Name: 从大鼠睾丸支持细胞的分离和管周细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 了解从大鼠睾丸中分离高纯度原代Sertoli细胞和管周细胞的方法。该技术有助于研究男性生殖免疫学及Sertoli细胞在精子发生中的关键功能，为男性不育诊断提供重要依据。

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作者感谢来自鲁汶的 Guido Verhoeven 和 Ludo Deboel，他们在吉森 Meinhardt 实验室建立初级支持细胞分离技术的过程中提供了极大的帮助。感谢吉森的 Monika Fijak 在图 1A 的制作方面提供的协助与建议。本研究得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）项目 BH 93/1-1（S.B.）以及吉森大学（德国）与莫纳什大学（澳大利亚墨尔本）联合国际研究型研究生院 GRK 1871（S.B.）的资金支持。此外，还获得了黑森州政府在相关项目中的资助 &#34;科学经济卓越发展先锋计划&#34; （LOEWE）称为 &#34;感染所致的男性不育 &amp;炎症&#34; （MIBIE）

1. 动物伦理声明
此处描述的实验均按照德国吉森地方政府当局——吉森行政区政府（Regierungspräsidium Giessen）的指导原则进行，并符合德国实验动物饲养与使用的操作规范（许可编号：GI 20/23 Nr. A 31/2012）。
2. 培养基、酶溶液和动物的准备
<ol>
	<li>通过将1 g碘溶解于100 ml乙醇中，制备1%碘酒精溶液。</li>
	<li>制备2份500 ml不含Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS），每份分别添加7.5 ml D-葡萄糖（100 g/L）和5 ml 100倍浓缩的青霉素/链霉素储备液（终浓度为15 mg/ml D-葡萄糖、50 U/ml青霉素和50 µg/ml链霉素）。</li>
	<li>向1份500 ml Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基中加入5 ml 100倍浓缩的青霉素/链霉素储备液（终浓度为50 U/ml青霉素和50 µg/ml链霉素）。</li>
	<li>通过将25 mg胰蛋白酶和0.1 ml DNase I（1 mg/ml DNase I）加入9.9 ml PBS中，配制胰蛋白酶-DNase I溶液（终浓度为2.5 mg/ml胰蛋白酶和10 µg/ml DNase I）。</li>
	<li>将50 mg胰蛋白酶抑制剂溶解于5 ml PBS中，制备胰蛋白酶抑制剂A溶液（10 mg/ml）；将25 mg胰蛋白酶抑制剂溶解于10 ml PBS中，制备胰蛋白酶抑制剂B溶液（2.5 mg/ml）。</li>
	<li>配制胶原酶-透明质酸酶-脱氧核糖核酸酶I（DNase I）溶液：将10 mg胶原酶A（终浓度1 mg/ml）、10 mg透明质酸酶（终浓度1 mg/ml）和0.1 ml DNase I（1 mg/ml DNase I）（终浓度10 µg/ml）溶解于10 ml PBS中。</li>
	<li>通过将10 mg透明质酸酶（终浓度1 mg/ml）和0.1 ml DNase I溶液（1 mg/ml）（终浓度10 µg/ml）加入9.9 ml PBS中，配制透明质酸酶-DNase I溶液。</li>
	<li>应提前订购Wistar大鼠，确保其在Sertoli细胞分离当天为19日龄。 
	注意：本方案适用于10只大鼠，但可调整为最少5只、最多20只。所有溶液的体积需相应调整。</li>
	<li>通过将0.35 g Oil Red O溶解于100 ml异丙醇中，制备Oil Red O储备液。搅拌过夜，经0.2 µm滤膜过滤后，室温保存，可使用长达一年。</li>
	<li>通过将6 ml Oil Red O储备液与4 ml水按3:2比例混合，制备Oil Red O染色液。静置10–20分钟后经0.2 µm滤膜过滤，于2小时内使用。</li>
	<li>在通风橱中，将4 g多聚甲醛粉末（PFA）加入80 ml 1×PBS中，轻轻搅拌，加热至约60 °C，加入1 ml 1 M NaOH，持续搅拌直至多聚甲醛完全溶解。冷却至室温后，用1 M HCl调节pH至7.4，并用1×PBS定容至100 ml。经0.45 µm滤膜过滤后，新鲜使用或分装后于−20 °C保存数月。 
	注意：多聚甲醛（PFA）在水中解聚为单体甲醛，该过程由适度加热和弱碱性pH催化。所有酶溶液均需当天新鲜配制，并在使用当天经0.2 µm滤膜过滤除菌。若使用不同厂家的酶（见材料/设备表），请仔细调整其浓度或活性。 
	在以下实验步骤中，&#34;移液管&#34;指血清移液管。</li>
</ol>
3. 生精小管的制备
<ol>
	<li>依次将10只雄性Wistar大鼠置于干燥器中，使用CO2麻醉，气流速度至少每分钟置换容器体积的20%。等待呼吸停止后，通过捏压足垫测试麻醉深度，若无反应，则通过颈椎脱位法对每只大鼠实施安乐死。在流动水下切断颈静脉和颈动脉（vagina carotica）以放尽血液，并用70%乙醇擦拭腹部进行消毒。</li>
	<li>用镊子将腹部皮肤与肌肉分离，剪取一块从耻骨联合延伸至胸骨的椭圆形皮肤瓣 (图2A)，并将其向上翻折至胸部。接着，夹住腹肌，从耻骨联合至胸骨做正中切口。
	<ol>
		<li>用拇指从骨盆向上挤压腹部，使睾丸从下骨盆推出。用镊子夹住附睾脂肪垫 (图2B)，进一步拉出睾丸。剪断精索 (图2B)，保留白膜完整，并将所有睾丸收集于盛有20 ml PBS的50 ml锥形管中 (图2C)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集完所有睾丸后，加入等体积（20 ml）1% (w/v) 碘的乙醇溶液进行消毒。轻轻倒置管子两次，立即倾去上清液。随后迅速用各25 ml PBS洗涤睾丸两次 (图2D)。</li>
	<li>将睾丸转移至含有15 ml PBS的培养皿中 (图2E)。用镊子牢固夹住每个睾丸的一端，在另一端的白膜上做一小切口，使用闭合的剪刀刀片作为刮取工具，挤出曲细精管。 
	注意：曲细精管应仍保持紧凑的睾丸状团块，仅有少量管状结构伸入溶液中，以确保酶消化的均匀性 (图2F)。</li>
	<li>将去被膜的睾丸转移至含有10 ml胰蛋白酶-DNase I溶液的100 ml螺口瓶中。在32 °C振荡水浴中进行消化（120次/分钟）。消化4分钟后，肉眼观察曲细精管是否开始分散。一旦曲细精管开始分散进入溶液，立即停止消化。如有必要，可继续孵育最多2分钟。</li>
	<li>加入5 ml胰蛋白酶抑制剂溶液A以终止胰蛋白酶消化。使用10 ml移液器上下吹打3–4次充分混匀溶液，并将其转移至50 ml锥形管中。</li>
	<li>孵育5分钟后，观察曲细精管在重力作用下沉降，小心使用步骤3.6中的10 ml移液器吸除上清液，加入10 ml胰蛋白酶抑制剂B溶液以彻底终止胰蛋白酶消化。通过上下吹打2–3次重新悬浮曲细精管。</li>
	<li>为去除污染的间质细胞，用各25 ml PBS对曲细精管进行9次洗涤。每次洗涤均使用25 ml移液器重悬曲细精管，并让其在重力作用下静置沉降10分钟。始终使用同一支25 ml移液器进行PBS加样、重悬及上清液移除操作。</li>
</ol>
4. 曲细精管周围细胞（PTCs）的去除/分离
<ol>
	<li>将所有小管转移至一个100 ml螺口瓶中，并加入胶原酶-透明质酸酶-DNase I溶液 （图3A）在32 °C（120次/分钟振荡）的摇床水浴中消化10分钟。</li>
	<li>在玻璃载玻片上滴加一滴悬液，立即在倒置光学显微镜下以100倍放大倍数检查细胞培养用的管状结构。若消化程度不足，继续孵育额外2分钟（显微镜检查所需时间不计入孵育时间）。 
	注意：此步骤中所有小管长度均会缩短，且小管边缘应变得粗糙 （图3B） 和 C)粗糙的边缘提示周围管状细胞的释放。</li>
	<li>将消化后的肾小管悬液用3.8步骤中的25 ml移液管转移至一个50 ml锥形管中。用10 ml PBS清洗100 ml瓶子，并将洗液加入锥形管中的肾小管悬液中。静置10分钟，使消化后的肾小管在重力作用下自然沉降，然后再次使用25 ml移液管小心吸出含有近端小管细胞（PTCs）的上清液，转移至新的锥形管中。当吸出最后几毫升液体时，使用5 ml移液管，以防止肾小管的残留转移。</li>
	<li>加入20 ml RPMI 1640培养基（含10%热灭活胎牛血清，FBS）至收集的肾小管上清液中，混匀后在室温下以300 × g离心10分钟，离心时不得使用刹车。</li>
	<li>小心倾去上清液，将沉淀的 PTCs 重悬于 20 ml 添加了 10% 热灭活 FBS 的 RPMI 1640 培养基中，并将 4 ml 悬液分别接种至五只 T75 培养瓶中，每瓶预先加入 16 ml 培养基。于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养2 大气 （图4A）.</li>
	<li>第3天rd 培养第几天时，用胰酶消化PTCs，并以1:2比例传代至含16 ml RPMI 1640培养基（每瓶添加10%热灭活FBS）的T75培养瓶中（共得到10个培养瓶） （图4B）继续在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 大气</li>
	<li>第5天th 培养第6天再次用胰酶消化PTCs，并根据实验需要将其接种至6孔板或24孔板（每块板来自一个T75培养瓶）。实验可在第6天进行。</li>
</ol>
5. 支持细胞（SCs）的分离
<ol>
	<li>用25 ml移液管将第4.3步中沉淀的曲细精管充分重悬于25 ml PBS中，静置12分钟使其依靠重力自然沉降。使用同一支25 ml移液管进行PBS的吸取、曲细精管的重悬以及上清液的去除。重复洗涤3次（共洗涤4次）。</li>
	<li>最后一次洗涤后，将消化后的曲细精管转移至另一个含有透明质酸酶-DNase I溶液的100 ml螺口瓶中。在32 °C的摇水浴中进行消化（120次/分钟振荡）。</li>
	<li>5分钟后，按照第4.2步所述方法，在100倍光学显微镜下再次检查曲细精管。 
	注意：应可见短小的曲细精管、管状聚集体及释放的细胞 （图3D）。
	<ol>
		<li>让管状聚集体静置10分钟，用25 ml移液管吸除上清液。使用25 ml PBS洗涤聚集体4次，每次洗涤沉降时间为10分钟 （图3E）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入20 ml RPMI 1640培养基，将悬液用安装在20 ml注射器上的18 G针头反复吹打10次。避免产生气泡。 
	注意：将悬液通过针头吸入和推出各一次计为一次吹打。通过流体剪切力破坏和均质化细胞是制备易聚集细胞的标准技术。细胞通过内径较小的皮下注射针头通常不会影响其功能特性25。 图5C 和 D 显示了培养第4天纯化支持细胞的正常超微结构。
	<ol>
		<li>取一滴悬液滴加于载玻片上，使用倒置光学显微镜在10倍放大下快速检查细胞，确认聚集体是否已完全分散 （图3F）。将细胞悬液通过70 µm细胞筛过滤，以获得滤液中的纯单细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将第5.4步的滤液在室温下以200 × g离心10分钟，不使用刹车。用25 ml移液管小心吸除上清液，并将支持细胞重悬于40 ml无血清RPMI 1640培养基中。</li>
	<li>取100 µl细胞悬液与100 µl台盼蓝染液混合，使用改进型Neubauer计数板进行细胞计数。根据计数结果将细胞浓度调整至3 × 106 个细胞/ml。每孔接种1 ml至6孔板（=第1天）。若计划进行油红O染色（第6步），则在接种支持细胞前，先将盖玻片放入一个或多个孔中。 
	注意：悬液中的支持细胞沉降迅速，因此每次用移液管取样前应短暂振荡管子。至第4天，细胞已牢固贴附于基质表面。</li>
	<li>为去除第4天时漂浮或贴壁的生精细胞 （图4C），用PBS洗涤用于接种分离支持细胞的6孔板各孔（第5.6步）（图4D）。吸除培养基，每孔加入1–2 ml PBS，在桌面上水平剧烈振荡6孔板但避免液体溢出。重复洗涤3次，并在第5天和第6天执行相同的洗涤程序 （图4E）。 
	注意：第4天时，支持细胞已牢固贴壁，在倒置光学显微镜下呈现铺路石样形态 （图4C）。实验可从第7天开始进行。
	<ol>
		<li>（第5.7步的替代方法）在6孔板接种后第3天，通过低渗休克法去除漂浮和贴壁的生精细胞。吸除培养基，每孔加入1 ml直接从冰箱取出的20 mM Tris（pH 7.5）。90至120秒后（不得延迟）吸除Tris缓冲液。用PBS洗涤细胞两次，每孔加入2 ml无血清RPMI 1640培养基。可选择在次日进行后续实验。 
		注意：低渗休克时间越长，去除的生精细胞越多，但支持细胞的损失也越多。第一次PBS洗涤应迅速但小心，避免移位支持细胞。低渗处理后，可在相差显微镜下观察到细胞质中出现大量大小不一的空泡。这些空泡在低渗处理后数小时内逐渐消失。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 油红O染色
<ol>
	<li>所有步骤均在室温下进行。第7天，用PBS洗涤在盖玻片上培养的Sertoli细胞（步骤5.6）两次，并用PBS中的10%福尔马林固定。10分钟后，更换新鲜的福尔马林溶液，继续固定60分钟。 
	注意：所有溶液均加入含盖玻片的孔中，在下一步操作前吸除。</li>
	<li>吸除福尔马林，用蒸馏水洗涤细胞两次，加入60%异丙醇。5分钟后，让细胞在空气中干燥数分钟。</li>
	<li>每孔加入1 ml油红O染色液，孵育10分钟。吸除染色液后，立即用蒸馏水洗涤细胞4次，将盖玻片封片于甘油-PBS（9:1）中。使用常规光学显微镜拍摄明场图像 (图4F)。</li>
</ol>
7. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>用 PBS 将盖玻片上培养的 PTC（来自步骤 4.5）或支持细胞（来自步骤 5.5）洗涤两次，室温下用 4% 多聚甲醛固定 10 分钟。</li>
	<li>在室温下用含5% BSA的PBS溶液孵育1小时。弃去BSA-PBS溶液，加入含有肌动蛋白（平滑肌）（用于PTCs）或波形蛋白（用于支持细胞）一抗（两种抗体稀释比例均为1:100）的新鲜BSA-PBS溶液，4 °C过夜孵育。 
	注意：用 BSA 孵育可阻断一抗的非特异性结合。</li>
	<li>盖玻片洗涤 3 次，每次&#160; 在 PBS-0.1% Tween 20 中洗涤 5 分钟，然后在避光条件下于室温用绿色荧光染料标记的山羊抗小鼠二抗（稀释比例 1:1,000）孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBS-0.1% Tween 20 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟，然后将其封片于 DAPI 封片剂中。</li>
</ol>
8. 超微结构分析
<ol>
	<li>用 PBS 清洗在 6 cm 细胞培养皿上培养的 Sertoli 细胞（来自步骤 5.6），然后根据 Ito 和 Karnovsky26 的方法，在 4 °C 条件下，用含有 2.5% 戊二醛、2.5% 多聚甲醛和 0.05% 苦味酸的 67 mM 卡可基酸缓冲液（pH 7.4）混合固定液固定 2 小时&#160;。</li>
	<li>用 1% 四氧化锇进行后固定，随后在含有 0.3% 醋酸铀的 50 mM 马来酸缓冲液（pH 5）中过夜孵育。按照标准程序将样品包埋于包埋介质中，切取超薄切片，用柠檬酸铅染色后，用电子显微镜观察。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

生精小管由管腔侧的一圈管周细胞层和基膜所包绕。支持细胞位于基膜上，通过相邻细胞间形成闭锁连接构建血睾屏障，并为生精上皮的结构排列提供支架。在生殖细胞发育的整个过程中，支持细胞与邻近的生精细胞保持着密切的接触，实现物理连接和细胞间通讯。因此，当采用本文所述方法分离支持细胞时，它们将失去与邻近管周细胞及生精细胞的密切接触。然而，这些细胞似乎仍保留了其许多典型特征。 体内 如激素反应性和标志基因表达，尽管存在时间依赖性且水平较低。 
支持细胞在培养六天后会形成较大的中性脂滴。支持细胞的重要功能之一是吞噬退化的、凋亡的生殖细胞以及生殖细胞物质，例如所谓的残余体29。已知残余体和来自伸长精子细胞的胞质体可黏附于分离的支持细胞并被其吞噬30。由于在分离过程中无法完全去除所有生殖细胞，因此我们推测污染的生殖细胞在接种后也可能黏附于支持细胞并被吞噬。由于残余体含有小脂滴，因此可以合理推测，支持细胞在大量吞噬黏附和受损的生殖细胞后会获得较大的脂滴。此外，有证据表明，吞噬清除凋亡细胞可主动下调炎症和免疫反应31，这可能...

睾丸产生雄性配子和性激素， 即， 雄激素。该器官由两个区室组成。间质区室约占睾丸总体积的10-12%1，类固醇生成发生在Leydig细胞内。管状 compartment 约占睾丸体积的60-80%1 并包含生殖细胞以及两种体细胞——管周细胞和塞尔托利细胞。睾丸由结缔组织隔膜分割为250至300个小叶，每个小叶含有1至3条高度盘曲的生精小管。这些小管由基底膜、一层胶原蛋白以及环状排列的管周细胞包裹。图1A).
生精上皮位于基膜的管腔侧。支持细胞是贯穿整个生精上皮、从基膜延伸至管腔的大型长形细胞。它们与基膜紧密连接，并通过侧基底部位有序排列的紧密连接形成连续的细胞层，将生精上皮与间质隔离开来，构成血睾屏障。支持细胞具有显著的细胞质突起和分支结构，使其能够与特定物种特异但数量恒定的生精细胞建立紧密的形态和功能联系。二倍体的生精干细胞增殖并分化为精原细胞。
在减数分裂Ⅰ期间，会生成短暂存在的四倍体精母细胞，这些细胞在减数分裂Ⅱ中进一步发育为四个单倍体精子细胞。所有生殖细胞均通过细胞质桥相互连接，从而形成一个细胞网络。精子细胞成熟过程中的主要事件是大量细胞质被排出，形成残余体，这一过程称为精子形成（spermiogenesis）。残余体会被支持细胞（Sertoli cells）吞噬。随后，晚期精子细胞被释放到曲细精管腔内，并被运送至附睾进行进一步成熟。支持细胞与生殖细胞在空间分布和功能上似乎相互协调，共同调控精子发生过程。
单个睾丸细胞类型的制备始于近一个世纪前，当时通过培养小块睾丸组织，并借助显微镜鉴定细胞类型2。后来，通过使用尖头镊子切开白膜后仔细解剖曲细精管，得以分离管状结构与间质部分3。1975年，Welsh和Wiebe引入了胶原酶处理方法，以去除附着在曲细精管上的间质组织，并采用胰蛋白酶处理去除外部的管周细胞层4。早期研究多采用年轻的未成熟大鼠（约20日龄），此时生精作用尚未开始，支持细胞在曲细精管细胞群中占较大比例。在此年龄段，大鼠的支持细胞停止分裂，相邻细胞之间形成紧密连接，从而建立起血睾屏障5。
独立于威尔士和Wiebe Dorrington 等 引入了胰蛋白酶与脱氧核糖核酸酶的联合使用，随后采用大豆胰蛋白酶抑制剂和胶原酶处理的方法，该方法于同年发表6两组均使用机械力（分别通过反复将消化后的管状片段抽吸过注射器针头或巴斯德移液管）以制备含有约70%支持细胞的均一细胞悬液用于接种。在无血清培养基中培养3天后，支持细胞的比例增加至约90%，这主要可归因于污染的生殖细胞死亡。然而，残留的管周细胞（PTCs）则通过其细胞外基质牢固附着。已知管周细胞（而非支持细胞）能够产生纤连蛋白，后者可作为评估管周细胞污染程度的标志蛋白。因此，Tung等认为额外的透明质酸酶处理可能有助于提高支持细胞组分的纯度7事实上，他们证明了额外的处理步骤可将PTCs的污染减少约20倍，这一点在使用含血清培养基培养纯化后的塞尔托利细胞时尤为明显。自此以后，Tung等人改进的方法成为主流方案，并被该领域的其他多个主要研究团队广泛采用。8 (图1B).
在胶原酶处理过程中，大部分精原干细胞（PTC）被释放出来，可与支持细胞同时分离。PTC具有强烈的增殖能力，但对促卵泡激素（FSH）无反应；而支持细胞不再进行有丝分裂，但可通过特征性的形态学变化以及环磷酸腺苷（cAMP）浓度的升高对FSH产生响应9。类似的酶消化方案也可用于从其他动物（如人10、小鼠11,12、西伯利亚仓鼠13或牦牛14）中分离原代支持细胞。为了去除大量污染的生殖细胞，可在分离过程的最后阶段采用低渗休克处理15，该方法也适用于成年大鼠睾丸中支持细胞的有效分离16。此外，可通过将细胞悬液接种至刀豆球蛋白A（Datura Stramonium agglutinin）包被的凝集素培养皿上，从而将富集的支持细胞悬液与生殖细胞分离开来17。只有支持细胞和少量残留的PTC能够黏附于凝集素培养板上。
最初，主要利用大鼠的初级支持细胞培养物来研究其对激素的反应性，或建立细胞系，例如小鼠支持细胞系TM418。迄今为止，该细胞系已在百余项研究中被广泛使用。在转化医学研究中，支持细胞已被用于共培养细胞和组织的免疫保护，例如在异种或同种异体胰岛共移植中实现移植物的长期存活，而无需全身性免疫抑制治疗19。分离的支持细胞还被用于共培养实验，以研究上皮-间质（支持细胞-近端肾小管上皮细胞）以及体细胞-生殖细胞（支持细胞-生殖细胞）之间的相互作用20,21。最近，初级支持细胞被用于研究Toll样受体的表达、促炎性细胞因子的分泌，以及在感染非致病性和尿路致病性E. coli后诱导细胞因子表达的信号转导级联反应22。其他近期研究利用支持细胞探讨睾丸免疫豁免机制23，并证明睾酮预处理可抑制脂多糖（LPS）诱导的炎症反应24。

<table><tbody><tr><td>肌动蛋白（平滑肌）抗体克隆 1A4</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td>单克隆小鼠抗人抗体。&lt;br/&gt; 免疫荧光使用 1:100 稀释度。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分&lt;br/&gt; 标准级，冻干粉</td><td>Serva</td><td>11930.04</td><td>用于免疫荧光的滤膜（0.45 &amp;micro;m）过滤BSA溶液。</td></tr><tr><td>Corning 细胞筛 70&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>白色</td></tr><tr><td>来自&lt;em&gt; Clostridium histolyticum&lt;/em&gt; 的胶原酶A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI封片剂 ProLong Gold 抗荧光淬灭剂</td><td>Life technologies</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td>100 g/L</td></tr><tr><td>不含Ca&amp;acute;&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;的Dulbecco磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶I（DNase I）</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>电子显微镜</td><td>Zeiss</td><td>EM 109S</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan 2</td><td></td></tr><tr><td>来自牛睾丸的透明质酸酶</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>倒置光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>常规细胞培养显微镜</td></tr><tr><td>小鼠IgG/IgM（H+L）多克隆&lt;br/&gt; 二抗&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>A-10684</td><td>Alexa Fluor 488偶联物</td></tr><tr><td>油红O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td>因颜色更鲜艳，已取代苏丹III和苏丹IV。</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>青霉素（5,000&amp;nbsp;U/ml）/&lt;br/&gt; 链霉素（5,000 &amp;micro;g/ml）</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>100倍浓缩液</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td>含300 mg/L L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>来自猪胰腺的胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>T5266</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液（0.4%）</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>Sigma产品比之前使用的&lt;br/&gt; Roche产BPTI（抑肽酶）便宜得多。</td></tr><tr><td>波形蛋白抗体（V9）</td><td>Sigma</td><td>V6630</td><td>单克隆小鼠抗猪波形蛋白抗体。&amp;nbsp; 免疫荧光使用1:100稀释度。</td></tr><tr><td>Wistar WU大鼠</td><td>Charles River</td><td></td><td>实验当天应为19日龄。</td></tr></tbody></table>

从大鼠睾丸中分离支持细胞和管周细胞

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

睾丸，尤其是雄性配子，以一种独特的方式挑战免疫系统，因为分化的精子在青春期才首次出现，这比全身性免疫耐受的建立晚了十多年。生精细胞表达多种可能被免疫系统识别为“非己”的蛋白质。因此，睾丸必须一方面能够对这些新抗原建立免疫耐受，另一方面仍需具备抵御感染和肿瘤发生的能力。因此，睾丸是体内少数几个免疫豁免部位之一，能够在不引发有害炎症免疫反应的情况下耐受外来抗原。支持细胞（Sertoli细胞）在维持睾丸免疫豁免微环境中起关键作用，并可延长共移植细胞在异体环境中的存活时间。因此，原代Sertoli细胞是研究睾丸免疫豁免特性的重要工具，这种作用难以被已建立的细胞系或其他细胞模型轻易替代。本文提供了一种详细且全面的实验方案，可在一天内从大鼠睾丸中分离获得Sertoli细胞——如需要，也可同时分离管周细胞。

该方法可从10个大鼠睾丸中分离得到约12 × 107个支持细胞。在6孔板中每孔接种3 × 106个细胞，因此在第7天可获得6至7块6孔板用于实验。胰蛋白酶-脱氧核糖核酸酶I消化是支持细胞分离过程中最关键的步骤。若此步消化过度，生精细胞与支持细胞的比例将显著升高并持续至实验结束。在培养的第3至6天，必须仔细洗去尽可能多的非贴壁或松散附着的生精细胞。作为连续4天频繁洗涤的替代方法，可在第3天采用低渗处理去除生精细胞27。该方法的优点在于支持细胞的培养时间最短，从而可能比长期培养更好地保留支持细胞的特异性功能。
尽管透明质酸酶处理可去除大部分残留的管周细胞，但仍会有少量细胞存活。分离得到的支持细胞纯度为 &gt;通过波形蛋白免疫标记可证明其达到95% （图5B）由于管周细胞具有较强的增殖潜能，因此必须在无血清条件下进行支持细胞培养。在含有10%血清的培养条件下...

研究睾丸免疫特权、炎症或感染过程中的信号转导以及利用其免疫保护特性需要使用原代支持细胞。本文介绍一种基于酶消化的方法，用于从大鼠睾丸中分离高纯度的原代支持细胞和管周细胞。

睾丸，尤其是雄性配子，以一种独特的方式对免疫系统构成挑战，因为分化的精子首次出现于……

本实验的总体目标是从大鼠睾丸中分离出高度纯化的原代支持细胞和管周细胞（PTCs）。该方法有助于回答男性生殖免疫学领域的一些关键问题，例如支持细胞如何影响睾丸巨噬细胞，或支持细胞中自噬过程是如何被调控的？获取支持细胞和管周细胞的过程较为繁琐，且需要使用昂贵的试剂。与细胞系相比，分离得到的原代细胞在细胞培养过程中能显著保留更多体内定性特征。该技术的应用延伸至男性不育症的诊断，因为支持细胞在生精细胞发育过程中发挥着关键作用。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为很难判断曲细精管是否已被充分消化。该方法的可视化演示至关重要，因为整个操作过程包含多个需要规范执行的步骤。微小的失误可能累积导致实验失败。首先，用70%乙醇对10只放血处死的雄性Wistar大鼠的腹部进行消毒。随后，依次对每只动物，用镊子将皮肤从腹肌上提起，并从耻骨联合至胸骨处剪下一块椭圆形的皮肤瓣。将皮肤向上翻至胸部。然后抓住腹肌，从耻骨联合至胸骨做一条正中切口。现在用拇指从骨盆向上挤压腹部，将睾丸从下骨盆推出。用镊子夹住附睾脂肪垫，进一步拉出睾丸。然后剪断精索，保留白膜完整。将睾丸收集到含有20毫升PBS的50毫升锥形管中。收集完所有睾丸后，用等体积的1%碘乙醇溶液对器官进行消毒，并立即倾去上清液。用25毫升PBS快速清洗睾丸两次，每次25毫升，然后将器官转移至含有15毫升新鲜PBS的培养皿中。接着，用镊子牢固夹住每个睾丸的一端，在另一端的白膜上做一个小切口。使用闭合的剪刀刀片作为刮取工具，挤出曲细精管。生精小管应仍保持致密的睾丸形束状结构，仅有少数小管伸入盐水中。当所有睾丸完成去囊处理后，将裸露的器官转移至含有10毫升胰蛋白酶-DNase 1溶液的100毫升螺口瓶中，并在32°C的摇动水浴中消化去囊的睾丸。四分钟后，用肉眼观察小管的分散情况。一旦小管开始在溶液中分散，立即加入5毫升胰蛋白酶抑制剂溶液A，上下吹打3至4次以终止消化。将组织悬液转移至50毫升锥形管中，并让小管在重力作用下自然沉降。五分钟后，使用同一支10毫升移液管小心吸去上清液，然后加入10毫升胰蛋白酶抑制剂B溶液，用移液器将小管上下吹打两到三次，以彻底终止消化反应。为去除污染的间质细胞，使用25毫升移液管将小管在25毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中重新悬浮。然后静置12分钟，使小管依靠重力自然沉降。按照刚刚演示的方法，再重复 PBS 洗涤九次。为分离管周细胞，将经 PBS 洗涤的肾小管转移至一个含有胶原酶、透明质酸酶和 DNA 酶 1 溶液的 100 毫升螺旋盖瓶中，在 32 摄氏度的摇动水浴中进一步消化 10 分钟。孵育结束后，取一滴悬液置于玻片上，立即在倒置光学显微镜下以 100 倍放大倍数快速检查肾小管状态。小管的长度会变短，边缘粗糙，表明周围管细胞已释放。使用同一支25毫升移液管，将消化后的小管转移至50毫升锥形管中，并用1

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从大鼠睾丸支持细胞的分离和管周细胞

本视频展示了从小鼠睾丸的曲细精管中分离支持细胞的方法。通过酶消化和反复洗涤，可促进支持细胞释放到溶液中，随后可进一步培养以实现增殖和生长。...

从小鼠曲细精管中分离免疫调节性塞尔托利细胞

本文介绍了一种从成年小鼠中分离并维持精原干细胞及其前体细胞系的简单方法。该方法利用来源于成年小鼠睾丸体细胞区室的饲养层细胞。此技术适用于常见的小鼠品系，包括转基因、基因敲除和基因敲入小鼠。...

长期成年小鼠精原干细胞系建立的培养中精原干细胞与前体细胞（SSCs）的连续富集

本文介绍了一种新型的啮齿类动物睾丸细胞悬液机械制备方案，该方法无需使用酶和去污剂。该技术操作简便、快速、可重复性强，所获得的细胞悬液质量良好，适用于流式分选和RNA提取。...

制备睾丸细胞悬液的简易高效技术

利用STA-PUT沉降速度法分离精原细胞类型

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从附睾分离的原代上皮细胞的全细胞膜片钳记录

这种曲细精管压片技术的目的是在保持细胞完整性的前提下，快速评估发育中鼠类精母细胞的细胞学特征。该方法可用于研究精子发生的各个阶段，并可方便地与其他生物化学和分子生物学方法结合，用于小鼠减数分裂的研究。...

一种利用小鼠模型进行精子发生细胞学分析的生精小管压片技术

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本文介绍了一种利用不连续的牛血清白蛋白密度梯度，结合常规实验室设备，从成年小鼠睾丸中富集粗线期精母细胞、圆形精子细胞和伸长中的精子细胞的实验方案。...

利用常规实验室设备从小鼠睾丸中富集粗线期精母细胞和精子细胞

本文描述了四种利用新生小鼠睾丸原代细胞生成睾丸类器官的方法，即细胞外基质（ECM）依赖性和非依赖性的二维（2D）及三维（3D）培养环境。这些技术具有多种研究应用价值，尤其适用于体外研究睾丸的发育过程和生理功能。...

基于细胞外基质与无细胞外基质的小鼠睾丸类器官生成方法

本文介绍一种简单高效的方法，用于从成年小鼠睾丸中分离存活的减数分裂期及减数分裂后生殖细胞。通过使用低细胞毒性、紫光激发的DNA结合染料结合荧光激活细胞分选技术，可获得高度富集的生精细胞群体，适用于多种下游应用。...

使用紫光激发的细胞通透性DNA结合染料分离小鼠生精细胞

本文介绍了一种建立睾丸缺血/再灌注模型的逐步操作流程，旨在研究睾丸缺血-再灌注损伤的病理机制时，构建可重复的睾丸扭转模型。...

睾丸扭转复位固定术：一种睾丸缺血-再灌注损伤的大鼠模型

了解从大鼠睾丸中分离高纯度原代Sertoli细胞和管周细胞的方法。该技术有助于研究男性生殖免疫学及Sertoli细胞在精子发生中的关键功能，为男性不育诊断提供重要依据。

从大鼠睾丸中分离支持细胞和管周细胞

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