通过流式细胞术测定甲型流感病毒在A549细胞中的吸附与内化

本实验的总体目标是测量流感病毒颗粒在 A549 肺上皮细胞中的吸附与内化。该过程首先通过低温结合使流感病毒 A 与 A549 细胞结合，此条件允许病毒颗粒吸附于细胞表面，但阻止其被细胞摄取。

接下来，将温度转移至37摄氏度，使病毒进入细胞内化阶段。随后进行封闭步骤，将未标记的strp Aden结合至细胞表面，以区分附着于细胞表面的病毒与已内化的病毒颗粒。

最后，将与细胞结合的生物素标记病毒与CY3标记的链霉亲和素孵育，并通过流式细胞术检测染色后的病毒。最终计算结合与内化病毒的相对量。尽管该方法可提供关于流感病毒（一种可结合并内化进入5 0 9细胞的病毒）相对量的信息。

该方法也可应用于使用不同细胞系或其他病毒的其他系统。在制备生物素标记的病毒并根据文本方案确定所需量的标记病毒、链霉亲和素（strep din）以及SI三标记的链霉亲和素（strep din）后，准备四个深孔管，每管含有200,000个A549细胞，并将各管标记为“0分钟”、“0分钟加STV”、“30分钟”和“30分钟加STV”。接下来，离心各管。

移去上清液，加入200微升PBS重悬沉淀。再次离心后，加入200微升5 49标准生长培养基重悬细胞，在37摄氏度孵育30分钟。孵育结束后，离心样品，并用200微升PBS重悬沉淀。再重复洗涤一次后，将离心管置于冰上冷却10分钟。待离心管冷却后，再次离心，并加入100微升用感染用PBS稀释的生物素化病毒重悬沉淀。冰上孵育1小时后，重复离心并用PBS洗涤两次，尽可能平行处理后续样品，以获得零分钟时间点的样品。

离心后，用100微升3.7%多聚甲醛（PFA）重悬细胞沉淀。室温孵育10分钟后，再次离心，并用PBS洗涤细胞两次。固定完成后，将样品置于4摄氏度保存，直至所有样本处理完毕。

对于零分钟加STV样本的处理，离心收集细胞，弃上清，加入15 µL含2% BSA和0.1%叠氮化钠的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，冰上孵育30分钟。随后离心，用PBS洗涤细胞两次，固定后如前所述将样本置于4°C保存，用于30分钟时间点的检测。离心并去除上清后，用含2% BSA的PBS缓冲液重悬样本。

在37°C下孵育30分钟，随后用PBS洗涤并用PFA固定。然后将样品在4°C下储存30分钟，另加STV样品。离心沉淀后，将样品重悬于200 µL含2% BSA的PBS中，随后在37°C下孵育30分钟。

将细胞在 50 µL 含 2% BSA 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS-STV 中离心并重悬，冰上孵育 30 分钟，然后洗涤并固定。接着对所有样品进行透化处理，并按照文本方案中的详细步骤使用 STV SI 三进行染色，将样品置于 4°C 保存。最后通过流式细胞术分析样品。

确定每个样本中CY三阳性细胞的百分比。计算附着病毒的百分比及内化病毒的相对含量。根据文中所示的零分钟样本实验方案，在低温条件下，病毒结合至靶细胞，通过St.V.SI三染色法可观察到该过程。

当使用STV作为封闭步骤时，细胞表面的病毒无法再被S St.V.SI染色检测到，信号显著降低。当温度升高至37摄氏度时，附着的病毒被细胞摄取。内化的病毒对未标记STV的封闭不敏感，因此在加入STV后30分钟的样品中，信号强度下降程度较轻微。

以下是本视频中所述所有实验条件下SI三个阳性细胞的百分比。模拟感染的细胞为实验提供了背景信号强度，并作为病毒吸附的阴性对照。另一种对照——神经氨酸酶处理——与未处理细胞相比，可使IAV吸附显著降低90%。

叠氮化钠可耗尽ATP，从而抑制内吞作用，在感染期间和感染后均抑制病毒颗粒的内化。如图所示，经叠氮化钠处理的细胞在37摄氏度下孵育30分钟后，病毒内化水平相较于在相同条件下孵育的未处理细胞显著下降。观看本视频后，您应能够充分理解如何在5 0 9细胞中检测流感病毒的吸附与内化。该实验方案可通过流式细胞术便捷地进行检测，并可轻松适用于其他实验条件。