TF加2.5 &#181;l 转染试剂置于一个离心管中（溶液A）。准备50 &#181;神经基础培养基TF加4微升 &#181;将含 g mitGAmut 质粒的溶液 B 加入装有溶液 A 的小管中。轻轻将溶液 B 加至溶液 A 上层，室温静置 20 分钟，勿振荡，使其自然混合。</li>
		<li>将含有海马神经元的盖玻片转移至含有 200 &#181;新鲜 Neurobasal 培养基。</li>
		<li>逐滴加入100 &#181;每盖玻片加入 A 和 B 溶液各 l，孵育 30 分钟。移除培养基，用新鲜的 Neurobasal TF 洗涤细胞一次。将盖玻片放回原 Neurobasal 培养基中。</li>
		<li>在37℃下将神经元继续培养24小时 &#186;C 和 5% CO2 转染后，以确保探针的有效表达和靶向。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物发光成像用测试溶液的制备
	<ol>
		<li>配制含有100 NMDA的HBS溶液 &#181;M 或 145 mM KCl（同上，步骤 2.1）。配制含有 10 mM Ca 的 HBS 溶液2+ 加100去氧胆酸钠 &#181;M.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线粒体靶向水母素与腔肠素 n 的重组
	<ol>
		<li>将含有转染海马神经元的盖玻片转移至含有200 μL预热成像缓冲液的四孔板中 &#181;HBS 的升</li>
		<li>加入4 &#181;腔肠素 n (200 微升) &#181;M) 至 200 &#181;HBS 的终浓度为 4 l &#181;M，轻轻混匀，在室温（25 ℃）孵育 2 小时 &#186;C）以及避光条件下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录线粒体[Ca 2+ ].
	<ol>
		<li>打开显微镜、光源、灌注系统、生物发光相机和计算机。</li>
		<li>将重悬的盖玻片转移至恒温（37 &#186;C）将灌流室连接，以每分钟5-10毫升的速度持续灌注预热的HBS溶液。</li>
		<li>使用40倍物镜（油镜，NA：1.3），在荧光显微镜下选择一个含有表达apoaequorin的细胞的视野，这些细胞可通过绿色荧光蛋白（GFP）表达在FITC滤光片下观察到的荧光信号来识别。典型视野中可能包含1-2个转染细胞。使用CCD相机采集GFP荧光图像。</li>
		<li>关闭显微镜光源。移除位于光路中的含二向色镜的盒子。关闭激发光源，并合上暗箱以确保完全黑暗。</li>
		<li>以预热至37℃的HBS培养基，以5–10 ml/min的流速灌注细胞，可选择性加入待测溶液 &#186;C.</li>
		<li>使用配备图像处理器的光子计数相机，每10秒采集一次光子发射图像。</li>
		<li>每次实验结束时，用含 0.1 mM 皂苷和 10 mM CaCl₂ 的溶液对细胞进行透化处理2 在 HBS 中以释放所有剩余的光子发射。 
		注意：必须对这些光子发射进行累加以估算总光子发射量，该数值是钙定标所必需的2+ 浓度</li>
		<li>将生物发光图像与光子计数成像前采集的GFP相关荧光图像一同存储在计算机中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线粒体[Ca²⁺]生物发光成像分析 2+ ].
	<ol>
		<li>使用特定软件定量光子发射。光子发射可转换为线粒体游离 Ca2+ 浓度（[Ca2+]中期）使用 Brini 等人描述的算法 15.</li>
		<li>打开实验文件并加载GFP荧光图像。根据实验开始时采集的荧光图像，借助特定软件绘制转染细胞的轮廓，以选定感兴趣区域（ROIs）。</li>
		<li>将相同的感兴趣区域（ROI）粘贴到每张图像上。使用特定软件计算每个 ROI 内的总光子发射量，以获得每个细胞在各个时间点的发光强度值（L）。</li>
		<li>使用特定软件将生物发光图像中的所有光子发射信号相加，包括皂苷素透化后获得的信号，以获得包含全部光子发射的生物发光图像。</li>
		<li>将每个感兴趣区域的光子发射值导出至特定软件以进行计算。为此，请点击“Graph”以计算每个时间点每个ROI的生物发光值。选择“total value”和“use current ROI to all images”，然后点击“calculate”。保存“txt.file”并将数据导出至工作表。对于每个ROI，[Ca2+]中期 使用以下算法进行计算： 
		 
		[Ca2+](M) = [R + (R &#183; KTR) - 1] / [KR - (R &#183; KR)]; 
		 
		其中， 
		R = [L/(L总计&#955;)]1/n 
		L 是每个感兴趣区域在测量时刻发射的发光强度。 
		L总计 是每个感兴趣区域在测量时点减去当时组织中所含计数后剩余的总发光量。 &#955;，KTR，KR 且 n 是常数，其取值取决于所用腔肠素（野生型或 n 型）与水母素（野生型或突变型）的组合以及记录温度 16对于此处使用的组合（突变型AEQ与腔肠素n），在37 &#186;C，我们使用了以下数值：KR = 8.47 × 107，KTR = 165.6 × 103，n = 1,204 和 &#955; = 0,138.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用合适的数据分析和绘图软件，进行相应的计算，以估算每次刺激引起的生物发光增强的幅度。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均无竞争利益或利益冲突。

细胞内Ca²⁺重塑2+ 衰老大脑中的稳态失调与认知功能下降、缺血性损伤易感性增加、兴奋性毒性以及神经退行性变相关。为验证这一假设 体外，Ca2+ 成像技术已有多种可用方法。然而，老化海马神经元的活体培养并不可靠。最近有研究发现，大鼠海马神经元的长期培养呈现出许多典型的衰老特征 体内 包括活性氧积累、脂褐素颗粒形成、异染色质灶、pJNK 和 p53/p21 通路的激活、胆固醇流失以及钙密度的变化2+ 通道和NMDA受体 14因此，Ca2+ 在年轻和老龄大鼠海马神经元培养物中的成像实验可能为Ca2+ 衰老大脑中的重塑。长期培养海马神经元的一个关键条件包含两个方面。首先，如上所述，必须以非常低的密度接种细胞。其次，细胞在添加补充剂的Neurobasal培养基中培养，且不更换培养基。该方法可允许胶质细胞存在，同时避免其过度生长。此类培养的示意图如图所示 图1.
使用合成的 Ca2+...

兴奋性毒性是导致缺血等神经系统损伤以及阿尔茨海默病等某些神经退行性疾病中神经元损伤和细胞死亡的最重要机制之一 1。这种神经毒性主要由谷氨酸作用于Ca2+-可渗透的离子型NMDA受体（NMDAR） 2将培养的神经元暴露于谷氨酸可导致兴奋性毒性 3，可导致神经元凋亡 4我们及其他研究者此前曾报道，神经元对NMDA诱导的凋亡的易损性可能随发育过程而改变 体外 和衰老 5-8.
普遍认为，细胞质游离Ca²⁺浓度的升高2+ 浓度（[Ca2+]细胞) 会导致细胞活化。然而，如果该升高幅度过大和/或持续时间足够长，则可能触发细胞死亡 9此外，有研究提出，兴奋性毒性需要线粒体 Ca2+ 摄取 10，因为用线粒体解偶联剂处理神经元可保护其免受谷氨酸诱导的细胞死亡 11如果线粒体摄取过多的 Ca2+，线粒体通透性转换孔的开放可能导致细胞色素c及其他促凋亡因子的释放，从而诱导细胞凋亡。我们最近的研究表明，这种线粒体Ca2+ 摄取与年龄依赖性兴奋性毒性的易感性直接相关，通过直接测量NMDA诱导的线粒体Ca2+ 单个海马神经元的摄取 5，本文报道了一种方法。海马体参与学习、记忆及其他认知过程等生理活动 12极易受到衰老和神经退行性疾病的影响 13。有研究提出，在数周后 体外培养的海马神经元表现出多种老年神经元的典型特征 14因此，长期培养的海马神经元可为研究Ca2+介导的衰老过程中兴奋性毒性增强的机制
因此，本方法的总体目标是研究细胞内Ca显著变化2+ 稳态或 Ca2+ 衰老大脑中的重塑，包括差异性 Ca2+ 由NMDA受体激动剂在长期培养的海马神经元中引发的反应。该方法包括大鼠海马神经元培养的详细描述，以及细胞质和线粒体Ca²⁺的监测2+ 分别通过荧光和生物发光成像检测单个神经元中的浓度。细胞质 Ca 的荧光成像2+ 在培养的神经元中是一种标准操作。然而，该方法对于亚细胞水平的Ca2+ 包括线粒体 Ca 的测量2+原因包括合成探针缺乏适当的靶向性以及对Ca的亲和力不合适2+ 浓度可能从低 µM 水平变化至 mM 水平。Ca 的使用2+ 基于蛋白质的探针，例如水母素（aequorin），已实现对细胞器亚结构的靶向定位，并可利用不同类型的钙离子衍生物2+ 使用不同的腔肠素或缺失特定Ca的突变探针进行亲和力测定2+ 结合位点 15通过这种方式，对表达线粒体靶向aequorin的细胞进行生物发光成像，可实现对线粒体Ca²⁺的监测2+ 单个神经元中的浓度。然而，该过程可能需要使用光子计数相机或超灵敏CCD相机进行生物发光成像 16-18该方法可能产生新的结果，但应在更成熟的脑衰老模型中加以验证，例如老年动物的脑切片。

<table><tbody><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 培养基</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 培养基</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DNase I（来自牛胰腺）</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Lonza</td><td>DE14-801E</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 玻璃盖玻片</td><td>Labolan</td><td>0111520/20012</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>4 孔多孔培养板</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>JD Catalan s.l.</td><td>2120044T</td><td></td></tr><tr><td>无菌移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>431030</td><td></td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>腔肠素 n</td><td>Biotium</td><td>BT-10115-2250 uG</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>NMDA</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert S100 TV 显微镜</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcite 照明系统</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA ER 荧光相机</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VIM 光子计数 CCD 相机</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VC-8 阀门控制器</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SH-27B 加热系统&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquacosmos 软件</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

衰老海马神经元中亚细胞钙离子（ca2+）的荧光与生物发光成像

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

与神经退行性疾病和缺血相关的神经元细胞死亡易感性在衰老大脑中显著增加，但其潜在机制尚不清楚。兴奋性毒性被认为参与了上述两种损伤所诱导的神经元损害，该过程由谷氨酸受体激活介导，进而促进 Ca2+ 流入和线粒体 Ca2+ 过载。细胞内 Ca 的显著变化2+ 细胞内钙稳态或重塑2+ 稳态可能在老年神经元中加剧神经元损伤。为研究Ca2+ 在衰老过程中的重塑研究中，我们采用了活细胞成像技术，对大鼠海马神经元进行长期培养，这些神经元在某些方面类似于衰老神经元。 体内为此，首先从新生大鼠海马组织中新鲜分离海马细胞，并将其接种于多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上。随后，将培养物分别在控制培养基中维持数天或数周，以分别研究年轻和成熟的神经元。其次，将培养的神经元负载fura2，并进行胞质Ca²⁺浓度的测定。2+ 使用数字荧光比率成像技术测定细胞内钙浓度。第三，将培养的神经元转染表达靶向线粒体的低亲和力水母发光蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）串联体的质粒。24小时后，细胞内的水母发光蛋白与腔肠素重新结合，随后对神经元进行生物发光成像，以监测线粒体钙水平。2+ 浓度。该三步法可实现对胞质和线粒体 Ca2+ 对相关刺激（例如谷氨酸受体激动剂NMDA）的反应，并比较这些及其他反应是否受到衰老的影响。该方法可能为衰老如何影响胞质和线粒体Ca²⁺提供新的见解2+ 对特定刺激的反应，以及针对预防衰老相关疾病中神经元细胞死亡的特定药物的测试。

本文介绍了一种简单的方法，用于评估衰老神经元中Ca2+的重塑过程以及NMDA对胞质和线粒体[Ca2+]的影响。图1展示了从新生大鼠分离并培养海马神经元的操作流程示意图。实验开始前，需准备无菌的、经多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片，并将其置于4孔板中。随后处死新生大鼠并取出脑组织。分离海马后，使用木瓜蛋白酶对组织进行细致的分散处理。分离得到的细胞经洗涤后接种于包被好的盖玻片上。细胞随后分别在2–5 DIV或>15 DIV条件下培养，以获得年轻或衰老的神经元培养物，并用于Ca2+成像实验。
采用上述策略，可从同一标本中获得年轻和年老的神经元，用于检测例如NMDA在年轻培养物与较老培养物中对胞质[Ca2+]的影响是否存在差异。图2显示，100 µM NMDA在较老的培养物中诱导的胞质[Ca2+]升高幅度大于在年轻培养物中的升高幅度。同样，NMDA可诱导年老神经元发生细胞死亡，但在年轻神经元中则无此效应5...

衰老过程中细胞内 Ca2+ 重塑可能引起兴奋性毒性及神经元损伤，这些过程由 Ca2+ 超载介导。本研究旨在利用荧光和生物发光成像技术，对大鼠海马神经元长期培养模型（一种神经元衰老模型）中胞质和线粒体 Ca2+ 的动态变化进行检测，以探究衰老脑组织中的 Ca2+ 重塑现象。

衰老海马神经元中亚细胞钙离子（Ca2+）的荧光与生物发光成像

与神经退行性疾病和缺血相关的神经元细胞死亡易感性在衰老大脑中显著增加，但其背后的机制……

本实验的总体目标是利用长期培养的海马神经元中细胞质和线粒体钙离子的荧光与生物发光成像，研究衰老大脑中的钙重塑过程。该模型被视为神经元衰老的代表性体系。该方法有助于解答衰老研究领域中的关键问题，例如细胞内钙离子重塑如何导致兴奋性毒性及神经元损伤，这两者均与钙超载相关。该技术的主要优势在于，可对同一标本来源的不同体外培养天数（DYS）的单个神经元进行连续、密切地追踪钙重塑过程。该技术的应用前景包括中风或细胞能量代谢疾病的相关研究与治疗，因其可提供与钙超载相关的新型治疗靶点，适用于此类疾病的研究。观看本视频后，Jesus 将能够很好地掌握如何对大鼠海马神经元的短期和长期培养物进行细胞质和线粒体钙的荧光与余晖成像。开始该实验前，将盖玻片均匀分布在培养皿中一条对二甲醛条带上。随后在每张盖玻片上加入 200 微升浓度为 1 毫克/毫升的多聚赖氨酸（poly D-lysine），过夜处理。第二天，在无菌条件下，用双蒸馏无菌水每15分钟洗涤盖玻片一次，持续90分钟。将盖玻片放入多孔板中，并置于37摄氏度、5%CO2的加湿培养箱中保存备用。分离海马神经元时，用无菌剪刀打开新生大鼠幼崽的颅骨，用刮勺取出脑组织，并在Ham's F12培养基中快速冲洗。然后用手术刀在每个半球进行斜切，并在显微镜下将其转移至含有Hams F12培养基的培养皿中。弃去脑膜。在皮层上特征性的凹陷位置仔细辨认海马体。然后用眼科剪小心地将海马从大脑皮层分离并取出。接着，将海马组织块转移至含有 1.8 毫升预过滤 pepane 溶液的小瓶中，在 37 °C 条件下孵育，并间歇轻轻振荡，持续 15 分钟。然后加入 90 µL 的 DNA 一种溶液。加入 50 µg/mL，再孵育 15 分钟。之后，将组织转移至 10 mL 离心管中，并用新鲜的神经基础培养基洗涤组织碎片。通过5毫升塑料移液管将组织碎片吹打成细胞悬液。随后，将细胞悬液在160 ×g条件下离心5分钟。然后，使用无菌塑料移液管吸除上清液，并用1毫升自动移液器将沉淀物小心重悬于1毫升神经基础培养基中。接下来，使用血细胞计数板（Neubauer计数室）测定细胞密度。加入10 µL细胞悬液，在显微镜下计数细胞数量。然后进行相应计算，获得含有约30,000个细胞的40至80 µL细胞悬液。在含有500 µL神经基础培养基的四孔板中，每孔接种约30,000个细胞至含玻璃盖玻片的孔中。将细胞在培养箱中孵育，在体外培养2至5天以获得年轻神经元，或在体外培养超过15天以获得成熟神经元。在此步骤中，将细胞与较少的2:00 AM在室温避光条件下孵育60分钟。然后将盖玻片转移至灌流 chamber。接着，将带有盖玻片的灌流 chamber 放置在倒置显微镜的载物台 holder 上。选择显微视野，并用预热的 HBS 持续灌流细胞。随后，使用340纳米和380纳米的光照射细胞。然后每隔5到10秒，用荧光相机记录520纳米处发射的光，该光通过fira two diic镜进行过滤。为分析所记录的荧光图像，首先使用Aqua Cosmos软件打开实验文件，点击“ratio”并选择所需的比值范围。计算所得图像中每个像素的比值，以获得一系列比值图像。然后通过调节背景消除按钮来扣除背景。之后，点击开始计算。接下来，按下全时段序列按钮，并清除用于单个细胞定量分析的先前 ROI。建立新的 ROI，或建立对应于单个神经元的 ROI。为绘制单个记录结果，可通过点击“绘图”将每个 ROI 对应的比率荧光值导出至 OriginLab 程序。然后点击计算并保存 TXT 文件。之后，进行相应的计算，以估算每次刺激后荧光比值升高的幅度，从而将培养的神经元转染 MIT 突变型质粒。首先，在一个离心管中准备 50 µL 含有转染试剂的溶液 A。接下来，在一个离心管中制备含有 MIT ute 质粒的 50 微升溶液 B。将溶液 B 加入溶液 A 中，混匀后孵育 20 分钟。随后，将含有海马神经元的盖玻片转移至新的多孔培养板中，每孔预先加入 200 微升新鲜的神经基础培养基 TF。然后，将 100 微升溶液 A 和溶液 B 逐滴加至每片盖玻片上，继续孵育 30 分钟。30分钟后，移除培养基。用新鲜的NeuroBasal培养基洗涤细胞，然后将盖玻片放回原来的NeuroBasal培养基中，转染后继续培养细胞24小时，以实现探针的有效表达和靶向定位。接下来，将 4 µL 的封固剂 TEREZIN N 加入 200 µL 的 HBS 中，使终浓度为 4 µmol/L。轻轻混匀，于室温避光孵育 2 小时。孵育 2 小时后，将盖玻片转移至灌流室，并持续用预热的 HBS 溶液灌流。为了记录线粒体钙离子浓度的生物发光图像，请选择表达 APO corin 的细胞所在的显微视野，该细胞可通过荧光发射信号识别。接着，关闭显微镜光源，并移除位于光路中的二向色镜盒。然后关闭激发光源，并合上暗箱以确保完全黑暗。用HBS培养基灌注细胞，培养基可预先在37摄氏度温育，含或不含待测溶液。随后使用连接图像处理器的光子计数相机，每10秒采集一次光子发射图像。接下来，加入dig toin以释放所有剩余的光子，用于分析反映线粒体钙水平的生物发光图像。打开GFP荧光图像，通过在转染细胞周围绘制区域来选择单个ROI。然后将相同的 ROI 复制并粘贴到序列中的每张图像上。屏幕截图。之后，将每个 ROI 的光子发射值导出至专用软件以进行计算并点击生成图表。为了计算每个 ROI 的数值，需选择总值，并将当前 ROI 应用于所有图像。随后，点击计算，保存文本文件并导出数据。接下来，进行相应的计算，以估算线粒体钙离子水平在每种刺激下的升高幅度。以下是海马神经元短期和长期培养在经 100 微摩尔 MDA 刺激前后的代表性明场和伪彩色图像，其中较暖的色调反映细胞质钙离子浓度升高。这些曲线显示了海马神经元短期和长期培养中细胞质钙离子浓度对 100 微摩尔 MDA 刺激的代表性单细胞记录结果。请注意，长期培养神经元的细胞质钙离子浓度升高幅度明显大于短期培养神经元。在本实验中，培养的海马神经元被转染了低亲和力线粒体靶向的korin-GFP融合蛋白，并与四微摩尔的封膜剂terezin共同孵育，随后进行线粒体钙离子浓度的生物发光成像。此处展示的记录结果反映了短期与长期培养的海马神经元中线粒体钙离子的光信号释放情况。按照该实验流程，100微摩尔的MDA可增加老化神经元中的线粒体钙离子浓度，但在年轻培养的海马神经元中则无此效应。其他方法，如公平性左评估，可与荧光和生物发光成像结合应用于相同的细胞，以回答其他问题，例如神经元细胞的易感性、与衰老相关的神经退行性变以及缺血。

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亚细胞钙荧光和生物发光成像<sup&gt; 2+</sup&gt;老年海马神经元

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