Name: 珠嫁接到发展鸡胚四肢识别信号转导途径影响基因表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 了解如何通过珠嫁接到发育中的鸡胚四肢来研究生长因子和抑制剂对基因表达的影响。该方法利用鸡胚模型系统直接测试信号分子在体内的作用，为发育生物学研究提供可靠的技术手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分由诺丁汉大学授予DS的早期职业奖资助。RM由伊拉克高等教育发展委员会资助。

伦理声明：所有这些实验均遵循诺丁汉大学的动物护理与伦理准则。
1. 准备用于移植的肝素珠
<ol>
	<li>使用前用 PBS 充分洗涤肝素珠。注意：珠子可作为 PBS 悬液在 4 °C 下保存。
	<ol>
		<li>用 20 µl 移液器将珠子从储备液中移至 1 ml PBS 液滴中，以选择用于移植的珠子。然后使用设定为 2 µl 的微量移液器将珠子转移至 3 cm 培养皿中 20 µl 的 PBS 液滴内。根据珠子大小进行挑选，并在体视解剖显微镜下使用 P2 移液器吸头转移所选珠子；直径约 100 µm 的珠子最为理想。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除珠子中的 PBS。先用 20 µl 移液器吸除大部分液体，再用精细钟表镊通过毛细作用除去残留液体。注意：应尽可能彻底去除液体，以免加入生长因子时被稀释。</li>
	<li>将生长因子直接滴加到珠子上。对于 FGF18，加入 0.5 µl 用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬至 0.5 mg/ml 的重组 FGF18。在培养皿边缘放置数滴水，以防止液体蒸发。</li>
	<li>在室温下孵育珠子 1 小时。用巴斯德移液管吸除培养皿边缘的水滴，然后将珠子置于冰上，准备用于移植。</li>
	<li>如需要（针对透明珠子），在移植前将 4–5 个珠子转移至 2% 酚红溶液中，以帮助可视化观察。在转移至胚胎前用 PBS 洗涤。</li>
</ol>
2. 用于接枝的AG 1-X2珠的制备
<ol>
	<li>使用前，用 0.2 N 甲酸对珠子进行衍生化处理。
	<ol>
		<li>使用刮勺将珠子转移至 1.5 ml 微量离心管中，加入 1 ml 0.2 N 甲酸，在摇床上洗涤 1 小时。</li>
		<li>然后用 p1000 移液器吸除甲酸，加入 1 ml 水，洗涤 1 小时，并重复此步骤六次，以去除残留的甲酸。</li>
		<li>用 p1000 移液器吸除剩余液体，将珠子储存在 4 °C。注意：此阶段无需完全去除残留水分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用小刮勺从储备液中取出约 5–10 µl 体积的小珠子团块，放入一个 3 cm 培养皿中，并加入 1 ml DMSO（或药物所用的其他溶剂）。注意：此操作应可提供数百颗珠子，以便挑选合适尺寸的珠子。</li>
	<li>然后使用设定为 2 µl 的 P2 移液器，将直径约为 100 µm 的珠子转移至另一个 3 cm 培养皿中的 20 µl 溶剂液滴中。</li>
	<li>用 20 µl 移液器吸除溶剂，再用 2 µl 移液器吸除任何残留溶剂，随后加入 20 µl 待用药物。 
	注意：为保证一致性，建议将药物溶解于 DMSO（或其他所用溶剂）中，浓度为 100 µM，分装为 20 µl 后储存于 -80 °C，因为某些小分子抑制剂不稳定，应避免反复冻融。如有需要，可在浸泡珠子前将药物稀释至所需浓度。每种药物的有效浓度可能需要通过实验确定。</li>
	<li>孵育 1 小时。由于这些分子中许多对光敏感，需避光操作。</li>
	<li>移植前，使用设定为 2 µl 的 p2 移液器将 4–5 颗珠子转移至 20 µl 含 2% 酚红的水溶液中。此步骤需在体视显微镜下进行，以便观察珠子。用精细钟表镊或金属环取出单个珠子，在转移至胚胎前用 PBS 漂洗。珠子在 2% 酚红溶液中停留不得超过 15 分钟，否则可能导致活性丧失。</li>
</ol>
3. 准备受钨针
<ol>
	<li>将细钨丝剪成3-4厘米长的小段。取一段钨丝插入玻璃巴斯德吸管末端，并在本生灯上加热熔化以固定位置。最多制备10根针具，以便在使用过程中如有损坏可替换备用。</li>
	<li>将金属丝末端放入喷灯火焰中，并保持至钨丝发白光且尖端变尖锐（约2-3分钟）。注意：使用过程中可根据需要将针头在喷灯中清理并重新 sharpen。 
	注意：这些针头也可用于制作转移微珠的环状工具。轻轻将针头接触台面，即可弯曲形成环状。</li>
</ol>
4. 准备受精卵用于珠粒移植
<ol>
	<li>将鸡蛋钝端朝上孵育，直至达到所需发育阶段（大多数肢芽操作为3-5天）。使用钝头镊子轻敲钝端以打破蛋壳，然后用镊子去除蛋壳并暴露胚胎。确保同时去除蛋壳膜。 
	注意：若膜粘附于卵黄，可用巴斯德移液管加入1-2 ml PBS辅助操作。将PBS轻轻滴加至卵黄表面，用镊子夹住膜并小心避免损伤卵黄，然后轻轻将其从蛋中拉出。</li>
	<li>使用10 ml注射器和19 G针头从蛋中抽出最多5 ml蛋白液。仅抽取所需量，以确保胚胎不会接触到用于封口的胶带；抽取过多液体可能降低胚胎存活率。</li>
	<li>为观察胚胎，将5-6滴绘画用印度墨水加入含100 U青霉素和0.1 mg链霉素/ml的15 ml PBS中。使用1 ml注射器和25 G针头将0.5-1 ml该溶液直接注射至胚胎下方。</li>
	<li>向蛋内加入2-3 ml含1%胎牛血清及100 U青霉素和0.1 mg链霉素/ml的PBS，以防止胚胎脱水。使用 sharpened 钟表匠镊子去除卵黄膜，并打开发育中肢芽上方的羊膜。确保胚胎不干燥，必要时可补充PBS/FCS。 
	注意：肢芽可清晰见为胚胎体侧成对的外突结构。在此阶段，胚胎通常会翻转，使右侧朝上。因此，通常更便于将珠子移植至右侧肢芽，并以左侧作为对侧对照。</li>
	<li>使用 sharpened 钨丝在拟植入珠子的部位切开肢芽。应尽量避免完全切透肢芽，但在较早期阶段此操作较为困难。 
	注意：在较晚期胚胎（HH 22期及以上）中，可选择肢芽特定区域进行移植；而在较早期阶段，由于肢芽本身较小，操作难度较大。还需注意，肢芽将沿珠子远端方向继续生长，因此尤其在早期阶段，珠子将保留在近端肢体区域。</li>
	<li>使用超细钟表匠镊子或由钨针制成的环状工具，从生长因子或药物溶液中拾取珠子。若珠子曾浸泡于DMSO或酚红中，应用PBS冲洗后再施用于胚胎。用镊子或钨丝环将珠子转移至胚胎处，再用 sharpened 钨丝将珠子插入切口内。</li>
	<li>向蛋内加入1-2 ml PBS/FCS，确保胚胎保持湿润，但避免直接滴加于胚胎表面，以防损伤胚胎或导致珠子移位。用胶带密封蛋壳后放回培养箱。</li>
</ol>

<ol><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li>
<li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).</li>
<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest%3A+a+long+and+still+ongoing+story%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li>
<li>Bell, E., Brickell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+retroviral+vectors+for+expressing+genes+in+avian+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo.</a> Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).</li>
<li>Abu-Elmagd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2FLef1+signaling+acts+via+Pitx2+to+regulate+somite+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis.</a> Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).</li>
<li>Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+signals+from+the+neural+tube%2C+floor+plate+and+notochord+induce+myogenic+bHLH+gene+expression+in+the+somite%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite.</a> Development. 121, 651-660 (1995).</li>
<li>McGrew, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+germline+transgenic+chickens+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors.</a> EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).</li>
<li>Valasek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+investigations+into+the+development+of+the+pectoral+girdle%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle.</a> Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).</li>
<li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).</li>
<li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li>
<li>Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+application+of+retinoic+acid+to+the+limb+bond+mimics+the+action+of+the+polarizing+region%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region.</a> Nature. 296, 564-566 (1982).</li>
<li>Rosello-Diez, A., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulative+patterning+in+limb+bud+transplants+is+induced+by+distalizing+activity+of+apical+ectodermal+ridge+signals+on+host+limb+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells.</a> Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).</li>
<li>Anakwe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+regulates+myogenic+differentiation+in+the+developing+avian+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing.</a> Development. 130, 3503-3514 (2003).</li>
<li>Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+timing+differentiation+during+limb+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The importance of timing differentiation during limb muscle development.</a> Current Biology. 8, 642-652 (1998).</li>
<li>Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scatter+factor%2Fhepatocyte+growth+factor+%28SF%2FHGF%29+induces+emigration+of+myogenic+cells+at+interlimb+level+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo.</a> Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).</li>
<li>Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+FGF18+and+retinoic+acid+regulate+differentiation+of+chick+embryo+limb+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts.</a> Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).</li>
<li>Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klhl31+is+associated+with+skeletal+myogenesis+and+its+expression+is+regulated+by+myogenic+signals+and+Myf-5%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5.</a> Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).</li>
<li>Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%28beta%29-catenin+in+the+developing+chick+myotome+is+regulated+by+myogenic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals.</a> Development. 127, 4105-4113 (2000).</li>
<li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1%2F2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li>
<li>Martinez-Morales, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+and+retinoic+acid+activity+gradients+control+the+timing+of+neural+crest+cell+emigration+in+the+trunk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk.</a> Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).</li>
<li>Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signals+provide+a+timing+mechanism+for+the+FGF-retinoid+differentiation+switch+during+vertebrate+body+axis+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension.</a> Development. 134, 2125-2135 (2007).</li>
<li>Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-box+and+homeobox+transcription+factors+suggests+roles+in+controlling+chick+limb-type+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity.</a> Development. 125, 2825-2835 (1998).</li>
<li>Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somite+patterning+by+Sonic+hedgehog+and+its+downstream+signal+response+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes.</a> Development. 125, 777-790 (1998).</li>
<li>Sweetman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-4+signaling+is+involved+in+mir-206+expression+in+developing+somites+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).</li>
<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).</li>
<li>Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+migration+of+paraxial+and+lateral+plate+mesoderm+cells+emerging+from+the+late+primitive+streak+is+controlled+by+different+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals.</a> BMC Developmental Biology. 8, 63(2008).</li>
<li>Scott, B. B., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tissue-specific+transgenic+birds+with+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).</li>
<li>Seidl, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+quail+as+a+model+for+research+in+the+avian+nervous+system%3A+a+comparative+study+of+the+auditory+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem.</a> Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

将珠粒移植物直接应用于鸡胚发育组织是一种强大的工具，可用于解析生长因子信号在发育过程中的作用，能够无与伦比地控制其应用的发育阶段以及暴露持续时间。
为每种分子选择合适的珠子至关重要。小分子疏水性物质（例如本文所述的抑制剂和视黄酸）通常与衍生化的 AG 1-X2 珠子结合良好，但需通过实验经验性地验证每种抑制剂在这些珠子上的有效性。同样，对于生长因子，也可能需要测试不同类型的珠子。某些珠子是透明的，因此在操作过程中难以观察，但用酚红短时间处理后，再用 PBS 洗涤，即可使其着色足够长时间，便于完成移植操作。
在制备微珠时，特别是那些已浸泡过抑制剂的微珠，应尽可能避免光照。在初始处理和操作过程中，应将其遮盖，仅在转移微珠时才取出。最好使用 freshly thawed 分装试剂，因为某些试剂不稳定，若储存不当可能导致假阴性结果。此外，在移植前也不应将微珠在酚红中浸泡过久，以免降低微珠的活性。
这些珠粒移植中使用的生长因子和药物浓度通常非常高；FGF18 珠粒浸泡在 0.5 m...

鸟类胚胎多年来为发育研究提供了强有力的工具1。其最有用的特性之一是相对易于操作。由于胚胎体外发育，可以打开蛋壳以接触胚胎，并进行多种显微操作，例如经典的鹌鹑-鸡嵌合体系统用于研究细胞命运2,3，在发育过程中通过注射逆转录病毒实现特定组织中的基因过表达4,5，以及通过外植体培养来鉴定发育信号来源6。最近，将非标记宿主与表达GFP的转基因鸡系供体组织构建的嵌合体研究表明，经典移植技术与遗传修饰相结合可为发育机制提供重要见解7,8。
禽类胚胎易于操作的特性使其成为研究肢体发育的优良模型9特定生长因子在肢体发育过程中的应用 体内 在鉴定影响肢体模式形成的因素方面发挥了关键作用10,11 并持续为这一过程提供新的见解12该方法还被用于研究调控肌肉发育的因素，并揭示了多种信号分子的作用，例如 Wnts13BMPs14 和HGF15.
最近，该技术已被用于研究控制肢芽中成肌基因表达的信号，结果表明FGF18与视黄酸之间的相互作用可以调控MyoD表达的时间16。通过结合使用可加载到琼脂糖珠上的生长因子和小分子，并在特定发育阶段将其直接移植到特定组织中，可以在发育过程中的几乎任何时间和区域进行干预。该方法已被用于研究多种发育过程，包括体节模式形成17,18、神经特化19、神经嵴细胞迁移20以及体轴延伸21。
本文介绍了一种将浸泡过生长因子或抑制剂的珠子移植到发育中鸡胚肢体的方法。该方法已用于通过分析肌肉特异性基因表达来确定这些信号分子对肌生成的影响。 原位 杂交。我们描述了使用肝素浸泡的珠粒进行移植物操作，这种珠粒用于递送生长因子，或使用AG 1-X2珠粒递送疏水性小分子，如视黄酸或特定信号通路的小分子抑制剂。然而，也有其他类型的珠粒可用于递送FGFs22 和 Shh23.

<table><tbody><tr><td>肝素丙烯酸珠</td><td>Sigma</td><td>H5263</td><td>所用的丙烯酸-肝素珠已停产。但有替代产品可供使用，即肝素琼脂糖珠，货号 H6508。这些珠子是透明的，因此操作难度较大，但可用酚红染色，方法与 AG 1-X2 珠相同。</td></tr><tr><td>AG 1-X2 珠</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1231</td><td></td></tr><tr><td>Affi Gel 蓝色珠</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301; 153-7302</td><td>这些珠子已被用于多种生长因子（包括 Shh 和 FGFs），可作为肝素珠的替代品</td></tr><tr><td>FGF18</td><td>Peprotech</td><td>100-28</td><td>用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬，分装成每份 0.5–1 µl 的单次使用量，并于 -80&amp;deg;C 保存。不同批次和供应商的产品可能存在差异，因此应测试不同浓度以确定有效剂量。</td></tr><tr><td>U0126</td><td>Cell Signalling</td><td>9903</td><td>用 DMSO 配制成 20 mM 储存液，分装成单次使用量，于 -80&amp;deg;C 保存。避光。</td></tr><tr><td>BMS-493</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3509</td><td>用 DMSO 重悬，分装成单次使用量，于 -80&amp;deg;C 保存。避光。</td></tr><tr><td>黑色印度墨水</td><td>Windsor and Newton</td><td>5012572003384 (30 ml)</td><td>虽然该产品有替代品，但需谨慎选择，因为某些墨水对胚胎具有毒性</td></tr><tr><td>钨丝，直径 0.1 mm，纯度 99.95%</td><td>Alfa Aesar</td><td>10404</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>在 PBS/墨水和 PBS/FCS 中稀释 100 倍</td></tr></tbody></table>

将微珠移植至鸡胚肢体发育区域以鉴定影响基因表达的信号转导通路

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

利用鸡胚可直接检测生长因子或信号通路特异性抑制剂对基因表达及信号转导通路激活的影响。该技术能够在精确设定的发育阶段，于特定时间内递送信号分子。随后可收获胚胎并检测基因表达，例如通过 原位 杂交，或通过免疫染色观察到的信号转导通路激活。
在此视频中，将浸有 FGF18 的肝素珠或浸有 MEK 抑制剂 U0126 的 AG 1-X2 珠移植至肢芽中 在卵内这表明FGF18可诱导MyoD表达及ERK磷酸化，且内源性及FGF18诱导的MyoD表达均可被U0126抑制。经视黄酸拮抗剂浸泡的琼脂珠可增强FGF18对MyoD的过早诱导。
该方法可与多种不同的生长因子和抑制剂联用，且易于适用于发育中胚胎的其他组织。

在HH 21期，MyoD在发育中的肢芽成肌细胞中不表达，尽管可在发育体节的肌节中观察到染色信号（图1A）。图1B显示在植入FGF18包埋珠6小时后进行的原位杂交结果，靠近珠子的成肌细胞中MyoD被诱导表达，而在对侧未处理的肢体中无表达。若共植入经U0126（一种MEK特异性抑制剂）浸泡的珠子，则可阻断FGF18对MyoD的诱导作用（图1C）。同样，在HH 21期植入U0126包埋珠，24小时后检测MyoD表达，结果显示与未经处理的对侧肢体相比，内源性MyoD表达水平降低（图1D, E）。
在HH 19期的肢芽中，FGF18不能诱导MyoD的表达（图1F）。然而，共同移植经FGF18和视黄酸拮抗剂BMS493浸泡的琼脂珠可克服这一限制，并可检测到异位的MyoD表达（图1G）
为了证实 FGF18 是通过 MEK...

通过将浸泡过生长因子或特定信号通路抑制剂的微珠移植到发育中的胚胎中，可直接检测这些因子的作用效果 体内在此方案中，将含有分子的微珠植入肢芽，以确定这些分子对基因表达和信号转导的影响。

利用鸡胚，可直接检测生长因子或信号通路特异性抑制剂对基因表达的影响……

本实验的总体目标是展示如何确定生长因子和抑制剂对发育中鸡胚肢体基因表达的影响。该方法有助于回答发育生物学中的关键问题，例如信号分子如何在体内影响细胞的生长与分化。该技术的主要优势在于，它提供了一种直接在胚胎中测试这些因子作用的方法。尽管该方法可为肢体发育研究提供见解，但也适用于其他系统，如神经组织、体节或原肠胚形成。本次实验操作将由本实验室的研究生 Rebeea Mohammed 演示。首先，将一毫升珠子从原始储备溶液转移至新的离心管中。静置磁珠使其沉降，然后移除上清液，并加入一毫升 PBS。重复此步骤五次，将洗涤后的磁珠以 PBS 悬浮液形式于 4 摄氏度保存。使用 20 微升移液器从洗涤后的储备液中取出用于接枝的磁珠，转移至一毫升 PBS 中。使用体视显微镜，挑选直径约为100微米的微珠。将选好的微珠连同2微升液体转移至一个新的培养皿中，该培养皿内含有20毫升PBS液滴。接着，去除微珠周围的PBS液体。首先使用20微升移液器吸除大部分液体，然后用精密钟表镊通过毛细作用去除残留液体。尽可能去除液体非常重要，这样在将生长因子加入微珠时不会被稀释。将生长因子直接用移液器滴加到微珠上。对于 FGF18，加入 0.5 µL 重组 FGF18，用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬至浓度为 0.5 mg/mL。然后，在培养皿边缘滴加数滴水，以防止液体蒸发。准备好后，将珠子在室温下孵育一小时。孵育结束后，用巴斯德移液管将培养皿中的水滴移除，并将培养皿置于冰上。首先使用药匙将珠子转移至一个1.5毫升的微量离心管中，以对珠子进行衍生化处理。然后加入1毫升0.2当量的甲酸，并将珠子在摇床上于酸中孵育1小时。接着让珠子自然沉降，吸除甲酸，并加入1毫升水替代。在摇床上清洗磁珠一小时，并重复清洗六次，以去除残留的甲酸。最后一次清洗后，除去剩余液体，将磁珠于4°C保存。使用刮勺从原液中取出约五至十微升体积的小量磁珠，放入30毫升的培养皿中。然后，加入一毫升二甲基亚砜（DMSO）。接着，将P2移液器调至两微升，转移直径约为100微米的微珠至另一个30毫升培养皿中的20微升溶剂液滴中。使用20微升移液器除去大部分溶剂，再用2微升移液器除去残留溶剂。然后，用20 µL溶于DMSO中的待用药物覆盖微珠。将微珠在药物溶液中孵育1小时。注意避光，因为许多药物分子对光敏感。为了便于观察珠子，将四到五个珠子连同两微升液体转移至二十微升溶于水的2%酚红溶液中。用精细的钟表镊子取出单个珠子，并用PBS缓冲液冲洗该珠子。珠子在酚红溶液中停留时间不得超过15分钟，否则可能导致活性丧失。将细钨丝切成三到四厘米长的段。然后，取一段钨丝插入玻璃巴斯德吸管的一端，并在本生灯上加热熔化，以固定其位置。最多准备10根针，以便在损坏时有备用。接下来，将钨丝末端放入喷灯火焰中，保持直至钨丝发白炽光且尖端变尖锐。此过程大约需要两到三分钟。在含有每毫升100单位青霉素和0.1毫克链霉素的15毫升PBS中加入五到六滴绘图用印度墨水。为准备鸡胚，将鸡蛋钝端朝上孵育，直至达到肢体芽操作所需的理想发育阶段，通常为三至五天。当达到预期时间点时，使用钝头镊子轻敲鸡蛋的钝端以打破蛋壳。然后用镊子去除蛋壳，暴露胚胎。确保同时去除卵细胞膜。为了观察胚胎，使用1毫升注射器和21号针头，将添加了几滴绘图墨水的磷酸盐缓冲液（PBS）注入胚胎下方。随后可用精细镊子去除覆盖在胚胎上的卵黄膜。接着，向蛋内加入2至3毫升含1%胎牛血清、100单位/毫升青霉素和0.1毫克/毫升链霉素的PBS溶液，以防止胚胎脱水。使用锋利的钟表匠镊子，在发育中的肢芽上方切开羊膜。在此阶段，胚胎通常会翻转，使右侧朝上。必要时添加补充的 PBS 溶液，以确保胚胎不会干燥。可使用精细的钨针打开包围胚胎的羊膜，以暴露正在发育的肢芽。然后用锋利的钨丝在将要植入珠子的肢芽部位做一切口。应尽可能避免完全切透肢芽。尽管在较早期阶段操作较为困难，但需使用超细钟表镊夹取一个珠子，该珠子应包被有生长因子或药物。如果珠子曾浸泡在DMSO或酚红中，则在施加到胚胎之前，务必用PBS冲洗干净。使用镊子将小珠转移至胚胎，然后用锋利的钨丝将小珠插入切口位置。向卵内额外加入一到两毫升补充PBS溶液，以确保胚胎保持湿润。避免将溶液直接滴加到胚胎本身，因为这可能会损伤胚胎并导致小珠移位。接下来，使用一个带有19号针头的10毫升注射器，仅抽出足够的蛋清，以确保胚胎不会接触到用于密封蛋壳的胶带。为避免针头损伤蛋黄，应将针头沿蛋壳内壁缓慢滑入。最后，用胶带密封蛋壳，并将其放回培养箱中。为了证实 FGF18 能够通过 MEK 作用来磷酸化 ERK，我们在珠子移植后一小时收集胚胎，并对磷酸化 ERK 进行免疫染色，可在右侧图像中观察到移植珠子周围存在阳性信号。在 HH 21 期，MyoD 在发育中的肢体成肌细胞中不表达，尽管在发育中体节的肌节部分可见染色信号。在植入 FGF18 琼脂糖珠 6 小时后，可在靠近琼脂糖珠的成肌细胞中观察到 MyoD 的诱导表达，而在对侧肢体中则无表达。若将涂有 MEK 抑制剂（如 U0126）的琼脂糖珠与 FGF18 珠共同植入，则可抑制该表达。类似地，在HH 21期将U0126包被的琼脂珠移植后24小时，与未经处理的对侧肢体相比，MyoD的内源性表达减少。在肢芽中，HH 19期时FGF18不能诱导MyoD表达。然而，将浸泡过FGF18和视黄酸拮抗剂的琼脂珠共同移植可克服这一限制，并可检测到异位表达的MyoD。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三到四分钟内完成。该技术的开发使发育生物学领域的研究人员能够探索胚胎发育过程中的生长因子信号传导。在尝试该技术时，重要的是要记住切勿让胚胎干燥。观看本视频后，您应能充分理解如何将珠子植入正在发育的胚胎中，以确定生长因子信号传导对发育的影响。

grafting-beads-into-developing-chicken-embryo-limbs-to-identify

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

珠嫁接到发展鸡胚四肢识别信号转导途径影响基因表达

多种生长因子和蛋白质相互作用，诱导细胞在发育过程中分化为不同的细胞命运。在此，我们通过在E2.5鸡胚上放置含有蛋白的琼脂糖珠，展示如何利用鸡胚内实验体系来研究不同蛋白质在发育过程中的潜在相互作用。...

在早期鸡胚上放置包被生长因子的微珠

神经诱导是大脑形成的第一个步骤。该过程是一种由亨森结（组织中心）指导邻近组织获得神经命运的机制，即发育形成神经系统。本视频演示了在鸡胚中进行神经诱导实验的方法。...

鸡胚神经诱导检测方法

鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）是一种独特的天然免疫缺陷性支持培养环境，可用于研究血管生成和肿瘤发生。本视频文章展示了鸡胚ex...

小鸡 ex ovo 培养与 ex ovo CAM 检测：其工作原理详解

本文介绍了一种组织移植技术，旨在测试颅面发育过程中头部表面外胚层的信号传导和模式形成特性。...

评估颅面发育过程中外胚层上皮的信号特性

来源：Delalande, J.，等．利用鸡胚胎GFP神经管移植与碳菁染料DiI注射对鸡胚中的神经嵴细胞与血管进行双标记．J. Vis. Exp. （2015）本视频展示了将一只发育阶段相匹配的转基因鸡胚中表达GFP标记的供体神经管移植到受体鸡胚体节1至7水平区域，随后使用亲脂性荧光染料进行血管标记。该联合方法可在体视荧光显微镜下直接观察胚胎，从而实现对神经移植物整合及血管网络在卵内（in...

鸡胚中神经与血管网络的可视化

在发育过程中观察和接触鸡胚具有一定的挑战性。我们开发了一种简单、经济的体外培养（ex ovo）方法，可广泛应用于课堂教学或科研环境。该方法能够使研究者在胚胎发育的较晚阶段（HH...

优化的 体外培养 培养鸡胚胎至发育的较晚阶段

利用鸡胚GFP神经管移植与碳菁染料DiI注射对鸡胚中的神经嵴细胞与血管进行双重标记

斑马鱼是进行遗传学和发育学研究的优良模式系统。珠植入是一种有价值的组织操作技术，可通过改变局部细胞环境来探究发育机制。本方案描述了如何在斑马鱼胚胎中进行微珠植入。...

斑马鱼胚胎中的微珠植入

本文描述了在鸡胚中利用不可渗透屏障阻断主轴体与 flank...

应用不可渗透屏障结合候选因子浸泡微珠研究鸡胚中的诱导信号

重组肢体是一种强大的实验模型，可用于研究在胚胎信号影响下细胞分化及模式形成的过程。本方案介绍了一种利用鸡肢芽中胚层细胞生成重组肢体的详细方法，该方法可适用于从不同生物体获得的其他细胞类型。...

鸡胚胎重组肢体实验：解析形态发生、模式形成及细胞分化早期过程

浸泡珠实验涉及在发育的任意时间点将测试试剂靶向递送，以研究细胞分化和形态发生的调控。本文提供了一种详细的实验方案，适用于任何实验动物模型，介绍如何制备三种不同类型的浸泡珠，并将其植入鸡胚的趾间区域。...

利用浸润珠实验分析鸡胚胎发生过程中的细胞分化、形态发生与图式形成

了解如何通过珠嫁接到发育中的鸡胚四肢来研究生长因子和抑制剂对基因表达的影响。该方法利用鸡胚模型系统直接测试信号分子在体内的作用，为发育生物学研究提供可靠的技术手段。

将微珠移植至鸡胚肢体发育区域以鉴定影响基因表达的信号转导通路

探索更多视频