Name: 从单电浆纳米粒子散射非线性测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 6 s
Description: 了解利用等离激元纳米结构的非线性散射实现超分辨显微成像的方法。该技术通过饱和激发显微镜检测金纳米粒子的可饱和与反可饱和散射信号，显著提升光学显微镜的分辨率与对比度，为非漂白成像提供新途径。

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本研究工作得到科技部项目 NSC-101-2923-M-002-001-MY3 和 NSC-102-2112-M-002-018-MY3 的资助。本研究还获得日本学术振兴会（JSPS）通过“下一代世界领先研究人员资助计划（NEXT Program）”的资助，该计划由科学技术政策委员会（CSTP）发起，并得到 JSPS 亚洲核心计划（Asian CORE Program）的支持。

1. GNS 样品制备
<ol>
	<li>在制备样品前，将1 ml金纳米壳（GNS）胶体溶液在约40 kHz条件下超声处理至少15分钟，以防止颗粒聚集，否则可能导致局域表面等离子体共振（LSPR）峰发生偏移。</li>
	<li>取100–200 µl GNS胶体溶液滴加到带有商用硅酸镁铝（MAS）涂层的载玻片上，以固定GNS颗粒。</li>
	<li>静置至少1分钟后，用蒸馏水冲洗去除多余的胶体溶液。静置时间取决于所需的GNS分布密度。通常，静置1–3分钟可获得适宜的密度，使颗粒易于识别，因为大多数颗粒彼此分离。若静置时间过长，可能发生显著聚集。</li>
	<li>用氮气吹扫使样品干燥。</li>
	<li>（可选）为高分辨率定位玻璃基底上的GNS颗粒，可在此阶段进行扫描电子显微镜（SEM）观察23。示例图像见图1，显示了GNS颗粒的典型分布密度。使用场发射SEM获取图像。一旦在样品上添加油（下一步操作），将难以去除油分并用SEM观察样品。</li>
	<li>在样品上滴加一滴折射率相同的油，覆盖GNS颗粒，以消除玻璃基底产生的强反射。</li>
	<li>在样品上方加盖盖玻片，并用指甲油密封。</li>
	<li>至少等待5分钟，直至指甲油完全干燥。此时样品制备完成。</li>
</ol>
2. 自制共聚焦显微镜的校准
<ol>
	<li>参见图2了解装置示意图。首先对显微镜本体的白光照明光路进行准直。打开显微镜的卤素光源，并按照显微镜制造商的操作手册调节至科勒照明状态。确保白光卤素光束在物镜后孔径处近似平行，部分被50/50分束器反射后射向激光光路方向。</li>
	<li>打开振镜，确保其处于正确初始位置，即扫描范围的中心位置。</li>
	<li>在卤素光路中沿光路方向放置至少两个由带有同心圆环的薄纸片制成的靶标，并使光束与这些靶标对齐。</li>
	<li>进行成像时，选择532 nm激光器；进行光谱测量时，选择超连续谱激光器。在对准过程中，激光在物镜后孔径处的功率应低于10 μW，以避免非线性效应。然后借助上述两个靶标，将入射激光束与出射的卤素光束反向准直。此步骤完成后，即实现激光光束的粗略对准。</li>
	<li>调节激光束使其通过物镜后孔径的中心。通常使用油浸物镜。在油浸物镜与GNS样品之间滴加一滴浸油。使用光电倍增管（PMT）作为探测器，收集GNS的散射信号。</li>
	<li>在PMT前方放置一个直径为20 µm的针孔，以阻挡离焦的散射信号。打开振镜和PMT（通过自行开发的软件），调节针孔位置以及样品台的高度，以最大化GNS的背向散射信号，随后在计算机屏幕上观察单个GNS。正确对准时GNS的xy平面图像示例如图2B所示。</li>
	<li>轻微调节样品台高度以检查焦点的同心性。若不同心，则调节扫描器前方的两个反射镜，直至在改变样品台高度时GNS的中心位置保持不变。确保点扩散函数（PSF）的xz截面图像与图2C相似，以验证光束对准正确。对这两幅图像使用低通滤波和高斯平滑滤波进行处理。</li>
</ol>
3. 散射非线性的表征
<ol>
	<li>在低激发强度（小于 104 W/cm2）下，按照方案 2.6 获取金纳米颗粒的图像。</li>
	<li>在 ImageJ（或其他图像分析软件）中打开图像。在图像中的一颗 GNS 上画一条线（见图 2B），并使用 ImageJ 工具中的“分析 -> 剖面图”功能获取散射强度分布曲线。使用高斯函数拟合所选点扩散函数（PSF）的分布曲线： 
	<img alt="数据拟合中用于峰拟合的高斯函数公式" src="/files/ftp_upload/53338/53338eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 2"> 
	其中 y 为 PMT 读出值，y0 为背景值（若有），A 为峰幅值，w 为宽度，x 为空间坐标，xc 为高斯函数的中心坐标。相应 PSF 的半高全宽（FWHM）为 (½ln2)w。根据物镜的数值孔径（NA），共聚焦 PSF 的理论 FWHM 可估算为约 0.43l/NA，其中 l 为激发波长。比较这两个数值以检查成像系统的对准情况。</li>
	<li>通过手动调节图 2A中的中性密度（ND）滤光片来提高激发强度，并在每个强度水平下记录后向散射图像。提取不同激发强度下各 GNS 中心处的散射信号值，绘制散射信号与激发强度的关系曲线。检查前几个数据点的线性关系，在激发强度足够低时应呈现线性关系。根据前几个点的线性拟合结果绘制一条直线。若后续数据点的散射强度低于该线性趋势，则表明已发生饱和。</li>
	<li>观察到可饱和散射后，逐步将激发强度降低至饱和阈值以下，再次对相同的 GNS 进行成像，以验证非线性行为的可逆性。</li>
</ol>
4. 单个金纳米球散射光谱的测量
<ol>
	<li>为了测量单个金纳米壳（GNS）的背向散射光谱，使用超连续谱激光器作为激光光源。激光器的初始波长范围为 450 nm 至 1,750 nm。为去除可能对样品和光学元件造成损伤的多余红外光功率，在超连续谱激光器后放置一至两面镜子，反射可见光部分，并使用光束吸收器收集多余的红外光。</li>
	<li>按照第2节中的对准步骤，将超连续谱激光导入激光扫描共聚焦显微镜。使用宽带50/50分束器，以确保在整个可见光范围内实现光谱覆盖。</li>
	<li>获取玻璃基底上GNS的图像。在图像中定位一个孤立的GNS，并将入射宽带光的焦点固定在该颗粒上。</li>
	<li>使用光电倍增管（PMT）前方的翻转镜，将背向散射信号引导至配备有电荷耦合器件的光谱仪，然后采集所选单个GNS的光谱。需注意，此处获得的光谱是GNS散射信号与来自其他表面反射所形成的背景信号的混合。</li>
	<li>切换回PMT探测器，再次成像以确认颗粒位置未发生移动。随后，将焦点移至无颗粒存在的区域。再切换回光谱仪，采集另一段光谱，该光谱代表背景信号。</li>
	<li>从步骤4.4获得的光谱中减去步骤4.5采集的背景光谱，从而获得清晰的单个GNS背向散射光谱。</li>
</ol>
5. SAX 显微镜的校准
<ol>
	<li>参见图3中的SAX显微镜示意图，其中理想的正弦时间调制由两个声光调制器（AOM）之间的拍频产生。首先，调节激光束的尺寸以满足后续AOM的要求。使用50/50分束器将532 nm激光分为两束。</li>
	<li>将两束光分别导入两个AOM中，每束光通过一个AOM。两个AOM的调制频率必须不同。例如，一个设为40.000 MHz，另一个设为40.010 MHz，从而产生10 kHz的差频。该差频即为SAX信号的基本调制频率fm。</li>
	<li>取两个AOM的一级衍射光束，并使用另一个50/50分束器将两束光合并。调节AOM后的反射镜，使两束光准直。</li>
	<li>连接一个与示波器相连的光电探测器以监测时间调制。用一片载玻片分出一小部分激光并送入光电探测器，如图3所示。在正确调制和光束重叠的情况下，应观察到以主频率fm为中心的正弦强度调制，类似于图4所示的波形。 
	注意：为了获得最大的调制深度，调制背景应尽可能低。此外，使用示波器的傅里叶分析功能检查调制的谐波失真是否逐渐减小。为成功实现SAX，需确保激发强度调制接近完美的正弦波形，并将初始非线性降至最低。</li>
	<li>断开光电探测器的电信号输出与示波器的连接，并将其接入锁相放大器的参考输入端。</li>
	<li>如图3所示，按照先前的协议将激光束对准共聚焦系统。此处，将PMT的电信号输出连接至锁相放大器作为信号输入。</li>
	<li>使用空白盖玻片作为样品，通过逐步增加激发功率来检查电检测系统的线性度，如图5所示，其中探测器在读出值低于1 V时呈线性。在所有后续测量中，需确保读出值保持在此值以下。</li>
	<li>设置锁相放大器输出电压信号的绝对幅值。通过改变参考通道的谐波分量设置，获取SAX信号的幅值A1、A2等。</li>
	<li>将锁相放大器输出的线性和非线性信号导入数据采集卡，该采集卡同时接收光栅扫描振镜的驱动电压信号。借助定制的Labview程序，同步锁相放大器与振镜的信号以生成图像。</li>
	<li>为优化图像中的信噪比，应适当选择锁相放大器的像素采集时间和积分时间。例如，当激发光的主调制频率fm为10 kHz（即周期为100 µsec）时，应将锁相放大器的积分时间设置为至少是该周期的三倍。结合振镜运动时间，在SAX成像模式下，采集速度设定为每秒1,500像素。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在该方案中，有几个关键步骤。首先，在制备样品时，纳米颗粒的密度不应过高，以避免颗粒之间的等离激元耦合。如果两个或多个颗粒彼此非常接近，耦合会导致局域表面等离激元共振（LSPR）波长向长波方向移动，从而显著降低非线性效应。然而，这种成像技术实际上映射的是等离激元模式的分布，而非颗粒本身。因此，预期在合适的激发波长下，耦合的等离激元模式也能表现出强烈的散射非线性，并可实现分辨率增强的成像。第二，必须在激发光束中产生纯正弦调制，这促使采用两个声光调制器（AOM）之间的拍频技术。由于分辨率的提升依赖于提取散射信号调制中的非线性部分（即谐波频率成分），如果激发调制中存在非线性失真，则提取过程将更加困难。此外，在当前方案中，使用干涉仪结构来产生拍频调制，因此干涉仪中两束光的准直对实现尽可能大的调制深度也至关重要。第三，必须确保信号的非线性并非来源于探测系统（包括探测器、放大器、模数转换器和计算机输入/输出）。因此，需特别注意保证探测系统工作在线性动态范围内。动态范围定义为探测系统线性响应的区间，即从噪声水平到探测器饱和之间的范围。在当前情况下，探测到的电压信号在1 V以下呈线性，噪声水平低于10-4 V。因此，系统提供的动态范...

等离激元学的研究因其在多个不同领域的应用而受到广泛关注1-4。等离激元学中最受关注的研究领域之一是表面等离激元，即在金属与电介质界面处，传导电子的集体振荡与外部电磁波发生耦合。表面等离激元已被探索用于亚波长光学、生物光子学和显微技术等潜在应用5,6。由于局域表面等离激元共振（LSPR）导致金属纳米颗粒在超小体积内产生强烈的场增强效应，引起了广泛的研究兴趣，这不仅源于其对颗粒尺寸、颗粒形状以及周围介质介电特性的极高敏感性7-10，也因其能够显著增强本征较弱的非线性光学效应11。LSPR 的极高灵敏度在生物传感和近场成像技术中具有重要价值12,13。另一方面，等离激元结构增强的非线性特性可应用于光子集成回路中的光开关和全光信号处理等领域14,15。众所周知，在低激发强度下，等离激元吸收与激发强度呈线性正比关系。当激发强度足够高时，吸收达到饱和。有趣的是，在更高强度下，吸收再次增加。这些非线性效应分别被称为可饱和吸收（SA）15-17 和反饱和吸收（RSA）18。
已知由于局域表面等离子体共振（LSPR），等离激元结构中的散射特别强烈。根据基本电磁理论，散射响应与入射光强度之间应呈线性关系。然而，在纳米颗粒中，散射和吸收通过米氏理论（Mie theory）紧密关联，二者均可表示为介电常数的实部和虚部的函数。假设单个金纳米壳（GNS）在光照下表现为一个电偶极子，根据米氏理论，单个等离激元纳米颗粒的散射系数（Qsca）和吸收系数（Qabs）可表示为19
<img alt="电磁散射方程、示意图、Q_sca 和 Q_ext 公式的分析。" src="/files/ftp_upload/53338/53338eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="方程 1">
其中 x 为 2πa/λ，a 是球体的半径，m2 为 εm/εd。这里，εm 和 εd 分别对应金属和周围介质的介电常数。由于散射系数的形式与吸收系数相似，因此预期在单个等离激元纳米粒子中可观察到可饱和散射20。
最近，孤立等离激元颗粒中的非线性饱和散射首次得到证实21。值得注意的是，在深度饱和状态下，当激发强度增加时，散射强度实际上略有下降。更引人注目的是，当激发强度在散射达到饱和后继续增加时，散射强度再次上升，表现出逆饱和散射效应20。波长和尺寸依赖性研究表明，局域表面等离激元共振（LSPR）与非线性散射之间存在强烈关联21。等离激元散射的强度和波长依赖性与吸收行为非常相似，表明这些非线性现象具有共同的物理机制。
在应用方面，众所周知非线性效应有助于提高光学显微镜的分辨率。2007年，饱和激发（SAX）显微技术被提出，该技术可通过对外部激发光束进行时间上的正弦调制，提取饱和信号，从而实现分辨率的提升22。SAX显微技术的基本原理是：在激光聚焦光斑中，中心区域的光强高于边缘区域。如果信号（无论是荧光还是散射）表现出饱和特性，则饱和现象必然从中心区域开始，而边缘区域仍保持线性响应。因此，若存在一种方法能够仅提取饱和部分的信号，则可保留中心区域信号并抑制边缘区域信号，从而有效提升空间分辨率。理论上，只要达到深度饱和且强光照射不会对样品造成损伤，SAX显微技术不存在分辨率的下限。
研究表明，利用SAX技术可显著提高荧光成像的分辨率。然而，荧光成像存在光漂白效应的问题。结合散射非线性的发现与SAX的概念，可实现基于散射的超分辨率显微成像21。与传统的超分辨率显微技术相比，基于散射的方法提供了一种新型的无漂白对比机制。本文逐步描述了获取和提取等离激元散射非线性的操作流程，介绍了通过改变入射光强度来识别散射非线性的方法，并进一步详细阐述这些非线性效应如何影响单个纳米颗粒的成像，以及如何利用SAX技术相应地提高空间分辨率。

<table><tbody><tr><td>显微镜机身</td><td>Olympus, Japan</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>Olympus, Japan</td><td>UPlanSapo, 100X, NA 1.4</td><td></td></tr><tr><td>80 nm 金胶体</td><td>BBI Solutions, UK</td><td>EM.GC80</td><td></td></tr><tr><td>超连续谱激光器</td><td>Fianium, United Kingdom</td><td>SC400-2-PP</td><td></td></tr><tr><td>宽带介质反射镜</td><td>Thorlabs, USA</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>场发射扫描电子显微镜</td><td>JEOL, Japan</td><td>JSM-6330F</td><td>可选</td></tr><tr><td>光谱仪</td><td>Andor Technology, UK</td><td>Shamrock 163</td><td></td></tr><tr><td>电荷耦合器件</td><td>Andor Technology, UK</td><td>iDus DV420A-OE</td><td></td></tr><tr><td>声光调制器</td><td>IntraAction Corp., USA</td><td>AOM-402AF1</td><td></td></tr><tr><td>锁相放大器</td><td>Stanford Research Systems, USA</td><td>SR-830</td><td></td></tr><tr><td>MAS 涂层载玻片</td><td>Matsunami Glass, Japan,</td><td>S9215</td><td></td></tr></tbody></table>

单个等离激元纳米粒子散射非线性的测量

Measurement of Scattering Nonlinearities from a Single Plasmonic Nanoparticle

等离激元学基于光激发引起的电子集体振荡，涉及显著增强的局域电场，因此在需要极高光强的非线性光学领域具有潜在应用价值。在等离激元学中，研究最为广泛的非线性效应之一是非线性吸收，包括饱和吸收和反饱和吸收行为。尽管根据米氏理论（Mie theory），纳米颗粒的散射与吸收密切相关，但直到最近才有关于等离激元散射中非线性效应的报道。
去年，首次在单个等离激元粒子中不仅实现了散射的饱和，还实现了散射的反向饱和。结果表明，可饱和散射具有明显的波长依赖性，这种依赖性似乎与局域表面等离激元共振（LSPR）直接相关。结合强度依赖性测量结果，这些发现提示散射和吸收的非线性行为可能源于共同的机制。单个金纳米球（GNS）散射的这些非线性特性具有广泛的应用前景，包括超分辨显微技术和光开关器件。
本文详细描述了如何测量单个金纳米颗粒（GNP）散射的非线性特性，以及如何利用基于饱和散射的超分辨率技术来提高光学成像分辨率。该发现首次实现了基于非线性散射的超分辨率显微成像，这是一种新型的不发生漂白的对比机制，分辨率可低至l/8，在生物医学和材料研究中具有潜在应用价值。

图6展示了来自一个80 nm金纳米壳（GNS）的实测光谱。同一图中还给出了基于米氏理论计算的曲线，显示出极好的吻合。局域表面等离子体共振（LSPR）峰位于约580 nm处。在接下来的实验中，激光波长选用532 nm，因其位于等离激元吸收带内，可借助等离激元效应增强光散射，并实现散射饱和21。
图7展示了单个金纳米颗粒在不同激发强度下的散射图像，底行提供了每个颗粒的线轮廓，以突出其非线性特征。图像尺寸为 600 nm × 600 nm，像素大小为 13.8 nm。在常规的 xy 成像模式下，采集速度为每秒 234,000 个像素。每幅图像均对五次采集结果进行平均，以提高信噪比。
当激发强度低于 1.5 × 106 W/cm2 时，散射信号与激发强度呈线性关系，因此单个纳米颗粒的成像结果类似于激发光束的点扩散函数（PSF），具有标准的高斯轮廓。然而，当激发强度增加至 1.7 × 106</...

在分离的等离激元粒子中发现了可饱和和反可饱和散射，并将其作为一种新型的不漂白对比机制应用于超分辨率显微技术中。本文详细阐述了检测和提取非线性散射的实验步骤，以及如何借助饱和激发显微技术提高分辨率。

基于光激发引起的电子集体振荡的等离激元学，涉及显著增强的局域电场，因此……

本实验的总体目标是展示利用等离激元纳米结构的非线性散射实现分辨率增强。在光学显微镜领域，对比度和分辨率是最重要的两个因素。我们的技术基于新型散射对比机制，拓展至超分辨率成像领域。该技术的主要优势在于纳米颗粒的散射信号强、高度非线性且不发生漂白。演示该实验操作的是我实验室的研究生 Hsuan Lee。实验将在光学平台上进行，平台上放置有一台显微镜和两个激光光源。第一个激光光源是用于成像的532纳米连续波激光器。第二种是用于光谱测量的超连续谱激光器。这是成像和光谱测量的基本装置示意图。样品将被安装在共聚焦显微镜的压电定位平台上。来自532纳米激光的光通过中性密度滤光片。光束由分束器引导至检流计镜，从而在共聚焦显微镜物镜的焦平面内实现光栅扫描。向后散射的光由物镜收集，并聚焦到探测器上。首先校准显微镜的白光照明光路。使用环形照明下的卤素光源。为验证内部虹膜的对中情况，务必通过目镜或CCD观察八角形边缘是否清晰锐利。接下来，使用一张纸检查外部光路。通过沿光路移动纸张，验证光束被分束器部分反射并朝向激光器方向传播。现在，准备好纸制靶标以辅助进一步准直。靶标应位于带有同心圆环的薄纸上。将这些靶标沿光路放置，使其与卤素光束对齐。此处，一个靶标已放置在物镜后光阑的位置上。这是光路中另一个用于定位的目标。接下来，打开用于成像的532纳米激光器，以便对其进行准直调整。使用纸制目标辅助准直入射激光，使其与卤素光源的光束方向相反。在移除目标并继续操作之前，需进一步精细调整激光束。激光对准后，为实验准备一个已制备的金纳米球样品。该样品中含有分散在油中的80纳米金纳米球。将混合物密封在两块玻璃板之间。随后将样品固定在显微镜载物台上，并添加镜油。此时，准备检测系统以进行成像。在光路末端使用光电倍增管收集散射光。沿光束路径返回方向，设置一个直径为20微米的针孔，以阻挡失焦的散射光进入光电倍增管。开启振镜和光电倍增管后，开始成像。观察计算机显示器，查看金纳米颗粒的背向散射信号。通过调整针孔位置和样品台高度，使背向散射信号达到最大。共聚焦显微镜校准后，表征样品的散射非线性特性。为此，首先使用功率计测量物镜后方的激光功率。读数应小于10微瓦，对应激发强度低于10的4次方瓦特每平方厘米。然后，使用光电倍增管采集金纳米颗粒的图像。在图像分析软件中打开捕获的图像，以表征散射强度分布。在图像中选择一个金纳米球，并在其上画一条线。然后，按照软件中的步骤获取散射分布曲线。将曲线拟合为高斯分布，以进一步检查成像系统的对准情况。现在开始系统地扫描不同的激发强度。首先，更换中性密度滤光片以增加激发强度。确定新的激发强度，并在新的强度水平下记录背向散射图像。使用该图像提取纳米球的散射轮廓，方法与之前相同。绘制散射轮廓，并将其在球体中心位置的数值确定为散射信号。重复这些步骤多次，以绘制散射信号与激发强度的关系图。图中蓝色点代表数据，红色线为多项式拟合结果。散射信号与较低的激发能量值之间存在线性关系。当散射信号低于该线性关系时，表明已发生饱和。下一步是对单个金纳米球进行光谱分析。该示意图提供了实验装置的概览。使用波长范围为 450-1750 纳米的超连续谱激光光源。同时，使用宽带 50/50 分束器，以确保在可见光谱范围内具有良好的光谱覆盖。在光电倍增管前放置一个翻转镜，将光引导至配备有电荷耦合器件的光谱仪。超连续谱激光器的准直应采用与532纳米激光器相同的步骤进行。在超连续谱激光器输出端，需采取一些预防措施以去除系统中多余的红外功率。在激光输出端之后、光束进入显微镜之前，在光路中放置反射可见光的反射镜。同时配合使用光束吸收器，收集可能对系统造成损害的红外辐射。激光对准后，采集金纳米球的图像。观察图像并选择一个单独的纳米球进行研究。将入射宽带光的焦点固定在选定的纳米球上。接下来，确保光谱仪位于光路中。在此位置，翻转镜将入射光导向光电倍增管。重新调整镜面方向，使入射光进入光谱仪。继续收集单个金纳米颗粒散射光谱的数据。如本示例所示，测得的光谱将是纳米球散射与来自反射的背景信号的混合。采集光谱后，将翻转镜归位。将光线调整至直接照射到光电倍增管。再拍摄一张图像，以确认金纳米颗粒的位置未发生改变。接着，将宽带光源的焦点移至一个无颗粒的位置。再次调整镜片，将光引导至光谱仪，并进行另一次光谱测量。新的光谱为背景光谱，将从金纳米球的光谱中减去。这是通过从含金纳米球的光谱中减去背景光谱后得到的清晰背向散射光谱。对样品进行饱和激发显微成像需要不同的装置。这是饱和激发显微镜的示意图。激光源为532纳米激光器。使用50/50分束镜从激光源产生两束光。使每束光分别通过一个独立的声光调制器。不同的调制频率会产生拍频，该拍频将作为饱和激发信号的调制频率。利用另一个50/50分束器，合并来自声光调制器的一级衍射光束。为监测时间调制，使用玻璃载片将一小部分激光偏转至光电探测器。为检查系统，将光电探测器连接至示波器。确保未放置任何样品。在示波器上评估光电探测器的信号。如果调制和光束重叠正确，信号应为一个频率等于差频的正弦波。本实验中，预期的差频为10千赫兹。应尽量获得尽可能完美的正弦波形，并使非线性失真最小化。下一步是将锁相放大器整合到系统中。对于饱和激发显微镜，锁相放大器接收来自光电探测器和光电倍增管的输入信号。断开光电探测器与示波器的连接，并将其输出连接至放大器的参考输入端。将光电倍增管的输出端连接到锁相放大器作为信号输入。将放大器的输出信号发送至数据采集卡。此时，将样品安装在显微镜载物台上。使用相同的样品，其中包含悬浮在油中并密封于两块玻璃片之间的80纳米金纳米球。在测量时返回锁相放大器，将放大器设置为输出电压信号的绝对幅值。在此情况下，通过在通道1显示面板中选择R。改变参考通道的谐波分量设置，以获得饱和激发的单幅值。这些彩色图像是利用定制软件，通过同步和整合来自锁相放大器和检流计电机驱动电压的信号而生成的。扫描电子显微镜图像用于对比。这些图像展示了不同谐波分量下的分辨率提升效果。80 纳米金纳米球的实测光谱以红色显示。使用米氏理论计算出的实线显示出极好的一致性。局域表面等离子体共振位于580纳米处。上方的散射图像和下方的线轮廓随激发强度的不同而呈现出不同的特征。在低强度下，点扩散函数呈标准高斯分布。随着强度增加，函数出现展宽和平坦化，表明已达到饱和。在更高强度下，中心强度不再为最大值，导致点扩散函数呈环形（面包圈状）。最终，在反向饱和过程中，中心强度再次达到峰值。该图中不同激发强度下的中心强度对应的蓝色数据点，揭示了饱和与反向饱和的行为特征。数据点已通过一条红色的五次多项式曲线进行拟合。这些数据可用于提取谐波频率分量。谐波分量也可通过锁相放大器直接获取。左侧图为实验数据。右侧曲线图是使用五次多项式拟合进行计算的结果。两张图中均在曲线的特定强度处显示出下陷。例如，二次谐波中存在三个下陷。此外，在每个图中，对于每一级谐波，斜率在第一个极小值之后均会增大。只要操作得当，熟练掌握该技术后，整个实验可在三小时之内完成。在进行该实验过程中，需注意检查正弦调制的质量、探测系统的线性响应以及样品的机械稳定性。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用等离激元纳米结构的非线性散射实现分辨率提升。该技术为从事超分辨率显微成像领域的研究人员探索其他基本光-物质相互作用中的新型对比机制提供了极具前景的范例。

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工程

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单个等离激元纳米粒子散射非线性的测量

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