使用多通道双电场微流控芯片研究肺癌细胞的电趋性

本微流控实验的总体目标是评估激酶抑制剂在直接电场作用下对肿瘤细胞迁移的影响。因此，该方法有助于回答细胞电趋性研究中的关键问题，例如：决定癌细胞在电场引导下迁移的信号通路有哪些。该技术的主要优势在于，它是一种高度可重复且节省时间的电趋性研究方法，易于实施。

该技术的应用有助于诊断癌症的转移潜能。由于磁性癌细胞的运动能力可通过电场增强，因此该方法可为肿瘤细胞提供一种细胞内电学检测手段。

它还可应用于皮肤再生过程，例如伤口愈合。首先使用制图和设计软件绘制单个丙烯酸层的图案。保存图案，然后开启激光刻划仪。

将刻划仪连接到控制用笔记本电脑，点击设计好的图案文件以打开亚克力层的图案。接着，将一块空白亚克力板放置在激光刻划仪的 X、Y、Z 工作台上，并使用相应的激光刻划仪自动对位棒，以调节激光束焦点至板材表面。

将设计好的图案发送至激光刻划仪，对亚克力板进行直接加工。然后用镊子去除亚克力板上的保护纸，并用氮气吹净表面。将处理好的亚克力板叠放，置于热压机中，在110摄氏度下以每平方厘米2千克的压力热压45分钟，形成流动电刺激通道组件。

以相同方式制备双面胶带后，将洁净的盖玻片粘贴到流动电刺激通道组件上。然后使用超级胶水将13个丙烯酸适配器分别粘接到多通道双电场（MDF）芯片组件第一层的各个开口处，以建立MDF芯片盐桥网络。首先通过中等尺寸的进样和出样适配器，将地面塑料管连接至MDF芯片组件。

接下来，将中等大小的进液口和出液口塑料管的接头连接至三通旋塞。在进液口塑料管的三通旋塞上连接一支含有2.5 mL经二氧化碳平衡的PBS的3 mL注射器，在出液口塑料管的三通旋塞上连接一支空的3 mL注射器。使用白色实心手指拧紧螺母密封第一层亚克力板上蓝色和绿色接头的开口。然后，用经二氧化碳平衡的PBS填充盐桥通道和培养室，注意避免产生气泡。

将芯片转移至37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养箱中过夜，使双面胶中的溶解空气在第二天早晨于腔室内形成气泡。使用两个注射器产生快速的PBS流，必要时来回推动PBS以冲洗去除气泡。当所有气泡均被清除后，使用连接在培养基出口管路上的三通旋塞阀将通道中的PBS排出。

然后，将连接在入口处的注射器更换为含有 2.5 毫升经二氧化碳饱和的 DMEM 的 3 毫升注射器，并用培养基重新充满腔室。当腔室充满后，取下绿色接头上的固定螺母，将加热至至少 70 摄氏度的 3% 琼脂糖注入盐桥通道。通过接头上的开口注入热琼脂糖，制备用于注射的盐桥，确保阻断培养腔室之间的中排通道。

当化合物填充至盐桥通道长度的四分之三时，停止注入琼脂糖，并用实心螺母重新封住孔口。随后，将蓝色接头上的实心螺母替换为半透明管状手紧螺母，并向管状螺母中加入琼脂糖。在琼脂糖凝固之前，将银/氯化银电极插入管状螺母中。

为建立电趋性实验，通过出口管路将 0.3 毫升细胞注入 MDF 芯片中，并将芯片放回细胞培养孵育箱。孵育 2 至 4 小时后，将 MDF 微流控系统安装至透明的氧化铟锡玻璃加热器上，并在 MDF 芯片与氧化铟锡玻璃之间安装 K 型热电偶。为测量芯片温度，使用比例-积分-微分控制器将 MDF 微流控系统的孵育温度设定为 37 °C，并将温度可控的 MDF 芯片组件安装至倒置显微镜的计算机控制 XYZ 电动载物台上。

然后使用四通道注射泵，以每小时 20 µL 的流速通过入口将完全培养基注入培养腔室，并用微量离心管从出口收集培养废液。将细胞在 37 °C 下继续孵育 16 至 18 小时。

第二天，将每个腔室中的培养基更换为新鲜培养基，并加入适当浓度的激酶抑制剂，处理 60 分钟。然后通过银/氯化银电极和串联电路将直流电源连接到 MDF 芯片。将电流表接入电路，以监测 MDF 芯片中的电流。

最后打开电源，将电压调节至15至19伏之间。将电流表的电流设定为86.94微安。在此具有代表性的MDF微流控系统实验中，肺癌细胞经不同浓度的激酶抑制剂处理。

在有无电刺激的情况下，Y 2 7 6 3 2 均未引起细胞迁移速度的变化。然而，在施加电场的条件下，Y 2 7 6 3 2 处理显著降低了癌细胞迁移的定向性。事实上，在50微摩尔浓度下，ROCK抑制剂完全消除了细胞的定向移动，但并未影响其迁移速度。

此外，所施加的化学浓度与导向性指数之间存在剂量依赖性相关性，证实了MDF微流控系统作为研究轴突生长（axxis）方法的可靠性和高效性。一旦掌握，该技术在成功开发后若操作得当，可在七到八小时内完成。该技术为电生理学领域（electro Texas）的研究人员提供了探索皮肤中神经反应的新途径。

请注意，使用激光剥离仪可能具有极高的危险性，在进行此操作时应始终采取必要的安全预防措施。