激光制导神经跟踪在脑外植体

该方法的总体目标是标记神经元及其轴突投射，以追踪它们与目标或源脑核的连接。这种方法有助于回答神经科学中的关键问题，例如大脑不同区域或神经元亚群之间的连接模式，以及它们对给定神经回路的功能意义。该技术的主要优点是提高了示踪剂注射过程中的靶标精度。

这是通过使用基本的光学设备来可视化荧光标记的脑核来实现的。这种方法的另一个优点是，它允许对在神经元启动子控制下表达荧光蛋白的小鼠流行音乐进行无创基因分型。当对幼仔进行基因分型时，使用具有适当激发波长的激光指示器检查相应荧光标记物的表达。

同时，佩戴阻挡激发波长但通过发射波长的滤光镜。将激光对准相关幼犬的后脑勺或脊髓。小心不要将激光照射到 P 的眼睛中，并保持激光曝光时间短。

激发的荧光标志物应透过皮肤可见。当小鼠年龄较大时，可以识别收获组织的单个神经元。麻醉小鼠并检查是否没有反射后，去除颅骨上的皮肤，沿后脑勺切开皮肤到颅骨中部。

在超过一个月龄的小鼠中，可以通过动物的眼睛观察到荧光。接下来，使用冰冷的 PBS trans Cardi 使用 30 号针头灌注标记物阳性动物，5 到 10 分钟后，大部分血液将被去除。然后取出大脑并解剖出感兴趣的区域。

在这里，梯形体是大脑腹侧区域的两个突出的球茎，包含感兴趣的区域。梯形体或 VNTB 的腹侧核首先将感兴趣的大脑区域移植到装有含氧解剖溶液的培养皿中。那里。用 30 号注射器针头固定外膜，以便可以从顶部接触到注射区域。

对于注射，请使用 Bo 硅酸盐玻璃拉式注射移液器，该移液器在 3 或 4 个拉动周期内制造。用以下溶液装入移液器。霍乱毒素亚基 B 与 Alexa FLUORA 4 5 55 偶联，主要用于逆行运输。

使用激光指示器和注射移液管，全部安装并准备好使用，继续将光束对准标记的大脑区域或要注射的细胞。通过带通滤光镜观察视野，以查看注射移液管要针对哪些神经元。使用微型纵器将移液器定位到感兴趣区域。

然后使用设置为以 50 PS 提供 15 毫秒脉冲的压力喷射器，我以 2 到 10 个脉冲注入示踪物质。在脉冲之间留出 10 到 15 秒的时间，以便注射的染料可以扩散。注射四乙基反刍时，用提供 TTL 脉冲的刺激电极电刺激该区域。

确保电极在浴液中接地。提供 8 个 TTL 脉冲，每个脉冲 50 毫秒长，间隔 50 毫秒。在几分钟内用 10 到 20 次脉冲重复刺激该区域。

脑核的大小、神经元密度和细胞类型各不相同。这意味着可能需要调整压力和/或电脉冲的持续时间和数量，以实现给定大脑区域的最佳标记结果。使用激光和护目镜检查荧光示踪信号。

染料应被细胞吸收并散布在注射区域周围。注射后，将脑干在室温下在含氧人工脑脊髓液中孵育 1 至 4 小时。在孵育过程中保持氧合，然后将组织固定在 4% 多聚甲醛中。

第二天在 4 摄氏度的 PBS 中过夜，可以将组织切片并分级注射到梯形体或 VNTB 的腹侧核中。使用四乙基 Rodine 糊精表明 VNTB 的投射延伸到梯形体 （MNTB） 的内侧核。然后 MNTB 注射胆汁 toin，亚基 B，其 retro 大大标记了 VNTB。

更详细地说，接下来似乎标记了甘油肠道 VNTB 细胞的胞体。MNTB 注射逆行标记 dextrin tri。与 CTB 标记的点状模式不同，糊精 trit 标记密集且类似 GOGI。

观看此视频后，您应该对如何标记神经元及其过程有很好的了解，从而提高准确性。所演示的技术可帮助您识别参与给定神经回路的大脑区域和神经元亚群，一旦掌握，如果作得当，注射程序可以在大约 30 分钟内完成。该程序可以很容易地与免疫化学或大脑清理等其他方法相结合，以回答有关神经元投射和其他神经元结构的形态、方向性或功能的其他问题。