Name: 类器官的模型传染病:人类的文化与小鼠胃组织体与幽门螺杆菌的显微注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学习利用显微注射技术将幽门螺杆菌注入小鼠和人类胃类器官，建立三维感染模型。该方法使用原代非转化上皮细胞，保留组织结构，为研究传染病机制提供重要工具。

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本研究得到了欧盟玛丽·居里奖学金（EU/300686-InfO）对 S.B. 的资助，以及联合欧洲胃肠病学基金会向 H.C. 提供的研究奖。我们感谢 Harry Begthel、Jeroen Korving 和 Hubrecht 成像中心提供的技术协助，Meritxell Huch 在类器官初始培养方面的帮助，以及 Yana Zavros 对讨论的支持。

1. 胃类器官培养体系的建立
注意：本方案可用于从小鼠或人体组织中分离胃腺。建议使用约 1 cm² 的组织。人体组织可来源于胃部切除术或活检样本。
<ol>
	<li>材料准备 
	注意：所使用的基底基质为 Matrigel。始终将基底基质置于冰上。基底基质应储存于 -20 °C，并在使用前于冰上解冻。基础培养基指添加了 HEPES 的 Advanced DMEM/F12，以及适当的谷氨酰胺来源（如 Glutamax）和适当的抗生素（如 1x Primocin）。所使用的培养箱为标准细胞培养箱（37 °C，湿润环境，5% CO2）。
	<ol>
		<li>通过高压灭菌或使用 100% 异丙醇对准备用具进行灭菌：锐利镊子、剪刀、手术刀和玻璃显微镜载片。</li>
		<li>分离前一天，将 24 孔细胞培养板放入培养箱中。</li>
		<li>根据生产商的建议制备基底基质。将其分装为 1 ml 的小份，以避免反复冻融循环。</li>
		<li>制备 500 ml 螯合缓冲液并置于冰上冷却。使用无菌去离子水配制 1x 缓冲液，其中包含 5.6 mM Na2HPO4、8.0 mM KH2PO4、96.2 mM NaCl、1.6 mM KCl、43.4 mM 蔗糖、54.9 mM D-山梨醇、0.5 mM DL-二硫苏糖醇（注意：CAUTION），pH 7。若计划进行多次分离，可配制不含 DL-二硫苏糖醇的 5x 浓缩液。使用滤器对缓冲液进行无菌过滤。分离前，用无菌水将 5x 缓冲液稀释至 1x，并在分离前立即加入 DL-二硫苏糖醇。</li>
		<li>根据生产商的建议配制并稀释所有生长因子。使用小份量分装，避免冻融循环。功能性生长因子对实验结果至关重要。</li>
		<li>将基础培养基置于冰上冷却，并将离心机预冷至 4 °C。</li>
		<li>将另一份基础培养基预热至 37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腺体的分离
	<ol>
		<li>在冰上预冷的基础培养基中收集约 1 cm² 的组织。保持在冰上直至开始处理。尽管建议尽快处理组织，但必要时可将组织保存在冰上的培养基中。</li>
		<li>将组织置于 10 cm 培养皿中，并用冷的 1x 螯合缓冲液覆盖。通过轻轻前后移动进行清洗。</li>
		<li>将组织转移至干燥的 10 cm 培养皿中。在体视显微镜下，使用镊子小心去除黏液及下方的肌层。用冷的 1x 螯合缓冲液轻轻前后移动清洗组织。</li>
		<li>将 1 cm2 的组织置于新的干燥 10 cm 培养皿中。使用剪刀将其剪成 20–50 个大小约为 2–5 mm² 的小块。</li>
		<li>使用镊子将所有组织块转移至 50 ml 离心管中。</li>
		<li>取一支无菌的 10 ml 塑料移液管。用 1x 螯合缓冲液润湿移液管。在整个操作过程中持续使用同一支移液管。</li>
		<li>向 50 ml 管中加入 10 ml 冷的 1x 螯合缓冲液。剧烈上下吹打 10 次以清洗组织块。静置使组织块沉降，弃去上清液。</li>
		<li>重复清洗步骤（步骤 1.2.7），直至上清液澄清。此过程对 1 cm² 人组织大约需要 50–100 ml 的 1x 螯合缓冲液。</li>
		<li>将组织块在 20 ml 1x 螯合缓冲液（含 10 mM EDTA）中于室温孵育 10 分钟，每 2 分钟轻轻颠倒混匀一次。 
		注意：此孵育步骤的时间和温度可根据速度和/或腺体结构的完整性进行优化。可选择在滚动平台上 4 °C 孵育数小时，或在 37 °C 摇床（200 rpm）中孵育 5 分钟。小鼠胃组织的合适起始条件为 4 °C 滚动平台孵育 30 分钟；人胃组织则为室温孵育 10 分钟。</li>
		<li>使用 10 ml 移液管轻轻吹打一次。静置使组织块沉降，弃去上清液。</li>
		<li>使用移液管将组织块转移至洁净的 10 cm 培养皿中，弃去液体。</li>
		<li>将玻璃显微镜载片覆盖在组织块上方。在倒置显微镜下（10X 放大倍数）观察完整组织。</li>
		<li>对玻璃载片和培养皿施加压力。用手（戴无菌手套）握住两者，并用拇指按压玻璃片。组织边缘将变得浑浊，表明腺体已从组织中释放。</li>
		<li>在倒置显微镜下（10X 放大倍数）观察释放的腺体。</li>
		<li>将腺体和组织收集至 30 ml 冷的基础培养基中。静置使大块组织沉降。</li>
		<li>将含有腺体的上清液收集至两个 15 ml 离心管中。</li>
		<li>在 200 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。弃去上清液。沉淀物中即为分离的腺体。将其保持在冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>腺体接种
	<ol>
		<li>接种过程中，始终将基底基质保持在冰上低温状态，以确保其保持液态。</li>
		<li>替代方案 1：接种 6 个稀释梯度孔。
		<ol>
			<li>将沉淀物悬浮于 60 µl 基底基质中。</li>
			<li>在冰上准备 5 个无菌的 1.5 ml 离心管，每管含 50 µl 基底基质。将 10 µl 腺体/基底基质悬液转移至第一个 1.5 ml 管中。充分混匀后，取 10 µl 该溶液转移至下一个 1.5 ml 管。依此类推。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>替代方案 2：按计算数量接种腺体至每孔。起始条件为每孔 50 µl 基底基质中接种 100 个腺体，置于 24 孔板的一个孔中。
		<ol>
			<li>将沉淀的腺体小心悬浮于 10 ml 基础培养基中。取 50 µl 置于洁净的 10 cm 培养皿中。在倒置显微镜下（10X 放大倍数）计数腺体数量。</li>
			<li>计算溶液中腺体的浓度。将含有 400 个腺体的体积转移至新的 15 ml 管中。</li>
			<li>在 200 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将离心管保持在冰上。加入 200 µl 基底基质，小心重悬。保持在冰上。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从培养箱中取出 37 °C 预热的 24 孔板（见步骤 1.1.2）。在孔中央加入 50 µl 含腺体的基底基质液滴。液滴将形成圆顶状。</li>
		<li>小心将培养板放回细胞培养箱中。让基底基质凝固 10 分钟。</li>
		<li>配制含所有生长因子的预热培养基。
		<ol>
			<li>人腺体：在基础培养基中添加以下生长因子以培养人胃类器官：50 ng/ml EGF、10% noggin 条件培养基、10% R-spondin1 条件培养基、50% Wnt 条件培养基、200 ng/ml 成纤维细胞生长因子（FGF）10、1 nM 胃泌素、2 µM TGFbeta 抑制剂和 10 µM Rho 相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂（RHOKi）。</li>
			<li>小鼠腺体：在基础培养基中添加以下生长因子以培养小鼠胃类器官：50 ng/ml EGF、10% noggin 条件培养基、10% R-spondin1 条件培养基、50% Wnt 条件培养基、100 ng/ml FGF10、10 nM 胃泌素、0.5 mM TGFbeta 抑制剂和 10 µM RHOKi。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从培养箱中取出培养板。小心向每孔加入 500 µl 含所有生长因子的培养基（1.3.6），避免扰动基底基质。将培养板放回培养箱。</li>
		<li>每周更换培养基 3 次（每 2–3 天一次）。更换时，移除旧培养基，保留基底基质液滴完整。小心加入新鲜预热的含所有生长因子的培养基。不要添加 RHOKi。RHOKi 仅在腺体接种后或类器官传代（步骤 2）后添加。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 显微注射前胃类器官培养物的传代。
注意：每种类器官培养物都有其特定的倍增时间。小鼠肠道和胃类器官培养物通常每5-7天以1:5的比例传代一次。人肠道类器官培养物每10-12天以1:5的比例传代一次。人胃类器官培养物每14天以1:5的比例传代一次。若从单个细胞开始培养，人胃类器官可能需要20天才能正常形成。若观察到出芽样结构围绕中央腔分布，则是类器官健康生长的良好迹象。在本实验方案中，类器官在4孔板中进行显微注射传代。类器官的日常维持遵循相同的操作流程，但可使用其他类型的细胞培养板，例如标准的24孔细胞培养板。
<ol>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>高压灭菌巴斯德吸管。</li>
		<li>传代前一天，将一个4孔细胞培养板放入37 °C培养箱中。4孔板边缘较低，便于显微操作。</li>
		<li>根据生产商的建议配制基底膜基质。传代当天，将基底膜基质置于冰上解冻。</li>
		<li>根据生产商的建议配制并稀释所有生长因子。</li>
		<li>将基础培养基置于冰上冷却，并将离心机预冷至4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官培养物的传代
	<ol>
		<li>从培养箱中取出含有类器官的培养板，移除一个孔中的培养基。</li>
		<li>向孔中的基底膜基质加入1 ml冷的基础培养基。使用1 ml移液器剧烈吹打，直至基底膜基质完全破碎。将混合物转移至15 ml离心管中，置于冰上。</li>
		<li>取一根玻璃巴斯德吸管和一个火源（如本生灯）。
		<ol>
			<li>将吸管尖端置于火焰中加热，直至其开口从1.5 mm缩小至约0.5 mm（图1）。让吸管冷却至室温。</li>
			<li>用基础培养基润湿吸管。经过适当缩小的吸管吸取液体的速度应明显慢于未缩小的吸管，但仍能顺利进行移液操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用该吸管吸取类器官，并剧烈吹打10次。可通过肉眼观察类器官的破碎情况。</li>
		<li>加入9 ml冷的基础培养基，在4 °C条件下以200 × g离心5分钟。</li>
		<li>小心弃去所有上清液。将沉淀重悬于250 µl基底膜基质中，保持在冰上。</li>
		<li>取出预热至37 °C的4孔培养板，在每个孔中加入50 µl类器官/基底膜基质混合液滴。</li>
		<li>小心将培养板放回培养箱，使基底膜基质在37 °C下凝固10分钟。</li>
		<li>根据步骤1.3.6中列出的配方，配制适用于小鼠或人类类器官的适当培养基。</li>
		<li>从培养箱中取出培养板，向每个基底膜基质液滴中加入500 µl培养基覆盖。</li>
		<li>将培养板转移回培养箱。</li>
		<li>每周更换培养基3次，每2–3天一次（见步骤1.3.8）。</li>
		<li>如需冻存类器官，按照本方案中所述的传代方法（步骤2.2.1–2.2.5）对类器官进行机械性破碎。将类器官片段重悬于500 ml&#160;冻存液中，使用冻存管和冻存盒在-80 °C条件下冷冻。长期保存时，将冻存管转移至液氮中。</li>
		<li>如需复苏类器官，按照步骤1.1.2、1.1.3、1.1.5、1.1.6和1.1.7所述准备培养板、基底膜基质、生长因子、冷热培养基。将冻存管在水浴中温育解冻，解冻后立即转移至含10 ml冷基础培养基的15 ml离心管中。随后按照步骤2.2.5至2.2.12进行离心和接种。
		 
		注意：类器官的显微注射操作较为繁琐，但能够提供研究三维环境中相互作用的独特机会。</li>
		<li>若无需进行三维研究，可将类器官接种于二维培养体系。具体操作为：按照步骤2.2.1至2.2.6对类器官进行破碎处理，然后将250 µl含类器官片段的基底膜基质与2,250 µl含所有生长因子的冷培养基混合。
		<ol>
			<li>将混合液接种至24孔板中的5个孔，每孔500 µl。每周更换培养基3次，每次仅小心更换上层400 µl，以保持底部的基底膜基质不受干扰。 
			注意：类器官将贴附于培养板表面并在二维条件下扩展。电子显微镜观察显示，细胞的顶面朝向孔中的培养基（数据未显示）。</li>
			<li>感染前，更换全部培养基（包括基底膜基质），以允许细菌与细胞结合。类似方案也已用于H. pylori14的感染研究。二维细胞层可能不包含三维类器官中存在的所有细胞类型。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 类器官培养物的显微注射。
注意：本方案可用于将细菌显微注射至类器官中。建议开始注射时选用对显微注射通透性较高的类器官。例如，小鼠胃类器官可生长为体积较大的囊状类器官，易于靶向操作。
<ol>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>根据制造商的建议，使用微量移液器拉制仪将一根玻璃毛细管拉制成两根注射针。微量移液器拉制仪会在毛细管中部加热并将其拉断为两部分，从而生成两根玻璃针。建议一次性拉制多根针头，并将其保存在洁净的培养皿中备用。</li>
		<li>为允许细菌感染，至少在连续三次更换培养基（即一周）期间去除所有培养基中的抗生素，以稀释基底膜基质中的抗生素残留。若使用的细菌菌株对某种特定抗生素具有抗性，可向培养基中添加该特定抗生素，以减少污染风险。</li>
		<li>准备显微注射工作台。根据不同的生物安全等级要求，可能需要将体视显微镜置于无菌操作台内。本实验方案中，在无菌操作台内的体视显微镜下，按照生物安全二级（BSL-2）条件注射 H. pylori。</li>
		<li>按照标准操作规程培养细菌13,23。</li>
		<li>为估算感染复数（MOI），需测定以下两个参数：感染液中的细菌数量以及每个类器官中的细胞数量，具体方法如下所述。MOI 可能与实验结果相关，例如与宿主 IL-8 mRNA 的表达水平相关13。
		<ol>
			<li>为计算感染液中的细菌密度，首先根据标准操作规程24建立光密度（OD）与菌落形成单位（CFU）之间的标准曲线。在550 nm波长下，光密度值为0.1时，应约相当于107&#160;CFU/ml。</li>
			<li>为估算每个类器官中的细胞数量，先计数一个孔中类器官的数量。按照步骤2.2.1–2.2.4所述方法对类器官进行解离。在200 × g、4 °C条件下离心5分钟，加入1 ml酶解解离液并重悬。
			<ol>
				<li>在37 °C孵育5–10分钟，并反复震荡。在显微镜下（如Leica DMIL倒置显微镜，10倍放大）观察细胞是否已解离为单细胞。如有必要，可延长孵育时间。</li>
				<li>使用血细胞计数板计数每个类器官的细胞数，并计算平均值。直径约为200 µm的人胃类器官约含有4,000个细胞。注射0.2 µl浓度为1 × 109个细菌/ml的细菌溶液，可获得约MOI为50的感染条件。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官注射 
	注：进行显微注射时，玻璃针固定于持针器中，并通过显微操作仪实现三维方向的精确操控。类器官仍保留在培养孔中的基底膜基质内。由于类器官的大小和位置差异，并非所有类器官均适合注射。通常在一个孔中，可在5分钟内对约30个最大的类器官进行注射。
	<ol>
		<li>根据标准操作规程24收集细菌，并用基础培养基洗涤。</li>
		<li>根据光密度值计算每毫升细菌数量（见步骤3.1.5.1）。将细菌用基础培养基稀释至1 × 109个细菌/ml&#160;。</li>
		<li>取一根玻璃针，用镊子轻折针尖，使开口直径约为10 µm。</li>
		<li>将针插入注射持针器，并固定于显微操作仪上。</li>
		<li>用该针吸取约10 µl细菌溶液。</li>
		<li>将一个含类器官培养物的4孔板（低边缘）置于体视显微镜下。</li>
		<li>通过显微操作仪操控针头，对准单个类器官。将针头靠近类器官后，迅速将其插入类器官内部。使用显微注射仪向每个类器官注射约0.2 µl细菌溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收获类器官用于后续分析。
	<ol>
		<li>以感染后4小时为例，移除上清液，加入1 ml 2%多聚甲醛，室温孵育20分钟，或4 °C过夜。类器官可按照标准流程进行免疫组织化学处理25。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Hans Clevers 是多项类器官培养专利的发明人。除此之外，作者无其他需要披露的内容。

本方案描述了利用成体干细胞来源的不断扩增的未转化原代类器官进行感染生物学研究的方法。关键步骤包括：i）活性腺体的分离，ii）类器官的扩增，以及 iii）显微注射。以下是一些关于方案修改、问题排查和技术注意事项的建议。
与其他使用剧烈振荡或移液来释放腺体且同样有效的方法相比，本文所述技术的优势在于，可在显微镜下直接观察腺体从组织中的释放过程（步骤 1.2.14）。若腺体未被释放，可调整 EDTA 孵育条件（参见步骤 1.2.9）。如需要，也可尝试通过剧烈振荡来分离腺体，并参照小鼠肠隐窝的方法，在显微镜下检测上清液中是否存在腺体26。在洗涤步骤中，即使分离的腺体发生解体也无关紧要。类器官仍可由腺体碎片甚至单个干细胞启动形成，这一点已有研究证实13,18, 27。
当腺体已分离并接种，但类器官未按预期扩增时，应首先对Wnt和R-spondin的活性进行故障排查。这两种因子对类器官的扩增至关重要，建议通过以下方法检测这两个因子的功能活性： 体外 例如，使用荧光素酶的TOP ...

病原体的研究依赖于合适的模型系统来模拟 体内 感染。对于某些病原体，尚缺乏适当的模型系统，而一些现有模型系统也远未达到理想状态。一个例子是胃部细菌&#160;幽门螺杆菌 (H. pylori），与胃癌的发生有因果关系。然而，由于缺乏更合适的细胞培养系统，许多旨在分析癌症发生分子机制的研究仍使用代表癌症终末阶段的癌细胞系。对于此类研究而言，原代非转化细胞将是更理想的模型。但原代细胞仅能从少数供体获得，且无法长期培养。近年来，干细胞研究取得了显著进展，为感染生物学研究提供了新的原代细胞培养来源。
已使用三种干细胞来源的培养物：胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（iPSC）或成体干细胞。这些培养物已被用于模拟病毒感染（如巨细胞病毒1,2或丙型肝炎病毒3–7）、寄生虫感染（如Plasmodium falciparum8或Toxoplasma gondii9）以及细菌感染（如Bacteroides thetaiotaomicron10或Salmonella enterica11）。最近，已有若干研究报道了利用来自ESC或iPS细胞的类器官12、小鼠成体干细胞的类器官21,22或人成体干细胞的类器官13–15模拟H. pylori感染的方法。
由成体干细胞建立类器官培养体系的研究最初源于一项实验，该实验将从小鼠肠道上皮分离的单个干细胞接种至三维基质中，并置于模拟肠道干细胞微环境的培养基内，其中包含表皮生长因子（EGF）作为有丝分裂原，R-脊椎蛋白（R-spondin）以增强Wnt信号通路，以及Noggin以抑制骨形态发生蛋白（BMP）信号通路16值得注意的是，这些培养物无需与间充质细胞共培养。在此条件下，干细胞增殖并形成具有肠隐窝细胞区域和肠绒毛细胞区域的小型结构。类器官 thus 自我组织以模拟 体内 情况。如今，许多小鼠和人类组织中的成体干细胞均可被培养 体外 并自组织形成类器官，其形态类似于 体内 对应部分，例如小肠和结肠17，胃13,18肝脏19,20，胰腺21 和前列腺22.
本文提供了一种从成体干细胞培养小鼠或人类胃类器官并对其进行H. pylori显微注射的视频实验方案。该方案基于此前的报道13,18。本方法可适用于其他类器官培养体系的培养与感染，例如肠道类器官。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, 无酚</td><td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-079</td><td>储存液浓度 200 mM，终浓度 2 mM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>储存液浓度 50 倍，终浓度 1 倍</td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>储存液浓度 500 mM，终浓度 1 mM</td></tr><tr><td>小鼠重组 EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8043</td><td>储存液浓度 500 &amp;micro;g/ml，终浓度 50 ng/ml</td></tr><tr><td>人重组 FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>储存液浓度 100 &amp;micro;g/ml，终浓度 200 ng/ml</td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;i A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>储存液浓度 500 &amp;micro;M，终浓度 2 &amp;micro;M&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>储存液浓度 1 M，终浓度 10 mM&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>[Leu15]-胃泌素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td>储存液浓度 100 &amp;micro;M，终浓度 1 nM</td></tr><tr><td>RHOKi Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>储存液浓度 10 mM，终浓度 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Wnt3A 条件培养基</td><td></td><td></td><td>Clevers 实验室构建的稳定细胞系。终浓度 50%。细胞可向 Hans Clevers 获取。</td></tr><tr><td>R-spondin1 条件培养基</td><td></td><td></td><td>Kuo 实验室构建的稳定细胞系。终浓度 10%。细胞系可向 Calvin Kuo（斯坦福大学）获取。</td></tr><tr><td>Noggin 条件培养基</td><td></td><td></td><td>Clevers 实验室构建的稳定细胞系。终浓度 10%。细胞可向 Hans Clevers 获取。</td></tr><tr><td>R-spondin3</td><td>R&amp;D</td><td>3500-RS/CF</td><td>R-spondin 的替代来源。已在人肠道类器官中测试（1 &amp;micro;g/ml），但尚未在胃类器官中测试。</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10</td><td>Noggin 的替代来源。已在人肠道类器官中测试（100 ng/ml），但尚未在胃类器官中测试。</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>酶解解离溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CoolCell&amp;reg; 无酒精细胞冻存容器</td><td>biocision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>Recovery 细胞培养冻存培养基</td><td>Invitrogen</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗生素&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>一种针对细菌和真菌的抗生素混合物。在培养起始阶段使用有益。长期培养时可更换为其他抗生素或不使用。</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>储存液浓度 10,000/10,000 U/ml，终浓度 100/100 U/ml。可在长期培养中替代 Primocin 使用。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Neolabs</td><td>2-1033</td><td>尖端细小的镊子有助于从组织中去除肌层。</td></tr><tr><td>4 孔多孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td>可使用其他多孔板。此类多孔板特别适用于显微注射，因其外缘较低，便于操作器移动。</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Narishige</td><td>IM-5B</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>工作台</td><td>Clean Air</td><td></td><td>定制，适用于在 ML2 条件下放置体视显微镜</td></tr><tr><td>毛细管</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100T-10</td><td>外径 1 mm，内径 0.78 mm。</td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>Flaming Brown 微量移液器拉制仪</td><td></td></tr><tr><td>抗 Cag A 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25766</td><td></td></tr></tbody></table>

类器官作为感染性疾病的模型：人和小鼠胃类器官的培养及幽门螺杆菌的显微注射

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

近年来，感染生物学研究人员已采用干细胞来源的培养体系，以满足对新型且更优模型的需求，用于研究宿主与病原体之间的相互作用。目前使用了三种细胞来源：胚胎干细胞（ESC）、诱导性多能干细胞（iPSC）或成体干细胞。本文描述并应用了源自成体干细胞的小鼠和人类胃类器官培养方法，并用于胃部病原体Helicobacter pylori的感染实验。人类胃腺体从手术切除组织中分离，接种于基底膜基质中，并包埋在含有表皮生长因子（EGF）、R-spondin、Noggin、Wnt、成纤维细胞生长因子（FGF）10、胃泌素以及转化生长因子（TGF）β抑制剂等生长因子的培养基中。在此条件下，胃腺体可发育为包含胃部四种细胞谱系的三维类器官。这些类器官可无限扩增，并可像细胞系一样进行冻存与复苏。在感染研究中，将细菌微量注射至类器官腔内，随后对感染后的类器官进行成像处理。所述方法可推广至其他类器官系统，并可用于其他细菌、病毒或寄生虫的感染研究，从而实现对原代细胞中感染诱导变化的深入分析。

本方案可用于分离胃腺（图2）。将胃腺接种至基底膜基质中，基质在孔内形成凝固的液滴，提供富含层粘连蛋白和胶原蛋白的三维结构，支持胃腺生长为类器官（图3）。类器官通常最初表现为小囊泡，12–16天内逐渐扩展为直径50–300 µm的球形结构（图4）。部分类器官保持囊状结构，部分则会形成小的出芽结构，后者通常是培养状态良好的标志。本方案中，每孔使用24孔板的一孔，接种100个胃腺，加入50 µl基底膜基质和500 µl培养基。但该体系可根据需要进行放大或缩小。
在体视显微镜下可轻易观察到显微注射是否成功，表现为浑浊的细菌溶液充满类器官（图5）。经过适当的孵育时间后，可对类器官进行任何所需的分析方法处理。例如，可将类器官包埋于石蜡中，切片后采用标准的免疫组织化学技术进行染色。对免疫染色后的类器官进行显微观察，可证明细菌已成功注入（图6）。
<p class="jove_content" fo:keep-togeth...

由干细胞衍生的培养物在模拟感染性疾病方面具有巨大潜力。本文介绍了源自成体干细胞的小鼠和人类胃类器官的培养方法。通过显微注射将胃部病原体Helicobacter pylori注入类器官中。

近年来，感染生物学领域的研究人员已采用干细胞来源的培养体系，以满足对新型且更优模型的需求，用于研究宿主与病原体之间的相互作用。

本实验的总体目标是生成类器官，并将其用作感染生物学的三维模型。数年前，我们的实验室发现了LDR5可作为小鼠多种不同成年器官中干细胞的标志物。此后，我们学会了从这些器官中分离单个干细胞，并将其培养成类器官——即这些器官的微型版本。借助类器官技术，我们现已证明，可以深入研究癌症，同时也可研究传染病相关问题。与使用癌细胞系模拟感染生物学相比，该技术的主要优势在于所使用的细胞是原代非转化的上皮细胞，并且保留了三维结构。起始材料约为一平方厘米的新鲜胃组织。在干燥的10厘米培养皿中，使用镊子小心去除黏液和肌肉层。用冷螯合缓冲液以轻柔的来回动作清洗组织。将洗涤后的组织转移至一个新的干燥的10厘米培养皿中。将组织切成25到50个小块，每块大小约为2至5平方毫米，并使用镊子将其转移至一个50毫升离心管中。用螯合缓冲液润湿一支10毫升移液管后，向50毫升离心管中加入10毫升该缓冲液，并通过剧烈吹打10次来清洗组织块。让组织碎片沉降，移除上清液。重复洗涤，直至上清液澄清。随后，用移液器加入20毫升1×螯合缓冲液。在组织块中加入 10 毫摩尔 EDTA，孵育 10 分钟。室温下，此后每 2 分钟轻柔颠倒离心管一次，并轻轻吹打。使用 10 毫升移液器吹打一次后，静置使组织块沉降，然后弃去上清液。然后将组织块转移至洁净的10厘米培养皿中，并去除所有液体。将一块盖玻片置于组织块上方，在倒置显微镜下以10倍放大倍数观察组织。拿起培养皿，对盖玻片施加轻柔压力。滑动组织边缘时会出现浑浊现象，表明腺体已释放。将释放出的腺体和组织碎片收集到30毫升冷的基础培养基中。静置使组织碎片沉降，然后收集上清液，其中含有腺体，分装至两个15毫升离心管中。在4°C条件下，以200 × g离心5分钟。弃去上清液，将所得沉淀物置于冰上保存，以观察腺体。将沉淀物悬浮于60 µL冰上的基底膜基质中。分别准备五个无菌的1.5毫升离心管，每管含有50微升基底膜基质。将10微升悬浮的腺体转移至其中一个含有50微升基底膜基质的离心管中。通过将10微升从第一个稀释液转移至下一个1.5毫升离心管，并对剩余各管重复此操作，进行系列稀释。然后从每个1.5毫升离心管中吸取50微升悬浮腺体稀释液，分别加入预热的24孔板的各个孔中。液滴应小心形成圆顶状。将培养板放入细胞培养箱中，使基底膜基质凝固10分钟。准备好适当的培养基后，小心取出含有已凝固基底膜基质的培养板，向每孔中加入500 µL培养基，然后将培养板放回细胞培养箱中。每两到三天更换一次培养基，以准备传代类器官培养物。将移液管的尖端置于火焰上灼烧灭菌，然后放置冷却。尖端应从1.5毫米缩小至约0.5毫米。孵育后，从细胞培养孵箱中取出含有类器官的培养板。吸出其中一个的培养基。向孔中加入1毫升冷的基础培养基，用力上下吹打以打碎基底膜基质。将孔中的内容物转移至15毫升离心管中，并置于冰上。用基

organoids-as-model-for-infectious-diseases-culture-human-murine

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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