Name: 基于角蛋白纳米纤维生物医学工程合成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: 学习利用静电纺丝技术合成角蛋白/PCL纳米纤维，用于生物医学工程中的组织工程和伤口愈合应用。该方法成本低、效率高，可支持细胞生长并适用于大规模生产。

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作者感谢美国国家科学基金会通过金属生物材料革命化工程研究中心（ERC-0812348）和纳米技术本科教育项目（EEC 1242139）提供的资金支持。

所有实验方案均遵循北卡罗来纳州A&amp;#38;T州立大学研究合规与伦理办公室
1. 角蛋白提取的化学试剂制备 4
<ol>
	<li>在通风橱内，将 20 ml 过氧乙酸加入 980 ml 去离子水（DI 水）中，配制 1,000 ml 质量体积比为 2% 的过氧乙酸溶液（PAS）。</li>
	<li>将 12.2 g 三羟甲基氨基甲烷碱（Tris Base）加入 1,000 ml 去离子水（DI 水）中，搅拌至完全溶解，配制 1,000 ml 浓度为 100 mM 的 Tris 碱溶液（TBS）。</li>
	<li>在通风橱内，将 4 ml 浓盐酸倒入 30 ml 去离子水（DI 水）中，制备稀释盐酸溶液（DHAS）。</li>
	<li>收集约 20 g 未经化学处理或修饰的人类毛发样本，毛发长度不限。</li>
	<li>用手以温水和肥皂彻底清洗毛发，并用去离子水（DI 水）进行最终漂洗。</li>
	<li>将毛发放入两个 600 ml 烧杯中，置于 80 ºC 烘箱内干燥 1 小时。</li>
	<li>倒掉烧杯底部液体，将烧杯重新放回烘箱，直至毛发完全干燥。</li>
	<li>将干燥后的毛发均分至两个 600 ml 烧杯中，每杯放入 10 g 毛发，确保毛发总体积不超过 500 ml。</li>
	<li>向每个烧杯中倒入 500 ml 过氧乙酸溶液（PAS），确保完全浸没毛发。用封口膜覆盖烧杯，静置 12 小时。</li>
</ol>
2. 角蛋白提取液的制备
<ol>
	<li>使用500 µm筛子将毛发与PAS分离。将废弃的PAS收集到单独的容器中。用去离子水彻底冲洗毛发，以去除残留的PAS。</li>
	<li>将冲洗后的毛发放入500 ml的烧瓶中。向烧瓶中加入400 ml TBS，确保毛发完全浸没。将烧瓶置于摇床中，设置温度为38 ºC、转速为65 rpm，振荡1小时。</li>
	<li>1小时后，从摇床中取出烧瓶，将液体（约400 ml角蛋白提取液，KES）倒入1,000 ml烧杯中。</li>
	<li>向含有毛发的烧瓶中加入400 ml去离子水，确保毛发完全浸没，然后放回摇床中继续振荡1小时。振荡结束后，将剩余的400 ml KES倒入之前收集KES的1,000 ml烧杯中。毛发已不再需要，可从烧瓶中倒出并丢弃至最近的垃圾桶中。</li>
</ol>
3. 角蛋白提取液的浓缩
<ol>
	<li>在旋转蒸发仪浴槽中加入蒸馏水至最高刻度线，设置温度为 90 ºC。将旋转速度设为 200 rpm。开启冷却循环泵，并设置温度为 -10 ºC。</li>
	<li>使用 pH 计监测 KES 的 pH 值，用移液器缓慢向 KES 中加入 1 mM DHAS，直至 pH 达到 7.0。添加溶液时缓慢搅拌。</li>
	<li>将中和后的 KES 倒入 500 ml 圆底烧瓶中，装液量约为四分之一。按照制造商的操作规程运行蒸馏装置，持续 1.25 小时。
	<ol>
		<li>重复步骤 3.3，直至所有 KES 均完成蒸馏。确保烧瓶连接紧密。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 角蛋白提取液的透析
<ol>
	<li>将KES溶液均等地倒入12个独立的14 ml锥形管中。在1,050 × g条件下离心10分钟。</li>
	<li>将离心后的KES溶液倒入干净的烧杯中，注意倾倒时避开收集的残渣。重复此步骤，直至所有KES溶液均完成离心。</li>
	<li>用去离子水填充一个2,000 ml量筒。</li>
	<li>将透析袋纤维素膜剪成24英寸长，并用夹子夹住一端以密封。</li>
	<li>将透析管整段浸入去离子水的量筒中，使其变得更柔韧且易于打开。</li>
	<li>打开透析袋纤维素膜未夹住的一端，缓慢将60 ml离心后的KES溶液倒入管内。用另一个夹子封闭该端。</li>
	<li>将透析管放入盛有2,000 ml去离子水的量筒中，静置24小时。每隔3至4小时更换一次量筒中的去离子水。</li>
	<li>24小时后，将透析完成的KES溶液倒入带盖的容器中，注意顶部留出空间，并置于-20°C冰箱中冷冻24小时。</li>
</ol>
5. 角蛋白提取液的冻干
<ol>
	<li>将冻干机设置为 -86 ºC。</li>
	<li>从冰箱中取出装有冷冻 KES 的罐子，打开罐盖，将内容物放入冻干安瓿瓶中。将密封盖盖在安瓿瓶上，旋转旋钮使真空压力达到 0.133 mBar。将样品冻干约 48 小时，直至所有水分完全去除。</li>
</ol>
6. 静电纺丝溶液的制备（10 wt % 角蛋白溶液）
<ol>
	<li>从冷冻干燥机中取出角蛋白粉末并称重。</li>
	<li>向角蛋白粉末中加入去离子水，配制成10% 质量/质量的角蛋白溶液。</li>
</ol>
7. 10% 质量分数 PCL 溶液的制备
<ol>
	<li>获取PCL（ε-己内酯聚合物，Mn 70 - 90 kDa）和三氟乙醇（TFE）。将PCL按10%（质量分数）溶于TFE中，搅拌过夜&#160;，得到均匀混合溶液。</li>
</ol>
8. 角蛋白/PCL 溶液的制备
<ol>
	<li>取先前配制好的10 wt % PCL溶液和10 wt % 角蛋白溶液。将角蛋白溶液逐滴加入PCL溶液中，制备总体积为10 ml、比例分别为90:10、80:20、70:30和60:40的PCL/角蛋白混合溶液。</li>
	<li>在进行静电纺丝前，使用涡旋振荡器使PCL/角蛋白溶液充分混合均匀。</li>
</ol>
9. 静电纺丝PCL/角蛋白纤维的制备
<ol>
	<li>将约 8 ml 的 PCL/角蛋白溶液装入一个带有 0.5 mm 直径塑料管的一次性 10&#160;ml 注射器中。将该注射器放入注射泵，设置流速为 2.5 ml/hr。</li>
	<li>对连接在塑料管上的针头尖端施加电压（针头距离纤维收集滚筒约 23 cm，与水平方向成约 30 度角）。向塑料管施加 19–22 kV 的电压，并以约 200 rpm 的速度旋转收集滚筒。
	<ol>
		<li>在运行样品前，用铝箔包裹收集滚筒。通过在两端使用标签胶带固定，确保铝箔稳定。 
		注意：纤维将在铝箔上形成（见图 2），将覆盖有纤维的铝箔在室温下保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. PCL/角蛋白纳米纤维的力学分析
<ol>
	<li>将样品切割为 60 mm × 8 mm 的尺寸。使用数显千分尺测量并记录样品厚度。每种配比制备五个样品。</li>
	<li>将 60 mm × 8 mm 的样品安装在拉伸试验机上。使用定制设计的样品夹具固定样品。用双面胶将样品夹在由索引卡制成的夹具之间，形成三明治结构。采用 10 N 负载传感器，以 10 mm/min 的位移速率进行测试。 
	注意：样品夹具设计尺寸为 62 mm × 40 mm，中间窗口为 50 mm × 38 mm。</li>
	<li>根据软件操作规程，通过软件记录伸长量和载荷值。</li>
	<li>通过将力除以测试样品的横截面积来计算应力。接着，通过将长度变化量除以初始长度来计算应变。</li>
	<li>通过在 x 轴上绘制应变值、在 y 轴上绘制对应的应力值，生成应力-应变曲线。</li>
	<li>从线性区域计算杨氏模量，该区域的斜率等于弹性模量。通过在应力-应变图上取 0.2% 的应变偏移量，并作一条与线性区域平行的直线，由此确定抗拉强度。</li>
	<li>使用分析软件对之前三次重复获得的力学数据进行单因素方差分析8。统计学显著性定义为 p 值 &#60;0.05。</li>
</ol>
11. 表面形貌与结构表征
<ol>
	<li>使用扫描电子显微镜（SEM），在加速电压为 15 kV、电流为 5 µA 的条件下观察电纺纤维的形貌。
	<ol>
		<li>在进行 SEM 成像前，裁剪一块 2 cm2 的纤维样品，用铜导电胶带将其固定在 SEM 样品台上。将样品台放入溅射镀膜仪中，在 15 mA 条件下镀金 1 分 30 秒，使金层厚度约为 11 nm。将样品装入 SEM 样品室，观察纤维样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征 PCL 与角蛋白之间的化学键合。将一块 2 cm2 的电纺纳米纤维膜置于磁性样品架中，测试前用干燥空气吹扫系统。采集 200 次扫描的光谱，并根据软件操作规程使用标准软件分析光谱。</li>
	<li>使用标准软件进行光谱分析，并按照制造商的操作规程，对每种比例的纳米纤维样品进行三组重复实验。</li>
</ol>
12. 细胞-纤维相互作用的研究
<ol>
	<li>将纤维切割成 16 mm2 的样品。使用生物相容性的硅胶基胶水将每个样品固定在直径为 12 mm 的盖玻片上。</li>
	<li>将纤维样品的一端粘在盖玻片背面，将样品绕过盖玻片表面，再将另一自由端也粘在盖玻片背面，使盖玻片顶部仅覆盖纤维样品。</li>
	<li>将纤维样品放入 24 孔板中。通过将其浸入 80% 乙醇中 1 小时进行灭菌处理。</li>
	<li>用去离子水冲洗去除样品上的乙醇。然后用移液器将 2 ml 基础培养基加到样品上，确保完全覆盖整个样品。5 分钟后移除培养基。</li>
	<li>使用成纤维细胞 3T3 细胞接种纤维样品。将细胞悬浮于添加抗生素和 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，使每 1 ml DMEM 中含有约 62,000 个细胞/cm2&#160;。</li>
	<li>向每个孔板中加入 1 ml 含 3T3 细胞的 DMEM 溶液，确保每个纤维样品上接种密度约为 62,000 个细胞/cm2。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 24 小时。注意：使用 5% CO2 是因为该浓度通常可在数天内维持细胞培养基的 pH 值处于生理范围。</li>
</ol>
13. 纳米纤维基质的降解
<ol>
	<li>将干燥的PCL/角蛋白纳米纤维膜裁剪成约30 mm × 30 mm的正方形。</li>
	<li>用80%酒精对900 mm2的样品处理10分钟进行灭菌，并用去离子水充分清洗。将样品置于15 ml、pH 7.5的PBS中，在37 ºC下孵育，每3天更换一次缓冲液。</li>
	<li>在指定时间点（1周和7周）取出膜样品，并用去离子水冲洗。</li>
	<li>将膜样品放入冷冻干燥安瓿瓶中，密封安瓿瓶并旋转旋钮以形成真空，冷冻干燥24小时，直至完全干燥。</li>
	<li>使用铜胶带将干燥样品固定在扫描电镜（SEM）样品台上。将样品台放入溅射镀膜仪中，在15 mA条件下镀金1分30秒。</li>
	<li>将样品装入扫描电镜腔室，在加速电压1.5 kV、电流5 µA的条件下观察纤维形貌。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

已成功从人发中提取角蛋白。过氧乙酸作为氧化剂作用于人发，使角蛋白能够被Tris碱提取。由于该操作仅用于研究目的，因此角蛋白粉末的制备规模较小。此方法在工业上已建立用于大规模生产。小规模提取角蛋白的目的是为了控制污染、批次间的变异性和成本效益。
角蛋白的提取是该实验流程中的限速步骤。角蛋白粉末的产率非常低，仅为0.7 - 2%。20克人发仅可获得0.14 - 0.4克角蛋白。制备电纺纤维的另一个关键步骤是配制适合电纺的溶液。角蛋白虽可轻易分散于去离子水中，但在进行电纺时，角蛋白/水溶液无法形成纤维。为了提供形成纳米纤维所需的分子间相互作用，向溶液中引入了一种共聚物。聚己内酯（PCL）溶于三氟乙醇（TFE）后，可通过氢键与角蛋白发生更强的相互作用。由于TFE具有电负性和酸性特性，它在维持共聚物复合物的稳定性方面起到了主要作用。
由于聚己内酯（PCL）具有疏水性，而角蛋白具有亲水性，将角蛋白溶液与PCL溶液混合带来了新的挑战。随着角蛋白比例的增加，获得均匀混合物变得困难。通过将角蛋白溶液逐滴加入PCL溶液中，并手动涡旋振荡30分钟，...

静电纺丝被认为是一种制备聚合物纳米纤维的常用方法。该方法可制备出纳米尺度的纤维，且纤维特性可定制1。这些进展以及静电纺丝纳米纤维的特性，使其在生物医学工程领域，尤其是在组织工程中的应用备受关注。静电纺丝纳米纤维具有类似于细胞外基质的结构，因而能够促进细胞的黏附、迁移和增殖2。由于与细胞外基质（ECM）具有相似性，静电纺丝纤维可作为材料用于伤口敷料、药物递送，以及肝脏、骨骼、心脏和肌肉等组织的工程化构建3。
多种不同来源的合成与天然聚合物已被用于制备静电纺丝纤维，以应用于不同的生物医学工程领域4。近年来，通过混合合成聚合物与天然聚合物来开发复合纳米纤维的研究兴趣日益增长4。在这些复合材料中，最终产物通常继承了合成聚合物所具有的机械强度，同时获得了天然聚合物提供的生物学信号和特性。
在本实验中，PCL 和角蛋白分别作为合成聚合物和天然聚合物，用于复合纳米纤维的制备。角蛋白是一种存在于毛发、羊毛和指甲中的天然聚合物，含有多种氨基酸残基，其中特别值得关注的是半胱氨酸4,5。理想的天然聚合物应具备生物可再生性、生物相容性和生物可降解性。角蛋白不仅具备这三种特性，还能增强细胞在其所掺入的生物材料上的增殖和黏附能力6。
聚己内酯（PCL）是一种可吸收的合成聚合物，在组织工程中具有重要意义4。该聚合物此前因其结构和机械稳定性而受到认可，但其缺乏细胞亲和性，且降解速率较长。PCL的疏水性可能是导致其细胞亲和性差的原因7。然而，PCL具有与其他聚合物高度相容的优势，可在一定程度上弥补其局限性。PCL/角蛋白复合材料应能体现PCL的机械性能，并结合角蛋白的生物学特性，使其成为多种生物医学应用的理想选择。

<table><tbody><tr><td>人发&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>来自格林斯伯勒当地理发店</td></tr><tr><td>过氧乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚己内酯（PCL，e-己内酯聚合物）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>502-44-3</td><td>数均分子量（Mn）70–90 kDa</td></tr><tr><td>三氟乙醇（TFE）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75-89-8</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱（TrizmaTM碱粉末）</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>&gt;99.9%结晶态</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fischer Scientific</td><td>A144C-212 批号 093601</td><td>马萨诸塞州沃尔瑟姆</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>佛罗里达州萨拉索塔</td></tr><tr><td>纤维素膜</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>截留分子量 12–14 kDa</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus BX51M</td><td>BX51M</td><td>日本</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>Hitachi SU8000</td><td>SU8000</td><td>日本</td></tr><tr><td>台式岛津试验机</td><td>北美分析与测量仪器 AGS-X 系列</td><td>AGS-X 系列&amp;nbsp;</td><td>马里兰州哥伦比亚</td></tr><tr><td>傅里叶变换红外光谱（FTIR）</td><td>Bruker Tensor 2 仪器&amp;nbsp;</td><td></td><td>马萨诸塞州比勒里卡</td></tr><tr><td>Microcal Origin 软件</td><td></td><td></td><td>马萨诸塞州北安普顿</td></tr><tr><td>X射线衍射（XRD）</td><td>Bruker AXS D8 Advance X射线衍射仪</td><td></td><td>威斯康星州麦迪逊</td></tr><tr><td>成纤维细胞 3T3&amp;nbsp; 细胞</td><td>美国模式培养物集存库（ATCC）</td><td></td><td>弗吉尼亚州马纳萨斯</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>纽约州格兰岛</td></tr><tr><td>Spectra max Gemini XPS 微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>加利福尼亚州森尼韦尔</td></tr><tr><td>Student-Newman-Keuls 事后检验</td><td>SigmaPlot 12 软件</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于角蛋白的纳米纤维在生物医学工程中的合成

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

静电纺丝因其多功能性及在多个领域的应用潜力，被广泛用于制备纳米纤维。由于多孔纳米纤维具有独特的物理化学性质，其制备备受关注。本文详细阐述了含角蛋白的聚(ε-己内酯)(PCL)纳米纤维的制备方法即，PCL/角蛋白复合纤维）。首先从人发中提取水溶性角蛋白，并按不同比例与PCL混合。将PCL/角蛋白混合溶液通过实验室自制的静电纺丝装置制备成纳米纤维膜。采用扫描电子显微镜和拉伸试验机对所得纳米纤维的形貌和力学性能进行观察与测定。此外，通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）研究纳米纤维的降解性能和化学特性。扫描电镜图像显示，不同组成的PCL/角蛋白纤维均具有均匀的表面形貌。这些PCL/角蛋白纤维还表现出优异的力学性能，如杨氏模量和断裂点。成纤维细胞能够在其表面黏附并增殖，表明其具有良好的细胞活力。基于上述特性，可以有力地论证，天然与合成聚合物共混纳米纤维代表了一类优异的复合材料，在多种生物医学应用中具有广阔前景。

纤维形态 
对所有纤维组分均获得了纤维的扫描电镜（SEM）图像。见图3。 纤维图像证实，纤维呈随机取向排列。
机械测试 
机械强度高的纤维通常被要求用于各种组织工程应用。这些纤维应在特定的应力和环境条件下保持足够的强度和柔韧性9通常，支架的模量应接近目标组织的模量，以避免产生应力屏蔽效应，并在使用过程中保持足够的强度 体内 和/或 体外 细胞生长10采用拉伸试验机测定纤维的杨氏模量和断裂强度。PCL/角蛋白在比例分别为100:00、90:10、80:20和70:30时的杨氏模量（MPa）分别为10 ± 2、8 ± 1、5 ± 1.5和4.5 ± 1.6。4同样，PCL/角蛋白在100:00、90:10、80:20和70:3...

静电纺丝纳米纤维具有高比表面积、优异的机械完整性，并能支持细胞生长和增殖。这些纳米纤维在生物医学领域具有广泛的应用前景。本文采用静电纺丝技术制备角蛋白/聚己内酯（PCL）纳米纤维，并对其特性进行表征，以探索其在组织工程中的潜在应用。

静电纺丝因其多功能性及在多个领域的应用潜力，正被频繁用于制备纳米纤维。纳米纤维的制备……

本实验的总体目标是合成并表征用于生物医学应用的角蛋白基纳米纤维。该方法有助于解决生物医学工程领域的一些关键问题，例如伤口愈合、药物递送以及工程化组织（如肝脏、骨骼和肌肉）的构建。该技术的主要优势在于成本低廉、效率高，并且可升级为大规模生产。该技术的应用可拓展至伤口治疗及组织再生中的药物递送。尽管该方法有助于理解使用静电纺丝纳米纤维的优势，也可应用于其他体系，例如组织再生。通常，初学者在操作该方法时会遇到困难，因为制备能够生成纳米纤维的聚合物材料具有较高难度。获取约 20 克未经化学处理或修饰的人类毛发样本，毛发长度不限。用温水和肥皂手工彻底清洗毛发。使用去离子水进行最终冲洗。将毛发放入两个600毫升烧杯中，置于80摄氏度烘箱内一小时。干燥后，将干燥毛发均匀分配至两个600毫升烧杯中，每个烧杯放入10克毛发。切勿使毛发体积超过500毫升。接下来，向每个烧杯中加入500毫升过氧乙酸溶液（PAS），确保完全覆盖所有毛发。用Parafilm封住烧杯口，室温放置12小时。使用500微米筛子将毛发与PAS分离，并将废弃的PAS收集到单独的容器中。用去离子水彻底冲洗毛发，以去除残留的PAS。将冲洗后的毛发放入500毫升的烧瓶中，加入400毫升100毫摩尔的Tris碱溶液（TBS），确保毛发完全浸没。然后，将烧瓶放入设定为 38 摄氏度、65 RPM 的摇动水浴中，持续 1 小时。1 小时后，从摇动水浴中取出烧瓶。倒出液体，即约 400 毫升的角蛋白提取液（KES），至一个 1000 毫升的烧杯中。将400毫升去离子水倒入含有毛发的烧瓶中，确保毛发完全浸没，然后将烧瓶重新放回振荡水浴中，持续一小时。从振荡水浴中取出烧瓶，将剩余的400毫升KES倒入装有先前收集的KES的1000毫升烧杯中。毛发已不再需要，可丢弃至最近的垃圾桶中。按照文本方案中所述中和收集的KES后，将溶液倒入500毫升圆底烧瓶中，至约四分之一满。根据制造商的操作说明运行蒸馏器1.25小时，确保烧瓶连接紧密。重复此过程，直至全部KES完成蒸馏。将蒸馏的KES溶液均等地倒入12个独立的14毫升锥形管中。以1,050 ×g离心10分钟。将离心后的KES倒入洁净的烧杯中，注意倾倒时避开收集的残渣。重复此步骤，直至所有KES均完成离心。接着，将透析袋纤维素膜剪成24英寸长，并用夹子夹住一端以确保其封闭。打开透析袋纤维素膜未夹住的一端，缓慢将60毫升离心后的KES溶液倒入透析袋中。用另一个夹子封闭透析管的此端。将透析管放入盛有 2,000 毫升去离子水的烧杯中，静置 24 小时，每隔三到四小时更换一次烧杯中的去离子水。然后将透析后的 KES 溶液倒入带盖的容器中，注意顶部需留出空间。将带盖的罐子放入-20摄氏度的冰箱中冷冻24小时。24小时冷冻结束后，取下罐子的盖子，将内容物转移至冻干安瓿瓶中。为安瓿瓶加盖密封，旋转旋钮使真空压力达到0.133毫巴。将样品冻干约48小时，直至所有水分完全去除。通过将10 wt%的角蛋白溶液逐滴加入10 wt%的PCL溶液中，制备PCL-角蛋白溶液，从而配制成总体积为10毫升、PCL与角蛋白比例分别为90:10、80:20、70:30和60:40的溶液。取约8毫升经涡旋混合的PCL/角蛋白溶液，注入一支10毫升的一次性注射器中，注射器前端连接一根直径为0.5毫米的塑料管。将注射器放入流速设定为每小时2.5毫升的注射泵中。对连接至导管的针头尖端施加电压。向导管施加19至22千伏的电压，并以约200转/分钟的速度旋转收集滚筒。将纤维切成 16 平方毫米的样品。使用生物相容性硅胶将每个样品固定在直径为 12 毫米的盖玻片上。将纤维样品的一端粘在盖玻片背面，并将样品绕盖玻片缠绕。然后，将样品的游离端也粘贴到盖玻片背面，使盖玻片顶部仅覆盖纤维样品。将纤维样品置于24孔板中。通过将样品浸入80%乙醇中一小时进行消毒。使用去离子水冲洗样品中的乙醇。然后，用移液器将 2 毫升基础培养基加到样品上，确保完全覆盖样品并孵育五分钟。使用成纤维细胞 3T3 细胞接种纤维样品。将细胞悬浮于DMEM中，添加抗生素和10%胎牛血清，使每毫升DMEM中约含有62,000个细胞/平方厘米。向每孔中加入1毫升含3T3细胞的DMEM溶液，确保每块纤维样品表面覆盖约62,000个细胞/平方厘米。将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时。将干燥的PCL/角蛋白纳米纤维膜剪裁后，用80%酒精对900平方毫米的样品进行消毒，孵育10分钟。随后，用去离子水彻底清洗膜。接着，将样品在15毫升、pH 7.5的PBS中于37摄氏度孵育，每三天更换一次缓冲液。在指定的一周和七周时间点，将膜从溶液中取出，用去离子水冲洗，然后将膜样品放入冷冻干燥机的安瓿瓶中。将密封件放置在安瓿瓶上，抽真空，使样品冻干24小时，直至完全干燥。接着，使用铜胶带将干燥后的样品固定在扫描电子显微镜（SEM）载物台上。将载物台放入溅射镀膜仪中，以15毫安电流镀金1分30秒。将样品装入扫描电镜（SEM）的样品室中。在1.5千伏加速电压和5微安电流条件下观察纤维样品。此处展示了由PCL/角蛋白溶液成功电纺所得的纳米纤维的代表性图像，其中PCL/角蛋白比例分别为70比30、80比20和90比10。电纺纤维的杨氏模量接近天然组织的数值。随着角蛋白比例的增加，杨氏模量降低。该图展示了杨氏模量随PCL/角蛋白比例变化的趋势图。此处展示的傅里叶变换红外光谱证实了聚己内酯（PCL）与角蛋白之间的化学键合。在1,722 cm⁻¹处测得的主要吸收峰与PCL吸收带的标准基本测量值一致，在所有光谱中均可观察到。PCL-角蛋白纤维上的细胞黏附与增殖实验结果证实，该纤维无细胞毒性，并可支持细胞生长。成纤维细胞沿纳米纤维生长的丝状伪足表明，成纤维细胞与PCL/角蛋白纤维之间具有良好的相互作用。一旦掌握，若操作得当，该纳米纤维合成技术可在24小时内完成。在进行静电纺丝操作时，需注意聚合物溶液的黏度、溶液流速、施加电压、旋转滚筒的转速，以及成纤维细胞培养的步骤。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备基于聚己内酯/角蛋白的纳米纤维，以及该技术在生物医学工程领域的重要性。在此方法基础上，可进一步开展细胞活力检测和体内降解实验，以探究纤维对组织的毒性反应、组织生长情况以及纤维降解行为等更多科学问题。该技术的建立为再生工程领域的研究人员开辟了新的研究方向，例如皮肤再生、创伤愈合以及药物递送等领域的探索。请注意，使用三氟乙醇（TFE）等有机溶剂以及高电压操作可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须采取必要的安全防护措施，例如佩戴护目镜、实验服和手套，并妥善处理有机溶剂。

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基于角蛋白纳米纤维生物医学工程合成

本文描述了一种制备具有可特异性结合蛋白质功能基团的纳米纤维的高效方法。该方法首先需要制备带有适当功能基团的聚合物。通过静电纺丝技术将该功能化聚合物加工成纳米纤维。采用共聚焦显微镜研究纳米纤维与蛋白质结合的有效性。...

生物功能纳米纤维的制备方法

静电纺丝支架可在制备后进行加工，以用于组织工程应用。本文介绍了制备复杂结构支架的方法（通过连续纺丝）、制备更厚支架的方法（通过多层叠加并采用热处理或蒸汽退火）、实现无菌性的方法（无菌制备或制备后灭菌），以及获得适宜生物力学性能的方法。...

组织工程用静电纺丝纤维的后期加工处理

介绍了一种从单一或多种细胞外基质蛋白中获取纳米纤维及复杂纳米结构的方法。该方法利用蛋白质-表面相互作用，制备具有可调组成和结构的自支撑蛋白材料，可用于多种组织工程和生物技术应用。...

利用表面引发组装技术构建的细胞外基质蛋白纳米纤维与纳米结构

报道了一种通过新设计的收集装置，由新型可生物降解聚合物聚（甘油-十二烷酸酯）（PGD）制备电纺长纤维并使其跨越更大沉积区域的合成与制备方法。这些纤维能够支持源自小鼠多能干细胞的细胞生长。...

聚（甘油-十二烷二酸）电纺纤维支架用于小鼠胚胎干细胞构建神经组织

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具有纤维排列梯度的电纺纳米纤维支架

通过静电纺丝或电喷雾技术，将可生物降解聚合物与具有相似组成的低表面能聚合物共混，制备出二维和三维超疏水聚合物材料。...

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用于预防性传播感染的凝集素修饰纤维支架的制备与表征

本实验方案的目的是展示由Janus基底纳米管（JBNTs）和纤连蛋白（FN）组装仿生纳米基质（NM）的方法。当与人源间充质干细胞（hMSCs）共培养时，该纳米基质在促进hMSCs黏附方面表现出优异的生物活性。...

基于Janus基纳米管与纤连蛋白的仿生纳米基质的制备及其用于干细胞黏附

带有塑料膜的组织培养小室是细胞培养实验室中的金标准，可作为可渗透支持物用于构建细胞层和屏障组织模型。在此，我们介绍一种简单的方法，用重组功能化蜘蛛丝蛋白制成的更具生物学相关性的膜替代塑料膜。...

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以下方案介绍了一种基于剪切的挤出方法，用于制备具有纳米级图案化纤维的胶原蛋白水凝胶，该方法可广泛应用于多种组织工程领域。...

用于组织工程的纳米纤维图案化胶原蛋白的制备

学习利用静电纺丝技术合成角蛋白/PCL纳米纤维，用于生物医学工程中的组织工程和伤口愈合应用。该方法成本低、效率高，可支持细胞生长并适用于大规模生产。

基于角蛋白的纳米纤维在生物医学工程中的合成

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