Name: 植物表皮脂质聚酯单体的分离及成分分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学习植物表皮脂质聚酯单体分离与成分分析方法，通过溶剂萃取和甲醇钠催化解聚技术处理叶片样品，结合气相色谱-质谱联用分析单体组成，为研究植物角质层和木栓质生物合成提供可靠技术支撑。

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本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）本科生科研奖学金对 S.J. 的资助，以及 NSERC 发现基金对 I.M. 的资助。我们感谢 Richard Bourgault、Meghan Rains 和 Amanda Fluke 提供的技术支持。att1-1 和 att1-2 突变体种子由中华人民共和国北京市中国科学院遗传与发育生物学研究所 Jian-Min Zhou 博士惠赠。

注意：本方案改编自 Bonaventure 等（2004）、Molina 等（2006）、Li 等（2013）7,10,11。步骤 1-5 总结于图 1中。
1. 组织脱脂
注意：务必冲洗 全部 使用前，用氯仿清洗玻璃器皿和瓶盖，并在通风橱中晾干。
警告：组织匀浆化及所有溶剂转移步骤均应在通风橱中进行；务必穿戴实验服、手套和防溅安全护目镜，以避免与化学品直接接触，并防止样品受到污染。
<ol>
	<li>将水浴锅和加热块预热至 85 °C。</li>
	<li>称取约 0.5 g 每份叶片样品，放入已预称重的 20 mm x 125 mm 带聚四氟乙烯&#160;(PTFE) 衬垫螺旋盖的玻璃试管中。每份样品设四个重复。</li>
	<li>将 2-丙醇加入锥形瓶中（约 125 ml；每克样品 25 ml），并加入 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（即丁基化羟基甲苯，BHT），使其终浓度为 0.01%（w/v）。 
	注意：使用甲醇配制的 5%（w/v）BHT 储存液进行添加（BHT 有助于最小化不饱和脂肪酸的氧化）。</li>
	<li>将 2-丙醇溶液在水浴中预热至 85 °C。</li>
	<li>向每个样品管中加入 12 ml 热的 2-丙醇溶剂，在加热块中 85 °C 加热 15 分钟。此步骤可灭活可能由破裂细胞释放的脂肪酶。</li>
	<li>让试管冷却至室温，用均质器彻底研磨组织，直至&#160;获得均一的悬浮液。</li>
	<li>将样品置于轨道摇床上，在室温下以 100 rpm 振荡 1–2 小时。</li>
	<li>在 800 x g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入等体积的 2-丙醇，在室温下振荡 12 小时。</li>
	<li>在 800 x g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向残渣中加入 12 ml CHCl3:CH3OH（2:1，v/v）（每克样品 25 ml），在室温下以 100 rpm 振荡过夜。</li>
	<li>在 800 x g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向残渣中加入 12 ml CHCl3:CH3OH（1:2，v/v），在室温下以 100 rpm 振荡过夜。</li>
	<li>在 800 x g 条件下离心 10 分钟，移除溶剂。</li>
	<li>将样品在通风橱中室温下干燥过夜。</li>
	<li>将残渣风干后，置于真空干燥器中，以无水 CaCl2 或 CaSO4 作为干燥剂，干燥至恒重（3–5 天）。</li>
</ol>
2. 解聚：甲醇钠催化的甲醇解（图2）
警告：步骤 2.3 – 2.4、2.7 – 2.8、2.10 – 2.11、2.13 – 2.15 以及 2.17 – 2.18 必须在通风橱内操作；务必穿戴实验服、手套和防溅护目镜。
<ol>
	<li>将加热块预热至 60 °C。</li>
	<li>称量含有干燥残留物的试管（此步骤对后续计算至关重要）。</li>
	<li>向每根试管中加入内标物：25 ωL 十七烷酸甲酯（1 mg/ml 储备液）和 25 µl ω-十五内酯（1 mg/ml 储备液）。</li>
	<li>向每根试管中加入 0.9 ml 乙酸甲酯、1.5 ml 甲醇钠和 3.6 ml 甲醇，并盖紧管盖。或者，可预先配制包含这三种试剂的反应混合液，然后向每个样品中加入 6 ml 等分试样。</li>
	<li>在 60 °C 下加热样品 2 小时，并每隔 15 分钟涡旋振荡一次。</li>
	<li>让样品冷却至室温。</li>
	<li>加入 10 ml 二氯甲烷（CH2Cl2）和 1.5 ml 冰醋酸，以萃取脂肪酸甲酯。</li>
	<li>加入盐水溶液（0.5 M NaCl）至试管充满，盖紧管盖。</li>
	<li>涡旋振荡样品 1 分钟，然后在 800 x g 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>将有机相（下层）转移至洁净的中等尺寸试管中（16 x 125 mm 玻璃试管，带聚四氟乙烯&#160;(PTFE) 衬垫螺旋盖）。</li>
	<li>加入盐水溶液（0.5 M NaCl）至试管充满，盖紧管盖。</li>
	<li>涡旋振荡样品 1 分钟，然后在 800 x g 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>移除水相（上层），并重复步骤 2.11–2.12。</li>
	<li>彻底移除所有水相（上层）。</li>
	<li>向溶剂中加入无水硫酸钠（Na2SO4），盖紧管盖，涡旋振荡 1 分钟；样品此时可放置至次日。此步骤后样品可在通风橱中过夜放置。</li>
	<li>在 800 x g 条件下离心 2 分钟，使底部的 Na2SO4 盐沉淀压实。</li>
	<li>将有机相转移至小型一次性玻璃试管中（13 x 100 mm 玻璃试管，带聚四氟乙烯&#160;(PTFE) 衬垫螺旋盖）。</li>
	<li>在氮气流下将溶剂完全蒸发至干燥，随后进行衍生化步骤。若不能立即处理，可将蒸发后的样品在 -20 °C 下保存（样品也可在蒸发步骤之前储存）。</li>
</ol>
3. 气相色谱用衍生物的制备
注意：步骤 3.1.2 和 3.1.5–3.1.8 必须在通风橱内操作；务必穿戴实验服、手套和防溅安全护目镜。
<ol>
	<li>三甲基硅烷衍生物
	<ol>
		<li>将加热块预热至 100 °C。</li>
		<li>向每支试管中加入 100 µl 吡啶和 100 µl BSTFA（N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺），并盖紧管盖。</li>
		<li>在 100 °C 下加热样品 10 分钟。</li>
		<li>让样品冷却至室温。</li>
		<li>在室温下用氮气吹干样品。避免对样品加热，此阶段单体具有高度挥发性。</li>
		<li>加入 500 µl 体积比为 1:1 (v/v) 的正庚烷:甲苯溶液。</li>
		<li>涡旋混合样品 1 分钟，并在 800 × g 条件下离心 2 分钟。</li>
		<li>将样品转移至气相色谱小瓶中，进行气相色谱/质谱（GC/MS）分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>乙酰化衍生物 
	注意：进行乙酰化时，请将上述步骤 3.1.1–3.1.3 修改如下（视频中未展示）；步骤 3.1.4–3.1.8 保持不变：
	<ol>
		<li>将加热块预热至 60 °C。</li>
		<li>向试管中加入 100 µl 吡啶和 100 µl 乙酸酐（Ac2O）。</li>
		<li>在 60 °C 下加热样品 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 气相色谱/质谱分析
<ol>
	<li>使用 HP-5 毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 µm 膜厚）或等效色谱柱（即，5% 二苯基，&#160;95% 二甲基聚硅氧烷）。设置气相色谱仪载气为氦气，流速为 1.5 ml/min，程序升温从 150 °C 升至 300 °C，升温速率为 3 °C/min。</li>
	<li>采用分流进样（分流比 1:10），并将质谱仪设置为全扫描模式（扫描范围 40–600 amu，电子轰击电离）。</li>
	<li>建立一个序列表格，包括溶剂（空白）、野生型和突变体的重复样本，每种样本均使用指定的角质分析方法。</li>
	<li>将溶剂和样品瓶装入自动进样器转盘，必要时向自动进样器的进样针清洗瓶中加入正己烷，然后启动序列。序列运行完成后，所有样品的总离子流色谱图即可获得。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>通过将每个峰的质谱图与已发表的质谱图进行比对，或在有商业谱库时检索商业谱库，鉴定脂质聚酯单体。</li>
	<li>针对总离子流色谱图中每个已鉴定的峰，利用其相应的保留时间，在GC/MS软件生成的积分结果表中查找对应的峰面积（补充图1）。</li>
	<li>对于每种单体（A-B列），将积分表中获得的峰面积值（补充图1，D列）填入单体Excel表格（补充文件2，C-F列）中对应重复样本的相应列。该电子表格用于定量拟南芥TMSi化角质单体。若制备的是乙酰化衍生物，则使用补充文件3。</li>
	<li>将内标（IS）的峰面积填入IS列（H-K列）。对于未发生衍生化的单体，即脂肪酸甲酯（FAMEs）和二羧酸二甲酯（DCA DMEs），使用17:0 FAME（IS1）作为定量内标（单体表中紫色阴影单元格；补充文件2/3）。对于含羟基的单体，包括伯醇、阿魏酸和ω-羟基酸，使用15:0 15-羟基FAME（IS2）作为首选内标进行化合物定量（单体表中绿色阴影单元格；补充文件2/3）。</li>
	<li>将每个重复样本的叶片干重填入AX-BA列（补充文件2）或AQ-AT列（补充文件3）；或者，可扫描叶片以计算表面积，并将表面积数值填入单体表中，以表示单位表面积上的单体含量。</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

与DNA和蛋白质等其他生物大分子不同，植物脂质聚酯并非由模板合成。相反，其组成取决于合成这些胞外聚合物的组织中所存在的酶的特异性。因此，对组成成分进行化学分析对于理解脂质聚酯的组成至关重要。
裂解酯键的化学方法包括皂化、氢解、酸催化酯交换甲基化和碱催化酯交换甲基化2。每种方法均有其优缺点。皂化反应生成游离的脂肪羟基酸，可能进一步发生副反应。使用氢化铝锂（LiAlH4）16进行氢解已用于角质分析7。氢解可将官能团化的碳还原为醇，而原始结构需通过氘化锂铝（LiAlD4）进行氘解反应来推断。该方法的缺点是需要使用高分辨气相色谱-质谱联用技术（GC/MS）比较所得脂肪多元醇的氘代程度，以确定其结构。甲醇中三氟化硼（BF3）催化的酸性酯交换反应常用于角质和木栓质的解聚8,17,18，但该试剂保质期较短，且可能因副反应引入假象产物15。甲醇硫酸也可生成单体的甲基酯，但与其他方法相比，其生成的2-羟基脂肪酸比例更高，这些成分可能并非真正的脂质聚酯组分10。
本方案中所述的甲醇钠（NaOMe）催化酯交换法可生成脂肪酸甲酯，其羟基可通过硅烷化衍生化，从而获得可用于鉴定的特征质谱；或通过乙酰化生成更稳定的羟基衍生物，用于定量分析。该技术的一个缺点是当反应体系中存在水时，水解反应会与酯交换反应同时发生。水会与催化剂甲醇钠（NaOMe）反应生成氢氧化钠（NaOH），后者进一步将脂肪酸甲酯水解为游离酸（图2D）。这是一种不希望发生的副反应，因为每种脂肪酸将出现两个峰：甲酯峰和TMSi酯衍生物峰，从而增加分析的复杂性。因此，使用无水试剂并添加乙酸甲酯作为共溶剂以抑制皂化反应，是防止水解的关键步骤（图2D）。
角质和木栓质含有1%至26%的甘油4。然而，在本实验方案所述的实验条件下，该单体无法被检测到。甘油具有高度亲水性，与脂肪酸甲酯单体不同，会在水相溶剂洗涤步骤中被去除。这一局限性也适用于其他角质解聚方法，但可通过转酯化后获得的水相层，采用酶法测定甘油含量19,20。或者，也可在较温和的条件下（例如，0.05 M NaOMe）进行反应，且不再进行后续水相萃取，以检测包括甘油在内的所有单体。尽管温和条件适用于甘油定量，但通常会导致角质和木栓质的解聚不完全。
如果具备配备火焰离子化检测器（FID）的气相色谱仪（GC），可在气相色谱-质谱联用（GC/MS）确定代表性样品的色谱峰后，使用该仪器对所有重复样品进行定量分析。或者，若已知单体的保留指数，也可通过GC/FID谱图鉴定单体。火焰离子化检测器具有特别高的灵敏度和宽广的线性响应范围，这对于单次运行中同时定量样品中的主要和次要组分至关重要。此外，该检测器结构坚固，易于维护和操作15。
本方案可实现植物脂质聚酯单体的可靠且可重复的分离、鉴定和定量，从而对一种或多种脂质聚酯单体组成存在差异的突变体进行化学表征。该方法具有可扩展性，可轻松适应处理少量或大量各类植物材料，包括根、种子、叶片、茎和花。许多物种的脂质聚酯单体质谱数据已有发表例如.,21-26，这些数据为将本方案应用于其他组织和/或物种时鉴定未知单体提供了宝贵的资源。本方法适用于高等植物中脂质聚酯的生物合成、调控及分布研究。

维管植物依赖于细胞外层结构，这些结构在植物组织与外部环境之间起到防水屏障的作用。这些亲脂性的细胞壁相关结构可限制病原体侵染，并调控气体、水分及溶解物质进出植物组织的被动运输1。此类屏障包括植物角质层——一种植物特有的共有衍征结构2——以及多种含栓质的扩散屏障。角质层是由表皮细胞合成并透过细胞壁外侧的果胶层与之相连的亲油性结构3-5。它包裹着高等植物的初生地上器官，作为植物组织与环境之间的重要界面发挥功能。
角质是角质层的结构基质，而角质和木栓质均为与可溶剂提取的蜡质相关的不溶性甘油酯聚酯2,4。这些聚合脂质由饱和与不饱和脂肪酸衍生物组成，在结构和功能上均具有相似性。然而，它们在化学组成和沉积位点上具有特征性差异，因而可以区分。
栓皮是一种脂族聚酯，位于某些外部和内部组织的细胞壁内，形成次生壁。栓皮化组织包括根、块茎和树皮的周皮、根的内皮层、种皮层以及愈合的伤口2。与角质不同，栓皮聚酯通常含有醇类、饱和及单不饱和二羧酸，以及大量超长链单体（碳链长度≥20个碳原子）。
角质是维管植物中最丰富的脂质聚酯6，由甘油和C16-C18酯化脂肪酸衍生物（如羟基和羟基-环氧取代的脂肪酸）组成4。尽管不同维管植物物种中角质聚合物的组成存在差异，但最主要的单体成分是10,16-二羟基16:0、18-羟基-9,10-环氧&#160;18:0以及9,10,18-三羟基18:0脂肪酸。有趣的是，拟南芥叶片和茎部的角质主要由18:2二羧酸构成7,8。
植物角质层的厚度也表现出显著的变异性，范围从几纳米到数微米不等9。由于角质层分离是一个费力且耗时的步骤，特别是对于拟南芥（Arabidopsis thaliana）等叶片角质层极薄的植物尤为困难8，因此已开发并验证了无需进行角质层分离的方法7,8。本文中，我们描述了一种详细的实验方案，通过甲醇钠（NaOMe）催化的解聚反应，结合后续的气相色谱/质谱（GC/MS）分析，研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片中角质（cutin）的单体组成。该方案为检测完整去脂组织中植物脂质聚酯的组成提供了一种可靠的方法，并基于先前报道的方案进行了优化和改进7,10,11。首先将完整组织样品均质化并彻底去脂，以去除可溶性提取脂质，包括角质层和表皮蜡质、膜脂以及三酰甘油。随后，富集细胞壁的残渣在甲醇钠催化下发生甲醇解反应，分解为其相应的甲基酯单体。经酸化后提取脂肪酸甲酯，并进一步衍生化为相应的三甲基硅烷或乙酰化衍生物。衍生化产物具有高挥发性，可在适当的温度下从气相色谱柱中洗脱，且在GC/MS分析过程中不会改变其结构构象。

<table><tbody><tr><td>化学试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPA451-4</td><td>脱脂溶剂</td></tr><tr><td>无水硫酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102</td><td>衍生化试剂</td></tr><tr><td>BSTFA（N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15222</td><td>衍生化试剂</td></tr><tr><td>丁基化羟基甲苯（BHT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101162</td><td>抗氧化剂</td></tr><tr><td>无水氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td>干燥剂</td></tr><tr><td>无水硫酸钙（DRIERITE-8目含指示剂）</td><td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>干燥剂</td></tr><tr><td>氯仿（三氯甲烷）</td><td>Fisher Scientific</td><td>C6074</td><td>有机溶剂</td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401212</td><td>酸化试剂</td></tr><tr><td>压缩氦气载气</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>气相色谱/质谱载气</td></tr><tr><td>庚烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>有机溶剂</td></tr><tr><td>己烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3024</td><td>有机溶剂</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td>有机溶剂，转甲基化反应试剂</td></tr><tr><td>乙酸甲酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296996</td><td>有机溶剂</td></tr><tr><td>十七烷酸甲酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4515</td><td>内标物（1 mg/mL 储备液）</td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>D374</td><td>有机溶剂</td></tr><tr><td>压缩氮气</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>气相色谱-火焰离子化检测器载气</td></tr><tr><td>十五内酯</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>内标物（1 mg/mL 储备液）</td></tr><tr><td>吡啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>衍生化共溶剂</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358212</td><td>盐溶液</td></tr><tr><td>甲醇钠（25 wt.%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156256</td><td>亲核试剂</td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Fisher Scientific</td><td>T2904</td><td>有机溶剂</td></tr><tr><td>植物生长用品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Horticulture Ltd</td><td></td><td>推荐使用Pro-Mix PGX培养拟南芥植株（Eddy, R. 和 Hahn, D.T., 2012, http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2）&lt;br/&gt; 普渡大学拟南芥培养方法。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PermaNest 湿度罩&amp;nbsp;</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Nest 植物托盘（22x11英寸）</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>方形温室花盆，3.5英寸&amp;nbsp;</td><td>Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>通用型植物肥料，Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>玻璃器皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm 带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的玻璃试管</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>16 x 125 mm 带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的玻璃试管</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>20 x 125 mm 带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的玻璃试管</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>气相色谱小瓶盖</td><td>National Scientific</td><td>C400051A</td><td></td></tr><tr><td>气相色谱小瓶内插管</td><td>National Scientific</td><td>C4011631</td><td></td></tr><tr><td>气相色谱小瓶</td><td>National Scientific</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>一次性巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>烧瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>仪器设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly dancer</td><td></td><td></td><td>若无Belly Dancer，可用摇床代替</td></tr><tr><td>DB-5 毛细管气相色谱柱</td><td>J&amp;W Scientific, CA, USA;&amp;nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0.25 mm x 0.25 &amp;mu;m 膜厚</td></tr><tr><td>干燥器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT 单四极杆质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氮气吹干仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron 匀浆器</td><td>Birkmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 气相色谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>两级减压阀</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

植物角质层脂质聚酯单体的分离与组成分析

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

陆生植物会产生细胞外的脂肪族生物聚酯，从而修饰特定组织的细胞壁。表皮细胞合成角质，这是一种由甘油和修饰脂肪酸组成的聚酯，构成了覆盖植物地上部分表面的角质层的骨架结构。栓质是一种相关的脂质聚酯，沉积在某些组织的细胞壁上，包括根的内皮层以及块茎、树皮和根的周皮。这些脂质聚合物在不同植物物种间的组成具有高度变异性，且在同一物种的不同组织间也常有差异。本文中，我们描述了一种详细的方法，通过甲醇钠（NaOMe）催化的解聚反应、衍生化处理，随后进行气相色谱-质谱联用（GC/MS）分析，以研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片中角质的单体组成。该方法可用于分析从去脂后的完整植物组织中分离出的不溶性聚酯（含角质或栓质）的单体成分。此方法不仅可用于表征此前未分析过的物种中脂质聚合物的组成，还可作为正向和反向遗传学研究中的分析工具，用于评估候选基因的功能。

本论文所述方案旨在测定脂质聚酯单体（即，角质或木栓质），并尽量减少非角质脂质的干扰10。图1展示了该检测方法的总体流程，整个过程耗时约8至10天（从组织初始采集到获得气相色谱数据），具体时长取决于样品干燥所需时间。
用于解聚聚酯的选定碱催化甲醇解方法（图2）此前已在拟南芥种子中得到验证，该种子同时含有角质和木栓质。组织首先被均质化并彻底脱脂，以去除可溶剂提取的脂质。提取后残渣的产率以初始鲜重的百分比表示，通常A. thaliana Col-0叶片为6%。细胞壁富集残渣在真空干燥器中干燥后，通过碱催化转甲酯化反应解聚为其组成的甲酯单体。选择2小时的孵育时间为实现聚酯脂质组分充分解聚和有效回收的关键时间。更长的孵育时间会导致2-羟基酸增加；这些可能来源于膜鞘脂10。
拟南芥野生型叶片角质层的典型色谱图如图3所示，包括O-三甲基硅醚衍生物（图3A）和O-乙酰化衍生物（图3B）。每个峰通过与文献7,8及公共数据库12中的质谱数据比对进行鉴定。本视频方案展示了如何制备三甲基硅醚（TMSi）衍生物，但也可选择将样品乙酰化以衍生化羟基。硅烷化衍生物适用于鉴定，因其可产生具有诊断意义的质谱图；然而，乙酰化衍生物更稳定，在单体鉴定完成后可作为硅烷化的良好替代方法10。为便于仅配备气相色谱-火焰离子化检测器（GC/FID）的实验室实施本方案，还提供了对应于野生型（WT）叶片角质层单体乙酰化衍生物以及一系列脂肪酸甲酯标准品的同系物的GC/FID色谱图（补充图4）。
该方法为定性方法，可检测样本间的定量差异，因此适用于突变体分析。通过内标定量法确定各单体的含量，从而实现样本间单体丰度的比较。但需明确指出，色谱峰大小（总离子计数）可能无法准确反映聚酯中单体的摩尔比例。我们提供了可编辑的单体含量计算表格，用于计算拟南芥叶片角质中以脂肪酸甲酯及TMSi衍生物形式存在的单体含量（补充文件1），或以乙酰化衍生物形式存在的醇类单体含量（补充文件2）。若样品来源于不同器官或植物物种，这些表格可能需要相应调整。
以拟南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia（Col-0）野生型叶片为例，我们分析了两种已表征的CYP86A2/ATT1基因功能缺失突变等位基因att1-1（m-1）和att1-2（m-2）13,14。CYP86A亚家族的细胞色素P450单加氧酶编码推测的ω-氧化酶，参与栓质和角质单体的生物合成。我们的结果（图4）表明，与野生型叶片相比，突变体叶片中三种主要脂质单体的含量显著降低。与该酶预测的功能一致，att1突变体中16:0、18:2和18:1二羧酸盐受到特异性影响。
<img alt="使用气相色谱/质谱法进行脂质提取过程；包括孵育、溶剂去除、分析设置等步骤。" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 脂质聚酯分析概览。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示化学结构的亲核酰基取代反应示意图，阐明关键反应机理。" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. NaOMe 催化的酯交换甲基化反应机理。 亲核性的甲氧基负离子进攻脂质聚酯的羰基碳，形成一个不稳定的四面体中间体 (A)，该中间体迅速解离生成脂肪酸甲酯和烷氧基负离子 (B)。这些烷氧基是共轭碱，可与甲醇反应，重新生成具有催化活性的甲氧基负离子，从而持续促进进一步的解聚反应 (C)。若体系中存在水，其将与甲醇钠反应生成氢氧化钠——一种强碱，可不可逆地将酯水解为不期望的游离脂肪酸。添加乙酸甲酯作为共溶剂15，以清除体系中微量的氢氧化钠 (D)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脂肪酸分析的气相色谱；色谱图结果；保留时间与离子流强度。" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片角质层单体的代表性总离子色谱图。 (A) O-三甲基硅烷（TMSi）醚衍生物和(B) 乙酸羟基衍生物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="野生型和突变体中脂肪酸、二羧酸、羟基脂肪酸单体含量的柱状图。" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型及CYP86A2基因两个无效突变等位基因（突变体-1=att1-1；突变体-2=att1-2）的角质单体组成。 误差条表示平均值的标准差（n = 4）。改编自13，经© Blackwell Publishing（2007）许可。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="色谱数据处理示意图；拟南芥样品分析；色谱图；峰结果。" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
补充图1. 来自GC/MS软件的峰积分结果表。 对应于已鉴定单体和内标物的峰通过其保留时间（C列）进行识别，峰面积值列于D列中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
<img alt="色谱结果表；拟南芥角质层衍生物的数据分析，峰面积比较。" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
补充文件 2。 拟南芥角质单体（羟基脂肪酸甲酯的三甲基硅醚衍生物）表格。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
<img alt="拟南芥叶片角质层-乙酰化衍生物表，峰面积数据，质谱值；化学分析。" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
补充文件3。 拟南芥角质单体（羟基脂肪酸甲酯的O-乙酰化衍生物）数据表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
<img alt="Chromatography graph showing fatty acid methyl esters analysis with time and detector response." src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
补充图4。 GC/FID 色谱图 （A-B） 脂肪酸甲酯（FAME）保留指数标准（色谱峰标注为各饱和FAME碳链长度）；以及 （C） 乙酰化的 A. thaliana 野生型叶片角质层单体。色谱峰上的数字对应：16:0 脂肪酸甲酯（1）、阿魏酸（2）、18:3 脂肪酸甲酯（3）、18:1/18:2 脂肪酸甲酯（4）、18:0 脂肪酸甲酯（5）、芥子酸（6）、16:0 二羧酸二甲酯（7）、16-羟基-16:0 脂肪酸甲酯（8）、18:2 二羧酸二甲酯（9）、18:1 二羧酸二甲酯（10）、18:0 二羧酸二甲酯（11）、18-羟基-18:2 脂肪酸甲酯（12）、18-羟基-18:1 脂肪酸甲酯（13）、20:0 脂肪酸甲酯（14）、10,16-二羟基-16:0 脂肪酸甲酯（15）、24:0 脂肪酸甲酯（16）。DCA：二羧酸二甲酯；FAME：脂肪酸甲酯；IS1：内标1，17:0 脂肪酸甲酯；IS2：内标2，15-羟基-15:0 脂肪酸甲酯。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

脂质聚酯构成两种细胞壁修饰结构的组分，即植物角质层和含栓质的扩散屏障。在本视频中，我们描述了一种从完全去脂叶片中解聚角质的方法。该方法可用于研究在角质或栓质生物合成过程中存在缺陷的突变体。

陆生植物会产生细胞外脂肪族生物聚酯，以修饰特定组织的细胞壁。表皮细胞合成一种聚酯——角质……

维管植物依赖于细胞外层，这些外层在植物组织与外部环境之间起到防水屏障的作用。这些亲脂性的细胞及其相关结构可限制病原体侵染，并调控气体、水分及溶解物质在植物组织内外的被动运输。其中一种重要的屏障是植物角质层，这是一种植物特有的复杂结构。角质素是一种不溶性的甘油酯类聚酯，构成角质层的结构基质，并与可溶剂提取的蜡质相关联。本文介绍一种可靠的分析方法，用于测定脂类聚酯的组成并保留去脂的植物组织。在本实验方案中，采集完整的组织样品，经匀浆处理后，通过一系列溶剂萃取彻底去除可溶于溶剂的脂类，包括角质层蜡和表皮蜡。膜脂中的甘油三酯。随后，样品在甲醇钠催化的甲醇解作用下解聚为其组成的脂质单体。加入模拟试剂，将羟基转化为适合气相色谱分析的相应三甲基硅烷衍生物。随后将衍生化残余物转移至气相色谱小瓶中，并装入气相色谱-质谱联用仪（A-G-C-M-S）进行分析，生成色谱图，以表征生物聚酯的单体组成。这些成分存在于提取的样品中。本文中，我们采集了野生型及两种突变体成熟拟南芥 ANA 植物的完整叶片样品。用于提取和分析，将 0.5 克组织加入已用氯仿预冲洗过的洁净玻璃试管中。在烧瓶中加入 100 毫升异丙醇，并加入丁基化羟基甲苯至 0.01% 浓度。BHT 是一种抗氧化剂，用于在溶剂提取过程中保护双键和脂肪酸免受氧化。将溶剂在水浴中预热至约 85 摄氏度。每克植物组织加入 25 毫升加热的异丙醇，将样品置于 85 摄氏度的加热金属浴中孵育 15 分钟。让离心管冷却至室温，并佩戴耳部和眼部防护装备。最后，使用匀浆器研磨样品以获得均匀分散，用螺旋盖密封离心管，并在 100 转/分钟的条件下振荡 1 至 2 分钟，然后在 800 ×g 条件下离心 10 分钟。为了将有机相与沉淀中密度较高的物质分离，使用巴斯德吸管或移液器移除并弃去上清液，注意避免扰动沉淀。加入等体积的室温异丙醇，并将样品在室温下震荡过夜。在 100 RPM 条件下离心样品，并弃去上清液。加入每克组织 25 毫升的氯仿-甲醇 2:1 溶液，振荡过夜，离心并弃去有机相。然后使用氯仿-甲醇 1:2 溶液重复此步骤。将沉淀物在室温下干燥过夜，然后将离心管从通风橱转移至含有无水硫酸钙的真空干燥器中，使样品脱水至少三天，或直至达到恒定质量。样品充分干燥后，即可进行甲醇钠催化的甲醇解去糖基化反应。使用玻璃注射器向含有干燥组织的离心管中加入两种内标溶液：首先加入25 µL的甲基HETO癸酸酯，再加入25 µL的ω-戊内酯。为启动深度聚合反应，向样品中加入 0.9 毫升乙酸甲酯，随后加入 1.5 毫升甲醇钠催化剂和 3.6 毫升甲醇。在反应体系中，将样品于 60 度孵育两小时，并周期性涡旋振荡。脂质聚酯与亲核性甲氧基负离子反应，形成不稳定的四面体中间体，该中间体迅速解离为脂肪酸甲酯和甲氧基负离子。这些甲氧基负离子为共轭碱，可与甲醇反应，重新生成具有催化活性的甲氧基负离子，从而持续推动进一步的深度聚合反应。如果系统中存在水，它将与甲醇钠反应生成氢氧化钠。氢氧化钠是一种强碱，可不可逆地将聚酯转化为不期望的游离脂肪酸。为防止水解，向系统中加入乙酸甲酯以去除其中存在的任何氢氧化钠。让离心管冷却至室温。孵育结束后，向每根离心管中加入10毫升二氯甲烷以萃取单体。然后加入1.5毫升冰醋酸以酸化样品。用 0.5 摩尔氯化钠溶液填充试管，充分涡旋混匀，并离心数分钟。在通风橱内操作。用移液器小心将下层有机相转移至洁净的、预先用溶剂润洗过的中等尺寸试管中。用生理盐水再次洗涤样品，涡旋混匀后离心10分钟。弃去上层水相，然后向样品中加入无水硫酸钠作为干燥剂，以去除溶液中残留的微量水分，涡旋混匀样品后离心，将溶剂转移至洁净且预先用溶剂润洗过的小型离心管中，将离心管放入氮吹仪中蒸发溶剂，得到单体的干燥残留物。使用玻璃注射器加入100 µL的嘌呤和100 µL的B-S-T-F-A，将羟基转化为易挥发的三甲基硅烷衍生物。将样品在100摄氏度下孵育10分钟。让离心管冷却并在氮气下蒸发。加入500微升体积比为1:1的正庚烷-甲苯溶液以溶解残留物，然后短暂离心。将衍生化样品转移至含有400 µL内插管的气相色谱小瓶中。将装有样品的小瓶载入气相色谱仪，仪器将样品注入毛细管柱进行分析，洗脱物随后由四极杆质谱检测器检测。通过GCMS分析获得的原始数据经过处理后，以每份样品的色谱图形式呈现。通过各自特定的质谱图鉴定对应于不同色谱峰的单体。利用内标定量法，根据气相色谱保留时间确定各单体的含量，从而实现样品间单体丰度与组成的比较。图中显示的是从兔脓肿叶片组织中释放的单体的代表性分析重叠色谱图，该组织对应于编码P450单加氧酶的基因的野生型及两种突变等位基因，表现出不同的单体谱型。我们的结果表明，三种主要的角质、单体以及野生型和突变型拟南芥植物的丰度存在显著差异。本方案是一种通过分离、鉴定和定量其组成单体来分析植物脂质聚酯成分的可靠方法。该方法具有可扩展性，可轻松适应大量不同植物材料的处理，包括根、种子、叶片及其他完整组织。该技术适用于研究高等植物中角质和木栓质的生物合成调控及其分布。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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革兰氏阴性菌脂质A的分离与化学表征

细菌细胞壁由肽聚糖构成，肽聚糖是一种由肽交联的糖链组成的高分子网络结构。超高效液相色谱法（UPLC）可实现对肽聚糖组分的高分辨率和高通量分析，有助于新发现。本文介绍了一种分离细胞壁（囊状体）并将其制备用于UPLC分析的实验方法。...

通过超高效液相色谱进行组分分析的细菌细胞壁分离与制备

本文介绍了一种从多种生物质来源中进行木质素乙醇提取的实验方案。展示了提取条件对木质素得率及β-O-4含量的影响。对所获得的木质素进行了选择性解聚，以制备高收率的芳香族单体产物。...

通过温和乙醇萃取提取高β-O-4含量的木质素及其对解聚产率的影响

在爬行动物中，来自同种个体的皮肤脂质对性信号传递至关重要，并可能用于入侵物种的管理。本文描述了从蜕皮或完整个体中提取皮肤脂质、测定与分析总脂质质量，以及通过组分分离对脂质进行分离的实验方案。 通过...

化学分离、定量与爬行动物皮肤脂质的分离

本文介绍了一种快速高效分离多种光合生物相关质体小球脂滴的实验方案。成功制备分离的质体小球是开展蛋白质组学和脂质组学等深入分子研究之前至关重要的第一步。...

从植物叶片组织和蓝细菌中分离质体小球脂滴

学习植物表皮脂质聚酯单体分离与成分分析方法，通过溶剂萃取和甲醇钠催化解聚技术处理叶片样品，结合气相色谱-质谱联用分析单体组成，为研究植物角质层和木栓质生物合成提供可靠技术支撑。

植物角质层脂质聚酯单体的分离与组成分析

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