Name: 膜运输过程由单一的蛋白质解析一个高度并行的纳米孔芯片分析系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 了解纳米孔芯片技术如何以高度并行方式在单分子水平分析膜蛋白功能。该方法利用荧光读数解析单个转运蛋白的运输动态，为膜蛋白筛选提供高通量检测平台。

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我们感谢 Barbara Windschiegl 在制定标准操作程序方面的帮助；感谢 Dennis Remme 对 NanoCalcFX 软件的开发工作；感谢 Alina Kollmannsperger、Markus Braner 和 Milan Gerovac 对稿件提出的有益建议。德国研究基金会（DFG）和德国联邦教育与研究部向 R.T. 提供的德国-以色列项目合作（DIP）资助，以及德国联邦经济与技术部（ZIM R&amp;D 项目）资助了 R.T.，Nanospot GmbH 支持了本工作。

1. 大型单层囊泡（LUVs）的制备
<ol>
	<li>用氮气清洗一个圆底烧瓶（10 ml 体积），以去除任何灰尘颗粒。再用乙醇冲洗该圆底烧瓶。 
	注意：残留的乙醇可以耐受，不会干扰后续步骤。</li>
	<li>用氯仿清洗一支 1 ml 玻璃注射器 4 次，以去除任何污染物。向圆底烧瓶中加入 4 ml SoyPC20（溶于氯仿，浓度为 25 mg/ml），并向脂质溶液中掺入额外的 DOPEATTO390，使其最终浓度为 0.1 mol%。 
	注意：可根据可用的激发光源，选用其他荧光标记脂质或亲脂性染料替代 DOPEATTO390。</li>
	<li>将圆底烧瓶连接至旋转蒸发仪。在 300 mbar、30 °C 水浴温度及最大转速条件下干燥 40 分钟，使脂质在烧瓶玻璃壁上形成均匀的脂膜。</li>
	<li>将烧瓶转移至高真空泵中，在室温下继续干燥脂膜 30 分钟。</li>
	<li>向烧瓶中加入 5 ml 缓冲液（20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 8.0；经无菌过滤）和 8 颗玻璃珠（直径 2.7 mm，经乙醇清洗并干燥）。将烧瓶连接至旋转蒸发仪，在 50 °C 下以最大转速无真空旋转。 
	注意：玻璃珠通过机械作用将脂膜从玻璃壁上剥离，从而形成（多层）囊泡。旋转 45 分钟后，溶液呈乳白色，烧瓶壁上应无可见的残留脂膜。除玻璃珠外，也可采用其他方法，如将烧瓶置于水浴超声仪中进行超声处理、涡旋混合烧瓶或温和再水化法。</li>
	<li>在惰性气体（氩气）保护下将烧瓶转移至超声水浴中，在室温下超声处理 4 分钟。 
	注意：超声冲击波可破坏脂质体，使其变为单层结构。</li>
	<li>将大单室脂质体（LUV）溶液分装为每份 1 ml 的等分试样。</li>
	<li>通过将 LUV 溶液在液氮中冷冻，随后在 40 °C 水浴中解冻，进行 5 次冻融循环。 
	注意：此过程会导致单个脂质体反复破裂并自发相互重组，从而引起粒径增大。</li>
	<li>在最后一次冷冻步骤中，将所有样品储存于 -80 °C。 
	注意：制备的 LUV 至少可稳定保存 6 个月。</li>
</ol>
2. 蛋白质重组
<ol>
	<li>将1 ml LUV等分试样置于冰上解冻。在重组前立即使用微型挤出器将脂质体通过400 nm聚碳酸酯滤膜挤出17次。 
	注意：脂质聚集体将被去除，最终获得均一的粒径分布。</li>
	<li>通过加入4% Triton X-100（v/v）使LUV失稳，终浓度为0.25%（v/v），在50 °C孵育5分钟。 
	注意：此步骤中使用的脂质体用量取决于所用纯化MscLG22C的质量（见步骤2.3）。纯化来源于E. coli的MscLG22C，具体方法详见文献28。</li>
	<li>将纯化的MscLG22C与去污剂饱和的脂质体按1:20（w/w）比例混合，并在50 °C继续孵育30分钟。</li>
	<li>为去除去污剂，向蛋白/脂质体溶液中加入含Tris缓冲液（20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 8.0；经无菌过滤）的Bio-Beads，每在步骤2.2中用于脂质体失稳的1 µl去污剂对应加入16 mg（湿重）Bio-Beads。</li>
	<li>在4 °C旋转平台上过夜（16小时）进行去污剂去除。 
	注意：溶液持续混合可确保去污剂被充分去除。</li>
	<li>去污剂去除后，将蛋白脂质体在4 °C保存，并于当天用于实验。</li>
</ol>
3. 活性测定
<ol>
	<li>在蛋白复性过程中，完成步骤 2.3 后取 100 µl 去垢剂去稳定化的蛋白脂质体溶液作为等分试样。</li>
	<li>向蛋白-脂质体溶液中加入 1 体积的钙黄绿素（30 mM），在 50 °C 下额外孵育 5 分钟。</li>
	<li>按照步骤 2.4 至 2.6 所述方法从溶液中去除去垢剂。</li>
	<li>去垢剂去除后，用 Tris 缓冲液平衡尺寸排阻柱（柱床体积为 20 ml 或更大），缓冲液体积为柱床体积的 3 倍。 
	注意：蛋白脂质体分离可在室温下进行，但建议将样品持续保持在 4 °C，以确保分级分离后蛋白活性最佳。</li>
	<li>将全部等分试样（200 µl）上样至尺寸排阻柱，以分离蛋白脂质体与游离钙黄绿素。让混合物渗入柱中，随后通过重力流在柱顶持续加入缓冲液洗脱蛋白脂质体。观察含有钙黄绿素的蛋白脂质体在洗脱前沿形成一条清晰的橙色条带。分别收集每份 500 µl 的洗脱组分。 
	注意：游离的钙黄绿素染料将在蛋白脂质体组分之后洗脱，实现完全分离。</li>
	<li>将每份洗脱组分各 80 µl 移入微孔板中，进行荧光检测，并通过荧光发射确定含有最多钙黄绿素蛋白脂质体的组分。激发波长为 490 nm，检测发射波长为 520 nm。选择荧光信号最强的蛋白脂质体组分用于后续活性测定。</li>
	<li>在 1 ml 荧光比色皿中，将 20 µl 含蛋白脂质体的组分与 980 µl Tris 缓冲液混合。</li>
	<li>使用荧光分光光度计在 520 nm 处检测荧光发射（激发波长 490 nm）。记录 1 分钟后，加入 25 µl MTSET（[2-(三甲基铵)乙基]甲烷硫代磺酸盐）储备液（160 mM），充分混匀。混匀过程中持续记录荧光信号。MTSET 储备液需在使用前新鲜配制。 
	注意：MTSET 在缓冲液中溶解后 30 分钟内会发生水解而失去反应活性。MTSET 可预先称量并以干燥粉末形式分装保存于 -20 °C，直至使用。 
	注意：MscLG22C 通道一旦被激活即会打开，释放被包封的钙黄绿素，导致钙黄绿素从蛋白脂质体中流出，局部浓度降低，从而引起染料去猝灭，表现为荧光发射信号增强。</li>
	<li>当荧光发射再次达到稳定平台期后，加入 50 µl Triton X-100（4% v/v）以溶解脂质体。 
	注意：理想情况下不应再观察到荧光信号进一步增加，表明每个脂质体中的蛋白均具有活性。</li>
</ol>
4. 使用纳米颗粒追踪法测量大单层囊泡的粒径分布
<ol>
	<li>请注意，使用纳米颗粒追踪仪进行粒径分布分析时，仅需少量脂质体或蛋白脂质体溶液即可。将脂质浓度为 5 mg/ml 的脂质体溶液用缓冲液（20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 8.0；经无菌过滤）按体积比 1:5,000 稀释，最终体积为 1 ml，用于分析。所有用于稀释以及大单层脂质体（LUV）制备和重组的缓冲液均需使用 0.2 µm 滤膜过滤，以去除灰尘等悬浮颗粒，避免干扰粒径分布测量。</li>
	<li>用超纯水清洗流动池。</li>
	<li>利用表面标记物对光束进行聚焦。注入约 300 µl 稀释后的脂质体样品，并立即关闭出口阀，以停止流动池内的流动，过程中不得引入气泡。</li>
	<li>调节焦距以及相机快门/增益设置，确保样品的散射信号足够强，便于检测。 
	注意：视野中应清晰可见 20–80 个信号。避免信号过于密集（&#62; 80 个信号），否则软件将无法在信号重叠时追踪单个颗粒。</li>
	<li>进入 &#34;采集&#34; 界面。通过软件控制将温度调节至 25 °C，采集时长设为 90 秒。点击 &#34;记录&#34; 开始采集时间序列。 
	注意：时间序列采集完成后，将弹出新窗口。</li>
	<li>将时间序列以指定格式（*.avi）保存。为便于批量分析，建议将所有文件保存在同一文件夹中。</li>
	<li>打开出口阀，再向流动池中注入 300 µl 样品。关闭阀门，并重复步骤 4.3–4.6 两次。</li>
	<li>完成所有样品检测后，用 5 ml 超纯水清洗流动池。进入 &#34;预处理&#34; 界面。设置校准参数：温度 = 25 °C，黏度 = 0.91（适用于本实验所用 Tris 缓冲液）。</li>
	<li>打开批量处理窗口，加载已记录的时间序列文件（Advanced/Batch Process/Set File 1–3）。点击 &#34;GO&#34; 开始粒径分布分析。 
	注意：分析软件将根据步骤 4.8 中设定的参数，自动追踪单个颗粒并基于其运动行为计算粒径。 
	注意：粒径分布分析结果将自动保存至与时间序列文件相同的文件夹中。</li>
	<li>此外，生成一份报告文件以汇总结果（Export/Create Report PDF）。</li>
</ol>
5. 芯片支架的制备
<ol>
	<li>称取1.0 g MDX4医用级弹性体基质和0.1 g MDX4固化剂，加入50 ml反应管中。用玻璃棒充分混合均匀。</li>
	<li>将反应管放入干燥器中脱气1小时。之后需在30分钟内使用该粘合剂进行芯片粘接，因为粘合剂会逐渐硬化，变得难以操作。</li>
	<li>在弹性体脱气过程中（步骤5.1），使用氯仿彻底清洗一块物镜玻片，以去除芯片键合前的任何污染物。用玻璃注射器向玻片上冲洗5 ml氯仿，并用下方放置的烧杯收集废液。清洗后让玻片自然晾干。 
	注意：此步骤应在通风橱中进行。除氯仿外，也可使用丙酮等其他有机溶剂替代。</li>
	<li>使用移液器吸头（适用于10 µl移液器的晶体吸头）吸取少量粘合材料，滴加到盖玻片表面。请注意，后续芯片需适配8孔玻片架，因此应合理放置芯片位置。</li>
	<li>使用尖头镊子小心地逐个从晶圆板上取下芯片，并将其放置于盖玻片上的粘合剂液滴处。确保芯片的涂层面向上。</li>
	<li>用钝头聚乙烯（PE）镊子的背面轻轻将芯片压向盖玻片。为确保粘合剂在芯片下方均匀分布，可小心地前后滑动芯片。关键步骤：必须确保芯片下方无气泡残留，否则将影响后续对芯片微腔的光学成像。同时应避免粘合剂污染芯片表面。</li>
	<li>将完成粘接的盖玻片置于烘箱中，在65 °C下干燥2小时。 
	注意：芯片表面仍保留有一层来自制造过程的保护层，需进一步去除。</li>
	<li>为去除保护层，需进行连续溶剂清洗步骤。在芯片固化过程中，预先将水浴加热至54 °C。</li>
	<li>将三个玻璃烧杯放入水浴中，其中两个装入异丙醇，另一个装入丙酮。</li>
	<li>将芯片盖玻片装入玻片架，先浸入第一个盛有异丙醇的容器中，孵育10分钟；随后转移至丙酮容器中，再次孵育10分钟；最后转入第二个异丙醇容器中，继续孵育10分钟，完成最终清洗步骤。</li>
	<li>将玻片架从容器中取出，用超纯水充分冲洗，随后用温和的氮气气流吹干芯片。</li>
	<li>从8孔粘性玻片上揭下覆膜层，并将其反向放置于实验台上。小心拿起盖玻片，使芯片面向下，轻轻按压至粘性玻片的孔位上。组装完成的芯片架需静置数分钟后再使用。</li>
</ol>
6. 检测准备
注意：通过8孔粘性载玻片将纳米孔芯片粘附在盖玻片上，具有可在单次实验中同时处理多个芯片的优势，且各芯片之间完全相互隔离。
<ol>
	<li>芯片支架制备完成后，用纯乙醇冲洗每片芯片，并用氮气吹干，以去除灰尘等任何污染物。</li>
	<li>使用空气、氧气或氮气等离子体清洁芯片表面。根据等离子体类型，处理时间有所不同：氧气等离子体处理1分钟，空气和氮气等离子体处理5分钟，压力为0.3 mbar，功率设置为80%（射频功率中或高）。</li>
	<li>等离子体清洁后，将芯片在纯乙醇中孵育10–15分钟，以确保微腔充分润湿。</li>
	<li>通过逐步置换法将乙醇替换为缓冲液：加入400 µl Tris缓冲液（20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 8.0；经无菌过滤），随后混合溶液但避免引入气泡，然后移除400 µl液体。重复此步骤12次，以确保完全去除乙醇。 
	注意：乙醇对脂质体及悬浮脂双层具有破坏作用。</li>
	<li>将Tris缓冲液（20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 8.0；经无菌过滤）中加入5 mM CaCl2和1 µM Oy647染料。彻底移除洗涤缓冲液后，立即向芯片中加入该掺杂缓冲液。注意：洗涤缓冲液移除后，芯片表面会覆盖一层薄薄的缓冲液膜，因此芯片不会直接接触空气，从而确保微腔和芯片表面持续润湿。</li>
	<li>向每个孔中加入1 mg/ml的LUVs或蛋白修饰LUVs（溶于Tris缓冲液中，20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 8.0；经无菌过滤）。 
	注意：每个孔的最终体积为300 µl。在加入掺杂Tris缓冲液时，需考虑后续控制染料和化学修饰剂MTSET的添加。</li>
	<li>为在芯片表面形成跨孔脂双层，将芯片与脂质体溶液在室温下孵育1小时。随后用4 × 400 µl无Ca2+的Tris缓冲液洗涤每片芯片。</li>
	<li>向每个孔中加入控制染料，终浓度为5 µM。此时芯片已准备好进行跨膜转运实验。</li>
</ol>
7. 检测设置
<ol>
	<li>将芯片架安装到落射荧光显微镜上（20倍空气物镜，长工作距离）。聚焦于纳米孔芯片的边缘，以更易于找到微腔的焦平面。一旦微腔清晰成像，即扫描纳米孔阵列，寻找密封率最高的区域。 
	注意：任何倒置落射荧光显微镜均可用于芯片检测。根据物镜放大倍数（20X - 60X），检测的微腔数量会有所不同，使用20倍物镜时单个视野最多可观察到9,000个微腔。优先选用长工作距离的空气物镜。也可使用倒置共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），但由于其焦深有限，图像采集可能成为限制因素。</li>
	<li>优化芯片照明条件。 
	注意：确保两个染料通道的信号均不超过最大灰度值，否则无法观察到信号变化。在输出实验中，应将穿膜染料的照明强度调节至最大信号容量的90%。将开放微腔中对照染料的照明强度调节至最大信号容量的80-90%，以便清晰检测任何膜密封不严的情况。</li>
	<li>所有通道调节完成后，开始时间序列成像。每10-20秒采集一次图像，持续90分钟。 
	注意：该时间分辨率足以同时追踪特异性和非特异性的外排事件。</li>
	<li>通过加入特异性针对半胱氨酸的带正电化合物MTSET，启动荧光底物的外排，使其终浓度达到3 mM。在加入MTSET前，应至少保留5分钟的实验运行时间，以便在通道开启前建立稳定的荧光信号基线。MTSET溶液务必在使用前新鲜配制。</li>
</ol>
8. 数据分析
<ol>
	<li>使用 ImageJ 的标准版本打开时间序列图像堆栈（文件/导入/图像序列）。</li>
	<li>如果荧光通道被叠加，请将各通道拆分为独立的图像栈（图像/栈/栈转图像）。</li>
	<li>复制易位底物通道的第一幅图像以进行感兴趣区域（ROI）识别（图像/复制）。</li>
	<li>将图像转换为二值图像（Image/Adjust/Threshold）。确保所使用的算法能够显示所有封闭腔隙的信号，且不出现像素重叠。</li>
	<li>使用粒子分析工具（Analyze/Analyze Particle）自动定义感兴趣区域。设定最小粒子大小阈值，以避免颗粒噪声。勾选相关选项 &#34;排除边缘区域&#34; 和 &#34;包含孔洞&#34;确保生成的感兴趣区域（ROI）反映微腔阵列的图案。相邻的ROI为伪影，需将其删除。保存ROI列表。 
	注意：必须将测量参数设置为 &#34;面积&#34; 在进行颗粒分析之前（Analyze/Set Measurements/Area）</li>
	<li>打开时间序列分析插件（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/time-series.html），该插件可自动将所有感兴趣区域（ROI）调整为相同大小。将所有现有 ROI 调整为 6×6 像素的宽度/高度，并设置为椭圆形（Time Series Analyzer/AutoROIProperties）。勾选该选项 &#34;调整现有感兴趣区域的大小&#34;保存调整大小后的 ROI 列表。</li>
	<li>打开 ROI 管理器（Analyze/Tools/ROI Manager），加载时间序列中每个通道的调整大小后的 ROI 列表（ROI Manager/More/Open）。ROI 将会叠加。要分析每个 ROI 的信号变化，请启动多重复测量工具（ROI Manager/More/Multi Measure），并选择 &#34;测量所有切片&#34; 和 &#34;每切片一行&#34; 并启动多参数测量。 
	注意：必须将测量参数设置为 &#34;平均灰度值&#34; 此步骤（分析/设置测量/平均灰度值）</li>
	<li>保存结果表格，以 *.txt 或 *.xls 格式输出每个 ROI 的平均灰度值。</li>
	<li>通过将每个成像通道的 ROI 分析导入 NanoCalcFX &#34;导入文件&#34; 选项。设置 &#34;使用第一行命名系列&#34;根据时间序列图像采集的时间间隔设置图像间的步长，并选择相应的列分隔符和小数点分隔符。</li>
	<li>使用 &#34;多层片材&#34; 可自动关联各个荧光通道的图像。 
	注意：现在可以利用三色光谱信息提供的数据对事件进行分析和分类。</li>
	<li>使用内置拟合功能（拟合选项）对选定的曲线进行拟合。 
	注意：所采用的外排和内流方程适用于所有单指数扩散驱动过程，且可设置拟合边界。所得速率常数可使用直方图工具作图，或导出以进行进一步数据优化。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文介绍的技术可实现膜蛋白转运的高通量平行分析。重建的膜蛋白系统可直接应用于生物芯片，理论上使得所有膜转运蛋白或通道的适配成为可能。转运分析的限制仅在于荧光检测系统的建立，该系统可通过直接荧光变化（荧光分子或荧光标记底物的跨膜转运）或间接荧光变化（pH敏感性染料、次级酶促反应）实现。然而，后者尚未建立。
该技术主要关注在单个蛋白质水平上对膜通道或转运蛋白进行功能表征。结合自动化显微镜，还可建立针对蛋白质效应物的筛选应用。该检测体系支持最多8个芯片的平行记录，每个芯片上可设置多个检测位点。由于各芯片之间完全独立，因此实现了真正的并行检测，一旦实验条件确定，单次实验运行即可完成包括对照在内的多个实验重复。
实验设置中的关键步骤包括制备真正单层脂质体、目标蛋白的主动重组、蛋白脂质体在芯片表面的铺展效率，以及悬浮脂质双层对实验中所用底物的保留能力。
尽管制备单层囊泡对于本实验至关重要，以避免在悬浮脂双层形成过程中于芯片表面产生多层膜片，但通过在脂质体制备过程中进行超声处理，可相当...

在过去的20年中，膜蛋白的分析在基础研究和药物研发领域日益受到关注。新型药物的开发依赖于对新靶点的鉴定和深入表征，而这一环节目前仍是主要的限制因素。由于所有药物靶点中约有60%为膜蛋白1，因此发展用于阐明其功能的技术显得尤为重要。
过去，已开发出多种用于研究生电性通道和转运蛋白的技术2-4。相比之下，非生电性底物的研究则更具挑战性。然而，这类底物作为重要的药物靶点备受关注，因其可调控溶质和营养物质跨细胞膜的转运，并在信号转导级联中发挥关键受体功能5。
人们已投入大量努力开发用于研究膜转运蛋白功能的技术6,7。在该领域中，基于固相支撑膜的系统已成为最有前景的工具8-10，其中包括固相支撑脂双层、拴系脂双层11,12、微孔黑色脂膜13,14以及天然囊泡阵列15,16 等。其中一些系统甚至已有商业化装置可供使用17,18。已有若干研究实例实现了以高度并行的方式对单个膜蛋白进行研究的能力14,19，这是开展筛选应用的前提条件。然而，这些方法很少能从基础研究过渡到工业环境。其困难通常在于系统的自动化能力不足、生产成本高昂和/或制备过程繁琐。克服上述所有障碍的方法正是最终目标。
本文介绍的技术旨在研究膜通道蛋白和转运蛋白 体外 在单个蛋白质水平的受控环境中20-22. 将纯化的膜蛋白重组入大单层囊泡（LUVs）的方法远比用于大单层囊泡（GUVs）的类似方法更为成熟23-26 或黑色脂质膜27可直接应用于芯片表面，其中双层结构正通过自组装过程形成。纳米多孔芯片的玻璃底设计（图。 1) 可实现空气显微成像，从而便于系统的直接自动化。结合电动载物台，可同时测量多个芯片，每个视野包含数千个用于分析的密封腔体。
<img alt="纳米孔微腔示意图与显微镜图像；SiO2基底；微加工；纳米结构分析。" src="/files/ftp_upload/53373/53373fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1.多重纳米孔生物芯片的设计。A) 采用绝缘体上硅（SOI）晶圆，通过反应离子刻蚀进行结构化加工。每片晶圆可制备约1,150个独立芯片，所有芯片具有相同的性能和质量。B) 每个芯片包含250,000个独立的带有纳米孔的微腔。比例尺：200 µm。C) 每个微腔可通过多光谱荧光读取进行寻址。不透明的顶层可屏蔽缓冲液储液池中的荧光信号，使该生物芯片适用于倒置荧光显微镜。D) 原子力显微镜（AFM）成像显示，孔口排列均匀，二氧化硅层表面粗糙度为3.6 nm（n = 40），非常适合囊泡融合。比例尺：5 µm。E) 扫描电子显微镜（SEM）图像显示了穿过纳米孔的截面，可通入硅芯片内部的飞升级微腔。本图经许可重用自21。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
所有数据分析均使用免费软件进行，以确保最终用户无限制访问。时间序列数据通过免费图像处理软件和自定义开发的曲线分析软件进行分析，后者支持批量处理，并可直接对包含多个荧光通道和数千条曲线的大型数据集进行关联分析。
本方案中使用的模型蛋白是来源于 E. coli 的大电导机械敏感性通道蛋白（MscL）。该蛋白在自然界中发挥阀门作用，以释放渗透压休克，但已通过改造使其能够在其狭窄侧共价连接理性设计的合成功能基团。通过共价结合的激活剂（MTSET）产生的电荷排斥作用，可触发通道开启，从而形成纳米阀门。离子、水、小分子蛋白以及小分子荧光染料等小分子物质均可通过该通道。本文中，该蛋白被用作模型，以展示该系统检测蛋白介导的跨膜转运能力。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[2-(三甲铵基)乙基]&lt;br/&gt; 甲烷硫代磺酸盐</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td>T792900</td><td>MTSET；遇水水解。于-80 &amp;deg;C 保存干燥粉末分装样品。溶于缓冲液后立即使用（30分钟内）。</td></tr><tr><td>1 ml 气密式注射器</td><td>Hamilton</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 圆底烧瓶</td><td>Schott Duran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.7 mm 玻璃珠</td><td>Roth</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Roth</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>30 cm 鲁尔锁延长管</td><td>Sarstedt</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Roth</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 吸附剂</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td>首次使用前需活化</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;二水合物</td><td>Roth</td><td>HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>钙黄绿素</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td>避光保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>氯仿，试剂级</td><td>VWR Chemicals</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPE&lt;sup&gt;ATTO390&lt;/sup&gt;</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>避光保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt 一次性注射器</td><td>Braun</td><td>460 60 51V</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F 一次性注射器</td><td>Braun</td><td>91 66 017V</td><td></td></tr><tr><td>Keck 夹</td><td>Schott</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-磷脂酰胆碱，20%（大豆）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>5416016</td><td>在惰性气体保护下于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>NaCl 99.5% p.a.</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Nanopore E100 晶圆/芯片</td><td>Micromotive (Mainz/Germany)</td><td></td><td>可应要求提供</td></tr><tr><td>Nucleopore 径迹蚀刻膜，0.4 &amp;micro;m</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)</td><td>life Technologies</td><td>D-7173</td><td>避光保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>Luminartis (M&amp;uuml;nster/Germany)</td><td>OY-647-T-1mg</td><td>避光保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Rotilabo 注射式过滤器，非无菌，孔径 0.22 &amp;micro;m</td><td>Roth</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>尺寸排阻色谱柱填料</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>用于芯片固定在盖玻片上的固化剂</td></tr><tr><td>sticky-Slide 8孔板</td><td>ibidi</td><td>80828</td><td>用于安装在玻片上的多孔腔室（芯片支架）</td></tr><tr><td>三通旋塞阀（蓝色）</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲液，99.9% 超纯级</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &amp;micro;m 硝酸纤维素膜滤器</td><td>Roth</td><td>NH69.1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chi 461 水浴锅</td><td>B&amp;uuml;chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;chi Rotavapor RE 111</td><td>B&amp;uuml;chi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary Eclipse 荧光分光光度计&amp;nbsp;</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast Mini 挤出仪</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>膜泵&amp;nbsp;</td><td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight 纳米颗粒追踪显微镜</td><td>Malvern / Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>NyONE 显微镜</td><td>Synentec</td><td></td><td>可应要求提供</td></tr><tr><td>泵控制器</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪 Sonorex RK100H</td><td>Brandelin electronic</td><td>31200001107477</td><td></td></tr><tr><td>真空泵 RC5</td><td>Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅 W13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪 PDC-37G</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>开源软件</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td>科学图像处理软件</td></tr><tr><td>NanoCalcFX</td><td>免费软件</td><td>http://sourceforge.net/projects/nanocalc/</td><td>用于大规模传输动力学数据集的数据分析/评估软件</td></tr><tr><td>NTA 2.3 分析软件</td><td>Nanosight</td><td></td><td>纳米颗粒追踪显微镜的数据采集与分析软件</td></tr><tr><td>NTA 2.3 温度控制软件</td><td>Nanosight</td><td></td><td>纳米颗粒追踪显微镜的温度控制软件</td></tr></tbody></table>

基于高通量纳米孔芯片系统在单蛋白分辨率下分析膜转运过程

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

在单个蛋白质水平上，如果转运的底物不具有电化学性，则其膜蛋白运输过程仍难以进行详细分析。尽管该领域已付出大量努力，但能够实现自动化高通量运输分析、同时结合分析膜转运蛋白所必需的无溶剂脂双层技术的方法却极为罕见。然而，这类转运蛋白在细胞稳态中至关重要，因此是药物研发中的关键靶点，迫切需要新的方法来获得深入认识。
本文介绍了一种新型生物芯片的建立及其操作方法，该芯片可用于在单个转运蛋白分辨率下分析膜蛋白介导的转运过程。该生物芯片由被纳米孔包围的微腔构成，具有高度并行的设计特点，可实现工业化规模和批量生产。含有蛋白质的脂质体可直接施加于芯片表面，利用SSM技术（固相支持脂质膜）形成自组装的跨孔脂双层。膜的跨孔部分为游离状态，为底物向微腔内或外的转运提供了界面，且可通过多光谱荧光实时检测进行监测。标准操作程序（SOPs）的建立使得几乎所有能够功能性重建的膜蛋白均可在芯片表面高效地形成含蛋白脂双层。唯一前提是需建立针对非电活性转运底物的荧光检测系统。
通过使用自动倒置荧光显微镜并行记录多个芯片，可实现高内涵筛选应用。可利用免费提供的定制分析软件分析大规模数据集。三色多光谱荧光检测还能够对不同事件类别进行无偏的数据区分，从而消除假阳性结果。
芯片技术目前基于SiO2表面，但也可使用镀金芯片表面进行进一步功能化。

可以通过自组装方式在纳米结构芯片表面轻松形成跨越孔隙的膜。然而，该过程仍然较为复杂，并受到多种参数的影响，例如脂质体大小、脂质体群体的单分散性、膜层数、脂质浓度、盐浓度以及化学表面特性。上述方案中已对大多数参数进行了仔细表征并标准化。但其他一些参数在每次新制备过程中仍需检查，以确保实验成功。这些参数包括脂质体尺寸分布及群体分散性（图 2A）。为实现最佳的跨孔膜形成并避免脂质体侵入孔腔空间，脂质体尺寸必须明显大于孔径。此外，研究表明，单分散的脂质体制备物在膜铺展与融合过程中效果最佳。另一个每次制备时都必须验证的关键步骤是蛋白在重组后的活性。通过使用荧光去猝灭检测法，可对重组了MscLG22C的脂质体进行通道开放监测，从而通过荧光光谱法测定含有活性MscLG22C蛋白的脂质体比例（图 2B）。
<p class="jove_content" fo:keep-togethe...

本方案介绍了利用跨孔无溶剂脂双层在单个转运蛋白水平上分析膜蛋白介导的转运过程。该方法通过制备大量生产的纳米孔阵列芯片，结合高通量数据采集与分析，有望实现膜蛋白效应物筛选的未来应用。

单个膜蛋白水平上的蛋白质转运研究在底物为非电活性物质时仍难以进行详细分析。相当一部分……

该基于纳米结构芯片平台的总体目标是以高度并行的方式在单分子水平上分析膜蛋白功能。凭借其解析单个蛋白质的能力，该方法可获得关于膜转运和通量的新见解。该技术可用于解答膜蛋白研究领域中的关键问题，例如单个通道或转运蛋白的电导性或转运行为，特别是那些携带非电活性底物的蛋白。该技术的主要优势在于其高并行性，这源于具有数十万个纳米孔的纳米结构芯片设计，以及对转运事件的荧光检测读出。该技术的应用意义在于能够为膜蛋白构建高效的文库筛选最佳分析方法，因为基于芯片的平台可实现高度并行化和自动化的转运记录。通常，初次接触该方法的人员能够快速掌握所述技术的操作要领。本研究始终致力于开发一种用户友好的检测方法，以便所有感兴趣的人员均可采用。该膜转运检测技术利用经过反应离子刻蚀加工的绝缘体上硅晶圆实现。每片晶圆可制备约 1,000 个检测芯片。每个芯片包含 250,000 个微腔。这些微腔由含有目标转运蛋白的脂双层密封。膜构成传感器的界面。最初，荧光材料被限制在脂质双层的一侧，对应于其组成的脂质体内部。每个腔室均可通过多光谱荧光读出进行寻址。不透光的顶层可阻隔缓冲液储液池中的荧光信号，使该生物芯片与倒置荧光显微镜兼容。通过原子力显微镜测量，二氧化硅层上均匀排列的孔隙开口及其表面粗糙度为3.6纳米，此尺寸最适合囊泡融合。扫描电子显微镜显示了穿过纳米孔的横截面，该纳米孔通向硅芯片内部的飞升级微腔。本视频展示了蛋白脂质体的制备、检测芯片的准备以及基本检测操作的执行过程。将一个经乙醇清洗过的圆底烧瓶连接至旋转蒸发仪。在300毫巴、30摄氏度水浴温度及最大旋转速度条件下干燥脂质膜40分钟，以在烧瓶玻璃壁上形成均匀的脂质膜。然后，使用高真空泵在室温下将脂质膜再干燥30分钟。接着，向烧瓶中加入5毫升缓冲液和8个经乙醇清洗过的玻璃珠，以制备多层囊泡。将烧瓶连接至旋转蒸发仪，在50摄氏度下以最大转速无真空旋转。 45分钟后，溶液将呈现乳白色，瓶壁上无残留脂质膜。将烧瓶转移至惰性气体环境下，放入超声浴中，在室温下超声处理4分钟。超声处理可破坏脂质体，使其形成单层脂质体。现在，将大单层囊泡（LUV）溶液分装为1毫升的等分试样，使用液氮和40 °C水浴进行五次冻融循环。这将导致脂质体破裂、重排并生长。在最后一次冷冻步骤后，将所有样品保存于-80 °C。在重建LUV等分试样之前，使用微型挤出器将脂质体通过400纳米聚碳酸酯滤膜挤出17次。然后通过加入4%Triton X-100使LUV在溶液中终浓度达到0.25%以破坏其稳定性。将混合物在50摄氏度孵育5分钟。现在，将一份纯化并修饰的MscL与20份去垢剂饱和的脂质体混合，继续孵育30分钟。孵育结束后，取100微升等分试样，加入等体积的30毫摩尔钙调磷酸酶。在50摄氏度下孵育该混合物5分钟。现在，从经煅烧处理和未经处理的样品中去除去垢剂。向每个样品中加入在Tris缓冲液中的湿态Bio-Beads，并在4°C下于旋转板上孵育过夜。在实验前，使用活性测定法检测一份制备样品的活性。首先，将弹性体基础剂与固化剂混合，并将混合物充分干燥，使其完全脱气。胶粘剂配制完成后必须在30分钟内使用。同时，采取防护措施，使用玻璃注射器将5毫升氯仿滴加到盖玻片上进行清洗，并让玻片自然晾干。现在，使用10微升移液器将制备好的粘合剂滴加到盖玻片上。然后，用精细镊子小心地从晶圆板上取下一块芯片。将芯片有涂层的一面朝上，放置在粘合剂上，并轻轻按压使其与载玻片充分接触，以均匀分布粘合剂。切勿让气泡滞留在下方，或让粘合剂溢出到芯片上方。同时，组装时应确保其可放入八室载片架中。现在将组装好的样品置于烘箱中，在65°C下干燥两小时。随后，用数次溶剂清洗芯片，温度为 54 摄氏度，以去除保护层。首先将固定好的芯片放入载片架中，然后依次在三种溶剂浴中各孵育 10 分钟。异丙醇、丙酮和异丙醇。接下来，用超纯水小心且彻底地清洗芯片。最后，在氮气 gentle stream 下吹干芯片以完成整个过程。现在，准备一个八孔粘性载玻片，并将其倒置放在实验台上。然后，小心地提起盖玻片，将芯片面向孔的位置压到粘性载玻片上。让组装体静置数分钟后，再继续后续操作。在进行易位实验之前，按照文本方案中的描述，用Tris缓冲液彻底清洗芯片组件。接着，将浴槽溶液更换为含有5毫摩尔氯化钙和1微摩尔Oy647染料的DOPE化Tris缓冲液。然后，向芯片室中加入蛋白脂质体，使其终浓度为1毫克/毫升，并孵育1小时。一小时后，用400微升无钙Tris缓冲液将芯片冲洗四次。然后，向每个孔中加入受控染料，使其浓度达到5微摩尔，并继续进行检测。接下来，将芯片架安装到落射荧光显微镜上，聚焦于纳米孔芯片的边缘，以找到微腔结构。当微腔处于焦平面后，扫描纳米孔阵列以寻找具有最高顶面比的区域。具体细节在文本方案中提供。脂质体已制备完成，并对其粒径分布和分散性进行了检测。制备的脂质体大于检测所需的孔径，这一点至关重要。同时，单分散的脂质体也是理想的。在实验前，通过荧光去猝灭检测方法对脂质体制备过程中修饰的 MscL 蛋白进行了检测。含有活性修饰型 MscL 的脂质体比例足以满足进行易位实验的要求。在生物芯片上，观察到荧光标记的溶质通过修饰后的 MscL 通道发生转运。使用化学调节剂 MTSET 通过静电排斥作用打开经基因改造的 MscL 通道。随后监测了腔内荧光强度的下降过程。该过程具有高度可重复性，外排事件非常一致。所得的外排曲线聚集成两个明显不同的群体，分别对应单通道或多个通道的易位事件。该系统能够实时分析最多三种具有独特荧光特性的染料，从而精确区分阳性结果、单指数外排事件、复杂动力学过程、脂质侵入以及膜破裂。掌握该技术后，可依次完成芯片制备、样品制备、成像和分析等连续步骤，使整个实验流程具有模块化特点。

membrane-transport-processes-analyzed-highly-parallel-nanopore-chip

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生物学

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本方案介绍了一种在细胞环境中实时测量腺嘌呤核苷酸与受体结合的方法。该结合过程通过三硝基苯基核苷酸衍生物与标记了非天然荧光氨基酸的蛋白质之间的荧光共振能量转移（FRET）进行检测。...

实时测量完整功能性膜蛋白的核苷酸结合

本方案描述了一种基于iSCAT的图像处理与单粒子追踪方法，可同时研究大分子与脂质膜相互作用时的分子质量及其扩散行为。文中提供了样品制备、质量-对比度转换、视频采集和后期处理的逐步操作指南，并给出了避免潜在问题的建议。...

利用质量敏感型粒子追踪技术表征膜相关大分子动力学

本方案描述了如何使用全内反射荧光显微镜（TIRF）追踪支撑脂质膜中的单个离子通道并测定其活性，从而阐明侧向膜运动与通道功能之间的相互作用。方案详细介绍了如何制备膜样品、记录数据以及分析结果。...

使用全内反射荧光显微技术对脂双层中单分子侧向迁移及离子通道活性进行成像

了解纳米孔芯片技术如何以高度并行方式在单分子水平分析膜蛋白功能。该方法利用荧光读数解析单个转运蛋白的运输动态，为膜蛋白筛选提供高通量检测平台。

基于高通量纳米孔芯片系统在单蛋白分辨率下分析膜转运过程

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