衰老海马神经元中亚细胞钙离子（Ca²⁺）的荧光与生物发光成像

本实验的总体目标是利用长期培养的海马神经元中细胞质和线粒体钙离子的荧光与生物发光成像，研究衰老大脑中的钙重塑过程。该模型被视为神经元衰老的代表性体系。该方法有助于解答衰老研究领域中的关键问题，例如细胞内钙离子重塑如何导致兴奋性毒性及神经元损伤，这两者均与钙超载相关。该技术的主要优势在于，可对同一标本来源的不同体外培养天数（DYS）的单个神经元进行连续、密切的钙重塑动态监测。该技术的应用潜力广泛，可能为中风或细胞代谢类疾病的治疗提供新的思路，因其涉及与钙超载相关的新型治疗靶点，适用于此类疾病的相关研究。

观看本视频后，Jesus 将能够很好地掌握如何对大鼠海马神经元的短期和长期培养物进行细胞质和线粒体钙的荧光与再激发成像。开始该实验步骤时，将盖玻片均匀分布在培养皿中的一条对苯二甲醛条带上。然后在每个盖玻片上加入 200 µL 浓度为 1 毫克/毫升的多聚赖氨酸（poly-D-lysine），并在过夜孵育处理。

第二天，在无菌条件下，用双蒸馏无菌水每15分钟洗涤盖玻片一次，持续90分钟。将盖玻片放入多孔板中，并置于37摄氏度、5%CO2的加湿培养箱中保存备用。分离海马神经元时，用无菌剪刀打开新生大鼠幼崽的颅骨，用刮勺取出脑组织，并迅速在Ham's F12培养基中清洗。

然后用手术刀在每个半球进行斜切，并将其转移至显微镜下含有Hams F12培养基的培养皿中。弃去脑膜。在大脑皮层上特征性的凹陷位置仔细辨认海马体。

然后用眼科剪小心地将海马体从大脑皮层分离并取出。接着，将海马体组织块转移至含有1.8毫升预过滤的pepane溶液的小管中，在37°C条件下孵育15分钟，期间轻轻振荡数次。

然后加入90 µL的DNA溶液，添加50 µg/mL，再孵育15分钟。之后，将组织转移至10 mL离心管中，用新鲜的神经基础培养基洗涤组织碎片。

通过将组织碎片经由5毫升塑料移液管吹打，获得细胞悬液。随后，将细胞悬液在160 ×g条件下离心5分钟。然后，使用无菌塑料巴斯德移液管吸除上清液，并用1毫升自动移液器小心地将沉淀重悬于1毫升神经基础培养基中。

接下来，使用血细胞计数板测量细胞密度。加入10 µL细胞悬液，在显微镜下计数细胞数量。然后进行相应计算，获得含有约30,000个细胞的40至80 µL细胞悬液。

在含有500微升神经基础培养基的四孔板中，每孔接种约30,000个细胞至含玻璃盖玻片的孔中。将细胞置于培养箱中孵育，体外培养2至5天以获得年轻神经元，或体外培养超过15天以获得成熟神经元。在此步骤中，将细胞与较少的2:00 AM在室温避光条件下孵育60分钟。

然后将盖玻片转移至灌流 chamber。接着，将带有盖玻片的灌流 chamber 放置在倒置显微镜的载物台 holder 上。选择显微视野，并用预热的 HBS 持续灌流细胞。

随后，使用340纳米和380纳米的光照射细胞。然后每隔5到10秒，通过荧光相机记录520纳米处发射的光，该光信号经由fira two diic镜过滤。为分析所记录的荧光图像，首先使用Aqua Cosmos软件打开实验文件，点击“ratio”并选择所需的比值范围。

计算所得图像中每个像素的比值，以获得一系列比值图像。然后通过调节背景消除按钮来扣除背景。之后，点击开始计算。

接下来，按下全时段序列按钮，并清除用于单个细胞定量分析的旧有感兴趣区域（ROIs）。建立新的感兴趣区域，或对应于单个神经元的感兴趣区域。为绘制单个记录的图像，点击“graph”按钮，将每个感兴趣区域对应的荧光比值数据导出至Origin实验室软件。

然后点击计算并保存 TXT 文件。接着，进行相应的计算，以估算每次刺激后荧光比值升高的幅度，从而确定转染培养神经元时 MIT 突变型质粒的用量。首先，在一个离心管中配制 50 微升含有转染试剂的溶液 A。

接下来，在一个离心管中制备含有 MIT ute 质粒的 50 微升溶液 B。将溶液 B 加入溶液 A 中，混匀后孵育 20 分钟。随后，将含有海马神经元的盖玻片转移至新的多孔板中，每孔预先加入 200 微升新鲜的神经基础培养基 TF。然后，将 100 微升溶液 A 和溶液 B 逐滴加至每片盖玻片上，继续孵育 30 分钟。

30分钟后，移除培养基。用新鲜的Neurobasal培养基洗涤细胞。随后将盖玻片放回原有的Neurobasal培养基中，并在转染后继续培养细胞24小时，以确保探针的有效表达与靶向定位。

接下来，将四微升密封剂 TEREZIN N 加入 200 微升 HBS 中，使终浓度为四微摩尔。轻轻混匀，并在室温避光条件下孵育两小时。两小时后，将盖玻片转移至灌流室中，并持续用预热的 HBS 溶液灌流。

为了记录线粒体钙离子浓度的生物发光图像，选择表达 APO 色素的细胞所在的显微视野，该视野可通过荧光发射来确认。接着，关闭显微镜光源。移除位于光路中的二向色镜盒。

然后关闭激发光源，并合上暗箱以确保完全黑暗。用HBS培养基灌注细胞，培养基可预先在37摄氏度温育，含或不含待测溶液。随后使用连接图像处理器的光子计数相机，每10秒采集一次光子发射图像。

接着，加入dig toin以释放所有剩余的光子，用于分析反映线粒体钙水平的生物发光图像。打开GFP荧光图像，通过在转染细胞周围绘制区域来选择单个ROI。

然后将相同的 ROI 复制并粘贴到序列中的每张图像上。屏幕截图。之后，将每个 ROI 的光子发射值导出至专用计算软件以生成图表。

为了计算每个 ROI 的数值，请选择总值，并将当前 ROI 应用于所有图像。随后，点击计算，保存文本文件并导出数据。接下来，进行相应的计算，以估算线粒体钙离子水平在每种刺激下的升高程度。

以下是海马神经元短期和长期培养在经 100 微摩尔 MDA 刺激前后的代表性明场和伪彩色图像，其中较暖的色调反映细胞质钙浓度升高。这些曲线显示了海马神经元短期和长期培养中细胞质钙浓度对 100 微摩尔 MDA 刺激的代表性单细胞记录结果。请注意，与短期培养的神经元相比，长期培养的神经元中细胞质钙浓度的升高更为显著。

在本实验中，培养的海马神经元被转染了低亲和力的线粒体靶向 korin-GFP 融合蛋白，并用 4 µM 的封膜剂 terezin 孵育，随后进行线粒体钙离子浓度的生物发光成像。此处展示的记录结果反映了短期与长期培养的海马神经元中线粒体钙离子的光信号释放情况。按照该操作步骤，100 µM 的 MDA 可增加老化神经元中的线粒体钙离子浓度，但在年轻培养的海马神经元中则无此效应。

其他方法，如公平左评估，可与荧光和生物发光成像结合用于相同的细胞，以回答其他问题，例如神经元细胞的易感性、与衰老相关的神经退行性变以及缺血。