从人类腭扁桃体B和T淋巴细胞有效隔离协议

该程序的总体目标是从人扁桃体样本中获得 BNT 淋巴细胞组分。这种方法可以帮助回答病毒学领域的关键问题，例如 BT 淋巴细胞组分在病毒性疾病的发病机制中的作用 手术切除后三小时内。将扁桃体组织装在 50 毫升离心管中运送到实验室，离心管中装有冰冷、无菌的含 HBSS 补充剂。

然后使用推荐用于处理人体组织的适当生物安全程序。用含有 HBSS 的新鲜补充剂润湿组织，并将扁桃体转移到冰上的 60 毫米塑料细胞培养板上。使用镊子去除任何可见的血凝块或脂肪和结缔组织，然后将扁桃体转移到一个新的 60 毫米板中，其中包含 5 毫升 HBSS 和补充剂。

接下来，剪切。扁桃体组织聚集成 3 到 10 毫米的碎片，然后使用塑料注射器的柱塞端将碎片顺利转移到含有 10 毫升新鲜 HBSS 和补充剂的新型 60 毫米细胞培养板中的 100 微米塑料细胞过滤器中。通过细胞过滤器挤压组织碎片，确保在所有组织浸渍后扁桃体碎片仍完全浸没在 HBSS 中，丢弃过滤器并将所得细胞悬液转移到冰上的 50 毫升塑料离心管中。

用含有新鲜 HBSS 的补充剂使细胞溶液的最终体积为 35 毫升，然后将 10 毫升室温密度梯度溶液加入几个 50 毫升锥形管中。轻轻地将细胞悬液覆盖在密度梯度的顶部，注意不要混合溶液，然后通过离心分离细胞。单核细胞将在与位于管底部沉积物中的红细胞、成纤维细胞和细胞碎片的界面处分离成蓬松的白色层。

使用 10 毫升移液器，小心收集单核细胞层并将单核细胞拉入新的 50 毫升试管中。然后在每次洗涤 25 毫升冰冷的 PBS 中洗涤细胞 3 次，并将最终沉淀重悬于 15 毫升 PBS 中。计数活细胞的数量后，将细胞置于冰上，通过磁珠分离分离扁桃 T 细胞。

旋转单核细胞悬液，并将沉淀重悬于 80 微升冰冷分离缓冲液中，每 1 乘以 10 至 7 个细胞。然后将细胞悬液转移到无菌的 2 毫升试管中，在 20 微升 CD 三磁性抗体中，在 4 摄氏度下孵育 1 小时，连续温和混合，以保持细胞和悬液在孵育结束时，将细胞转移到含有 5 毫升冰冷分离缓冲液的 15 毫升试管中，并在洗涤过程中洗涤它们。将磁分离器连接到支架上，并在磁力架上加载一个色谱柱。

用 500 μL 冰冷的分离缓冲液清洗色谱柱，然后在色谱柱顶部放置一个 40 μm 的过滤器。现在，将细胞沉淀重新悬浮在 500 μL 新鲜分离缓冲液中，并通过过滤器将细胞加载到色谱柱上，将含有 EIT 的 B 细胞收集在 15 mL 锥形瓶中。当所有细胞都进入收集管时，两个冰块。

用 500 微升分离缓冲液洗涤柱子 4 次，每 1 次 10 次，向 7 个细胞中洗涤，等待柱储液器排空，然后再进行下一次洗涤。最后一次洗涤后，将色谱柱转移到新的 15 mL 收集管中。然后使用柱塞将 2 ml 分离缓冲液穿过柱压入试管中，以收集 CD 三个阳性 T 细胞组分。

为了分析分离的 B 和 T tonsor 细胞组分，将 CD 3 阳性和 CD 3 阴性细胞组分沉淀，并在第二次旋转后在补充有 0.2%BSA 或 PBSA 的一毫升 PBS 中洗涤两组细胞。将 100 微升等分试样的细胞和 PBSA 分配到适当数量的试管中进行传真标记，并向每个试管中加入适量的氟 4 偶联单克隆抗体或对照抗体。然后短暂涡旋试管，并在孵育结束时在 4 摄氏度的黑暗中孵育 30 分钟。

用新鲜的 PBSA 洗涤试管两次，然后用 1% 多聚甲醛固定细胞染色，以通过 PCR 检测细胞中腺病毒 DNA 的存在。在适当的循环条件下进行 PCR 扩增，在 1.5%AGROS 凝胶和 interestate EDTA 缓冲液上分离所得的 PCR 扩增产物。最后，使用适当的核酸染色剂可视化所得条带。

根据标准方案，成功分离 tonsor 单核细胞可产生高度纯化的 BNT 淋巴细胞亚群，通过使用抗 CD 20 和抗 CD 两种抗体分别检测 b 和 t 淋巴细胞群的流式细胞术分析证实。相比之下，单核细胞的低效分离导致细胞组分是来自 b 和 t 淋巴细胞的细胞混合物。正如刚才所示，可以从磁珠分离的 b 和 t 淋巴细胞中提取亚群、DNA 和 RNA，用于下游分析。

例如，在这里，通过 PCR 检测到的 TONSOR T 淋巴细胞中腺病毒 DNA 的特异性检测显示出高质量的细胞质。RNA 也可以从分离的 tonsor B NT 淋巴细胞中提取。如果技术执行得当，可以在 6 小时内处理一次怪物两个扁桃体样本。

在尝试此程序时，尽快处理扁桃体样本很重要。洗涤步骤的数量和洗涤缓冲液的体积也是获得良好结果的关键参数。按照此程序，可以执行其他方法，如 QPCR 和 R-T-Q-P-C-R，以回答有关病毒 DNA 和 mRNA 发育后定量存在的其他问题。

这项技术为病毒学领域的研究人员探索人类淋巴组织中不同病毒种类的发病机制和潜伏期铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何从人扁桃体样本中分离 BT 淋巴细胞组分有很好的了解。不要忘记，使用未经筛选的人类来源材料（如血液和组织）可能非常危险。

因此，应遵循适当的安全措施。