将微珠移植至鸡胚肢体发育区域以鉴定影响基因表达的信号转导通路

本实验的总体目标是展示如何确定生长因子和抑制剂对发育中鸡胚肢体基因表达的影响。该方法有助于回答发育生物学中的关键问题，例如信号分子如何在体内影响细胞的生长与分化。该技术的主要优势在于，它提供了一种直接在胚胎中测试这些因子作用的方法。

尽管该方法可为肢体发育研究提供见解，但也适用于其他系统，如神经组织、体节或原肠胚形成。本次实验操作将由本实验室的研究生 Rebeea Mohammed 演示。首先，将一毫升珠子从原始储备溶液转移至新的离心管中。

静置使磁珠沉降，然后吸去上清液，并加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。重复此步骤五次，将洗涤后的磁珠以PBS悬浮液形式保存于四摄氏度。使用20微升移液器从洗涤后的磁珠储备液中选取用于接枝的磁珠，并将其转移至一毫升PBS中。

使用体视显微镜，选择直径约为100微米的微珠。将所选微珠用2微升液体转移至一个新的培养皿中，该培养皿内含有20毫升PBS液滴。接着，去除微珠周围的PBS液体。首先使用20微升移液器移除大部分液体，然后用精细的钟表镊通过毛细作用去除残留液体。

尽可能去除液体非常重要，这样在将生长因子加入微珠时不会被稀释。将生长因子直接用移液器加到微珠上。对于 FGF18，加入 0.5 µL 重组 FGF18，用含 0.1% BSA 的 PBS 重悬至浓度为 0.5 mg/mL。

然后，在培养皿边缘滴加数滴水，以防止液体蒸发。准备好后，将微珠在室温下孵育1小时。孵育结束后，用巴斯德移液管除去培养皿中的水滴，并将培养皿置于冰上。

首先使用刮勺将珠子转移至一个1.5毫升的微量离心管中，以实现珠子的衍生化。然后加入1毫升0.2当量的甲酸，并将珠子在摇床上于酸中孵育1小时。接着让珠子自然沉降，吸除甲酸，并加入1毫升水替代。

在摇床上清洗珠子一小时，并重复清洗六次，以去除残留的甲酸。最后一次清洗后，除去剩余液体，将珠子储存在4°C。用刮勺从原液中取出约五至十微升体积的小量珠子，放入30毫升的培养皿中。

然后，加入一毫升二甲基亚砜（DMSO）。接着，将P2移液器调至两微升，吸取直径约为100微米的微珠，转移至另一个30毫升培养皿中的一滴20微升溶剂内。使用20微升移液器除去大部分溶剂，再用两微升移液器去除残留溶剂。

然后，用20 µL溶于DMSO中的待用药物覆盖微珠。将微珠在药物溶液中孵育1小时。注意避光，因为许多药物分子对光敏感。

为便于观察珠子，将四到五个珠子连同两微升液体转移至二十微升溶于水的2%酚红溶液中。用精细的钟表镊子取出单个珠子，并用PBS缓冲液冲洗该珠子。珠子在酚红溶液中停留时间不得超过15分钟，否则可能导致活性丧失。

将细钨丝切成三到四厘米长的段。然后，取一段钨丝插入玻璃巴斯德吸管的一端，并在本生灯上加热熔化，以固定其位置。最多准备10根针，以便在针损坏时有备用。接下来，将钨丝末端放入喷灯火焰中，保持在火焰中直至钨丝发白炽光且尖端变尖锐。

此过程大约需要两到三分钟。向含有每毫升100单位青霉素和0.1毫克链霉素的15毫升PBS中加入五到六滴绘画用印度墨水。准备鸡胚时，将鸡蛋钝端朝上放入培养箱中孵育，直至达到肢体芽操作所需的理想发育阶段，通常为三至五天。

当达到预期时间点时，使用钝头镊子轻敲鸡蛋的钝端以破裂蛋壳。然后用镊子去除蛋壳，暴露胚胎。确保同时去除卵细胞膜。

为了观察胚胎，使用1毫升注射器和21号针头，将添加了几滴绘图墨水的磷酸盐缓冲液（PBS）注入胚胎下方。随后可用精细镊子去除覆盖在胚胎上的卵黄膜。接下来，向蛋内加入2至3毫升添加了1%胎牛血清、100单位/毫升青霉素和0.1毫克/毫升链霉素的PBS，以确保胚胎不会脱水。

使用锋利的钟表匠镊子，在发育中的肢芽上方切开羊膜。在此阶段，胚胎通常会翻转，使右侧朝上。必要时添加补充的 PBS 溶液，以确保胚胎不会干燥。

可使用精细的钨针打开围绕胚胎的羊膜，以暴露正在发育的肢芽。然后用 sharpened 钨丝在将要植入珠子的肢芽部位做一切口。应尽可能避免完全切透肢芽。

尽管在较早期阶段操作较为困难，但需使用超细钟表镊夹取一个珠子，该珠子应预先包被有生长因子或药物。如果珠子曾浸泡在DMSO或酚红中，在将其施加于胚胎前，务必用PBS充分冲洗。

使用镊子将小珠转移至胚胎，然后用锋利的钨丝将小珠插入切口位置。向卵内额外加入一到两毫升的添加物PBS溶液，以确保胚胎保持湿润。避免将溶液直接滴加到胚胎本身，因为这可能会损伤胚胎并导致小珠移位。

接下来，使用一个带有19号针头的10毫升注射器，仅抽出足够的蛋清，以确保胚胎不会接触到用于封口的胶带。将针头沿蛋壳内壁滑入，避免损伤蛋黄。最后，用胶带密封蛋壳，并将其放回培养箱中。

为了证实 FGF18 能够通过 MEK 作用来磷酸化 ERK，我们在珠子移植后一小时收集胚胎，并对磷酸化 ERK 进行免疫染色，可在右侧图像中观察到移植珠子周围存在阳性信号。在 HH 21 期，MyoD 在发育中的肢芽成肌细胞中不表达，尽管在发育中体节的肌节区域可见染色信号。

在移植 FGF18 珠六小时后，可在靠近珠子的成肌细胞中观察到 MyoD 的诱导表达，而在对侧肢体中则无表达。若共移植包被有 MEK 抑制剂（如 U0126）的珠子，则可抑制该表达。

类似地，在 HH 21 期将 U0126 包被的琼脂珠移植后 24 小时，与未经处理的对侧肢体相比，MyoD 的内源性表达减少。在肢芽中，HH 19 期时 FGF18 不能诱导 MyoD 的表达。然而，将浸有 FGF18 和视黄酸拮抗剂的琼脂珠共同移植可克服这一限制，并能检测到异位表达的 MyoD。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在三到四分钟内完成。该技术的发展使发育生物学领域的研究人员能够探索胚胎发育过程中的生长因子信号传导。在尝试该技术时，重要的是要记住不要让胚胎变干。

观看本视频后，您应该能够很好地理解如何将珠子移植到正在发育的胚胎中，以确定生长因子信号传导如何影响发育过程。