膜运输过程由单一的蛋白质解析一个高度并行的纳米孔芯片分析系统
2016年8月16日
所提出的方案描述了使用跨孔无溶剂脂质双层在单个转运蛋白水平上分析膜蛋白介导的转运。这是通过创建批量生产的纳米孔阵列芯片，结合高度并行的数据采集和分析来实现的，从而能够在未来建立膜蛋白效应子筛选。
这个基于纳米结构芯片的平台的总体目标是以高度平行的方式在单个分子水平上分析膜蛋白功能。通过其解析单个蛋白质的能力，获得了对膜转运和通量的新见解。这种方法可以帮助回答膜蛋白领域的关键问题，例如单个通道或转运蛋白的电导率或运输行为，特别是非电介质
。该技术的主要优点是其源自纳米结构芯片设计的高平行度，具有数十万个纳米孔和传输事件的荧光读数。这项技术的影响延伸到创建膜蛋白有效文库的最佳检测方法。因为基于芯片的平台可实现高度并行和自动的传输记录。
通常，刚接触这种方法的人会很快学会如何使用所介绍的技术。重点始终是创建一种用户友好的检测方法，以便每个感兴趣的人都可以采用它。该膜传输分析利用绝缘晶片上的硅，使用反应离子蚀刻设计。
每个晶圆制造了大约 1， 000 个检测芯片。每个芯片包含 250， 000 个微腔。这些空腔被含有目标转运蛋白的脂质双层密封。
膜构成传感器接口。最初，荧光材料包含在脂质双层的一侧，对应于组成它们的脂质体的内部。每个腔体都可以通过多光谱荧光读数进行寻址。
不透明的顶层阻挡了来自缓冲液储液槽的荧光信号，使生物芯片与倒置荧光显微镜兼容。使用原子力显微镜，在 3.6 纳米处测量了均匀排列的孔隙开口和二氧化硅层的表面粗糙度，这是囊泡融合的最佳选择。扫描电子显微镜显示了通过纳米孔的横截面，该纳米孔进入硅芯片内部的飞升腔。
该视频展示了蛋白脂质体的制备、用于检测的芯片的制备以及基本检测执行。将乙醇洗涤的圆底烧瓶连接到旋转蒸发器。在 300 毫巴、30 摄氏度水浴温度和最大转速下干燥脂质膜 40 分钟，以在培养瓶的玻璃壁上形成均匀的脂质膜。
然后，使用高真空泵，在室温下再干燥脂质膜 30 分钟。接下来，向烧瓶中加入 5 毫升缓冲液和 8 个乙醇洗涤的玻璃珠，以制备多层囊泡。将烧瓶连接到旋转蒸发仪，并在 50 摄氏度下以最大速度无真空旋转。
45 分钟后，溶液呈乳白色，壁上没有残留脂质膜。将烧瓶置于惰性气体下移入超声浴中，并在室温下超声处理 4 分钟。超声处理会破坏脂质体，使它们成为单层。
现在，将 LUV 溶液分成 1 毫升等分试样，并使用液氮和 40 摄氏度水浴进行五次冻融循环。这导致脂质体的破裂、重排和生长。在最后的冷冻步骤中，将所有样品储存在零下 80 摄氏度。
在重构 LUV 等分试样之前，使用微型挤出机将等分试样穿过 400 纳米聚碳酸酯滤膜 17 次，挤出脂质体。然后，通过在 0.25% 溶液中加入 4% Triton X-100 来破坏 LUV 的稳定性。将混合物在 50 摄氏度下孵育 5 分钟。
现在，将一份纯化的修饰 MscL 混合到 20 份去污剂饱和脂质体中，并继续孵育 30 分钟。孵育后，取 100 微升等分试样，加入一体积的 30 毫摩尔钙。将此混合物在 50 摄氏度下孵育 5 分钟。
现在，从经过煅烧处理和未处理的样品中取出去污剂。向每个微珠中加入 Tris 缓冲液中的湿生物微珠，并在 4 摄氏度下在旋转板上孵育过夜。在实验之前，使用活性测定法测试制剂。
首先，将弹性体基混合到固化剂中，并将混合物完全干燥，使其变质。胶粘剂必须在准备好后 30 分钟内使用。同时，采取预防措施，使用玻璃注射器中涂抹的 5 毫升氯仿清洁盖玻片，然后让玻片干燥。
现在，使用 10 μL 移液器将准备好的粘合剂沉积在盖玻片上。然后，使用细镊子小心地从晶圆板上去除芯片。将芯片的涂层面朝上，将其沉积在粘合剂上，然后轻轻地将其揉搓到载玻片上，使粘合剂均匀分布。
不要让气泡滞留在下面，也不要让任何粘合剂进入芯片上。此外，制作组件，使其适合 8 腔载玻片架。现在在 65 摄氏度的橱柜式干燥机中将组件干燥两个小时。
稍后，在 54 摄氏度下用几次溶剂清洗去除芯片上的保护层。首先将已安装的切屑放入载玻片架中。然后，将它们在三个溶剂浴中孵育，每个溶剂浴 10 分钟。
异丙醇、丙酮和异丙醇。接下来，用超纯水仔细彻底地清洗薯片。通过在温和的氮气流中干燥木片来完成该过程。
现在，准备一个 8 孔粘性载玻片并将其向后放在工作台上。然后，小心地提起并压在粘性载玻片上，使芯片面向孔。在继续之前，让组件休息几分钟。
在进行易位测定之前，如文本方案中所述，彻底清洗芯片组件，最后用 Tris 缓冲浴完成。接下来，将浴液与含有 5 毫摩尔氯化钙和 1 微摩尔 Oy647 染料的 DOPEd Tris 缓冲液交换。接下来，将蛋白脂质体添加到芯片室中，使终浓度为 1 毫克/毫升，然后等待 1 小时。
一小时后，用 400 微升无钙 Tris 缓冲液冲洗芯片四次。现在，将受控染料添加到每个孔中至 5 微摩尔，然后继续进行测定。接下来，将芯片支架安装到落射荧光显微镜上，并聚焦在纳米孔芯片的边缘以找到微腔。
聚焦微腔后，扫描纳米孔阵列以查找显示最高天花板比率的区域。文本协议中提供了详细信息。制备脂质体并检查其大小分布和分散性。
制备的脂质体大于用于测定的孔径，这是必不可少的。单分散脂质体也是可取的。实验前，使用荧光去淬灭测定法检查脂质体制剂中修饰的 MscL 蛋白。
含有活性修饰 MscL 的脂质体的比例足以进行易位实验。在生物芯片上，观察到荧光靶标通过修饰的 MscL 通道的溶质易位。化学调制剂 MTSET 用于通过静电排斥打开工程化的 MscL 通道。
监测腔腔内荧光的后续减少。这个过程被证明是高度可重复的，具有非常一致的外排事件。所得的外排曲线聚集在两个不同的群体中，对应于单通道或多通道易位事件。
该系统能够通过实时分析跟踪多达三种独特的荧光染料。这有助于精确区分阳性结果、单指数外排事件、复杂动力学、脂质侵入和膜破裂。一旦掌握，该技术就可以连续执行，即芯片制备、样品制备、成像和分析，使整个方案模块化。
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概述
本协议详述了一个基于纳米结构芯片的平台，旨在单分子水平分析膜蛋白功能。通过利用纳米孔阵列芯片，该方法允许数据获取的高度并行性，提供了对膜运输动力学的洞察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 膜生物学
背景
- 膜蛋白在细胞运输中扮演着关键角色。
- 理解单一运输体的行为可以揭示膜动力学的洞见。
- 现有方法通常缺乏分析个体蛋白的分辨率。
- 本研究引入了一种使用纳米孔技术的新方法。
研究目的
- 分析单分子水平上的膜蛋白功能。
- 研究单个通道的导电性和运输行为。
- 开发有效的膜蛋白筛选方法。
使用的方法
- 大规模生产纳米孔阵列芯片。
- 高并行数据获取技术。
- 运输事件的荧光读出。
- 分析带非电生性货物的蛋白质的运输行为。
主要结果
- 成功分辨单蛋白运输事件。
- 获得了对膜蛋白运输动力学的洞见。
- 在数据收集中展示了高并行性。
- 在开发有效的膜蛋白库方面的潜在应用。
结论
- 纳米孔芯片平台是膜蛋白分析的强大工具。
- 它能够在膜运输机制方面做出新的发现。
- 这种方法可以显著推进膜蛋白研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput, single-protein resolution analysis of membrane transporters addresses a critical bottleneck in early drug discovery, especially for non-electrogenic substrates. This nanopore chip platform enables robust, quantitative interrogation of transporter function, supporting predictive confidence and mechanistic de-risking at the target validation stage. Its scalability and automation-ready design position it as a strategic asset for portfolio triage and lead prioritization in membrane protein drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of single transporter activity, clarifying mechanistic hypotheses for membrane protein targets.
- Supports functional validation of transporters implicated in disease-relevant pathways.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing between single- and multi-channel events.
- Provides quantitative data to inform predictive confidence and target selection decisions.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible assay conditions using SOP-driven chip preparation and readout.
- Enables high-content screening with automated, parallelized data acquisition across multiple chips.
- Supports multiplexed, multi-spectral fluorescent readouts for unbiased event classification and reduced false positives.
- Prepares validated biological systems for downstream compound screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transporter function assays with disease-relevant systems by enabling functional reconstitution of diverse membrane proteins.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation by supporting scalable, quantitative transport measurements.
- Reduces translational risk by enabling mechanistic insights into transporter-mediated substrate flux.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore chip system integrates at the interface of target validation, assay development, and early screening, bridging discovery biology with translational research for membrane transporter targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking by resolving single-protein transport events.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility through automated, parallelized workflows and quantitative outputs.
- Analytics: Enables real-time, multi-spectral fluorescence measurements for robust event discrimination and data quality.
- Translational Research: Facilitates continuity by accommodating functionally reconstituted transporters relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable platform adaptable to a wide range of membrane protein targets and substrates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in transporter target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible workflows for high-throughput membrane protein analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of transporter-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein reconstitution and fluorescence-based assay design.
- Needs access to automated inverted fluorescence microscopy and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of SOPs for chip preparation and data analysis.
- Adaptable to a broad range of membrane proteins, provided a suitable fluorescent readout is established.
- Practical limitations include the need for non-electrogenic substrate detection via fluorescence.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Bio-chip Overview
2:53
Preparation of Large Unilamellar Vesicles (LUVs)
4:45
Protein Reconstitution
6:14
Bio-chip Holder Preparation for the Translocation Assay
8:29
The Translocation Assay
9:47
Results: Quality Control Tests and Experimental Manipulations
11:28
Conclusion
