在气味引导行为的高分辨率定量果蝇使用 Flywalk范式
December 11th, 2015
自动跟踪系统Flywalk是用于在果蝇气味引导行为高分辨率定量。
这种行为生物测定的总体目标是研究醋蝇的气味引导行为。Fly Walk 是一个高通量系统，可自动跟踪和分析多个苍蝇对嗅觉刺激的行为反应。这项新技术可以帮助回答昆虫嗅觉领域的关键问题。
比如，气味的享乐平衡是什么，或者添加额外的加臭剂对这种平衡意味着什么？这个实验的主要优点是我们可以以高临时分辨率对气味引导行为，并且我们使用的气味刺激类似于昆虫在自然界中体验到的气味刺激，或者我们也在电生理记录中使用的气味刺激。通常，尝试使用这种方法的人可能会很挣扎，因为它确实需要一个气密系统，所以你需要知道空气通过哪里，你需要确保空气可以离开系统的地方根本没有泄漏。对于这些实验，重要的是在含有 12 到 Mid 的低密度培养物中在 12 到 12 光照黑暗循环下饲养果蝇普通食物培养基。
将室温保持在 23 至 25 摄氏度之间，相对湿度应在 70% 左右。使用大型培养瓶制作 20 至 30 只成年小鼠一周，并收集 30 至 40 只混合性别后代的组以组成实验队列。当队列 2 到 4 天大时，将其转移到装有湿泡沫塞或湿纸巾的新小瓶中。
测试前让果蝇在这个小瓶中挨饿 24 小时。在此转移过程中不要麻醉苍蝇，这一点至关重要。对于此设置，250 毫升瓶子用作许多加湿器。
在每个瓶子中装满 100 毫升蒸馏水。接下来，准备每种加臭剂的半毫升工作储备液，作为纯气味和矿物油的 1000 稀释液。同样，准备一个仅含矿物油的 PCR 管作为阴性对照。
现在为每种加臭剂准备气味输送系统。在实验中。将两个球形止回阀连接到每个气味瓶。
确保以正确的流向连接气味样品瓶。错误的连接不仅会影响计划的实验，还可能污染递送系统。接下来，检查系统是否有泄漏。
首先，密封混合室的出口。然后检查刺激装置之前的所有气流是否降至零。如果系统中存在泄漏，请监听它们。
通常可以通过在关键连接处更换橡胶垫圈或更换 Teflon 管来解决。对于此过程的第一步，玻璃破碎是一个问题，因此请穿上防护装备。小心地将 15 个单独的测试蝇转移到单独的玻璃管中 使用吸气器，使用相应的适配器关闭玻璃管的两侧，它们必须非常紧密地贴合。
接下来，将加载的玻璃管连接到苍蝇行走装置。连接所有试管后，让果蝇适应新环境至少 15 分钟，然后再开始实验。现在打开光源。
确保在不增加玻璃管内部温度的情况下提供足够的光线以进行有效跟踪。此时必须将气味瓶全部连接起来，以创建一个封闭的系统。适应期依赖于无泄漏的封闭系统，因此通过管道的气流与测试期间的速度相同。
检查计算机上的气流，将其连接到数字流量计。离开系统的空气流量总数应等于进入系统的空气流量。如果没有，则存在泄漏。
泄漏会影响所有管道中的气流，但有问题的管道通常是气流下降最大的管道。如果发现新的泄漏，通常是由适配器内部的玻璃管破裂引起的，或者是由先前实验的适配器内的玻璃碎片引起的。在此过程中，确保从系统排出的空气的湿度在 60% 到 80% 之间果蝇适应了它们的管子后，就可以进行实验了。
原则上，到目前为止可以呈现任何气味序列。通过随机化刺激并将它们分开至少 90 秒，可以获得最佳结果。总共。
以 500 毫秒的脉冲显示每种气味 40 次。接下来，通过在要监控的区域上拖动帧来设置感兴趣区域。在框架中包括所有 15 个玻璃管，但不包括管末端的外侧 5 毫米。
下一步是关闭跟踪软件并对脚本进行修改。这将改变分隔各个管子的 14 条平行线的 Y 轴位置。当跟踪软件重新打开时，任意两条线之间应该只出现一只苍蝇。
接下来，确保设置了相机参数，以便在整个玻璃管中可靠地跟踪苍蝇。如果苍蝇在感兴趣区域的边缘丢失，请增加跟踪软件的亮度或增益。现在系统已做好充分准备，启动刺激协议。
以每秒 20 帧的速率记录苍蝇位置，并将这些坐标位置与气味阀状态一起记录到文本文件中。由于实验对气味非常敏感，因此需要定期清洁玻璃管，将其浸泡在清洁剂中，然后在流动蒸馏水中冲洗干净。冲洗后，在加压空气中干燥试管，然后将其加热至 200 摄氏度 8 小时。
要首先清洁气味输送系统，请从中央混合室中取出所有气味瓶和管道。然后从混匀室中取出管路适配器。通过在试管等通风橱下用溶剂冲洗来清洁清空的混合室。
使用加压空气干燥混合室，并在 200 摄氏度下加热 8 小时。要清洁气味瓶和阀门，请取下钢塞，丢弃橡胶垫圈，然后拆下止回阀、肥皂止回阀和乙醇以及乙醇和丙酮中的其他成分。接下来，将浸泡的组分以最大设置超声处理 30 分钟，然后用蒸馏水冲洗干净。
和以前一样，使用加压空气干燥，并将组件加热到 200 摄氏度 8 小时。用乙醇冲洗它们 当丙酮沿气流方向流动时，由于丙酮会侵蚀橡胶部件，请立即用加压空气干燥每个冲洗的止回阀，以去除冲洗的止回阀上的所有残留气味。将空气脉冲通过它们几天，将它们放置在 60 摄氏度的培养箱中，以一秒的间隔打开和关闭气流。
15 只饥饿的雌性果蝇暴露于丁酸乙酯。黄色条表示气味脉冲。蓝色方块描绘了 100 毫秒时间范围内的逆风运动。
相应的红色方块描绘了顺风运动。相同的果蝇也表现出逆风运动，以响应 isop 戊酯乙酸酯、乙酸乙酯或两个 3 丁烷 d 的刺激。果蝇对乙酸乙酯的反应起病迅速，振幅高，持续时间短。
相比之下，对两个三丁烷 Dion 的反应平均起效较晚，振幅较低，持续时间较长。最终，以这种方式解析来自每种气味剂的数据，然后进一步分析，以表明所有四种气味在 4 秒内引起的逆风位移都高于溶剂。此外，通过打开加臭剂小瓶，苍蝇同步暴露于所有可能的混合物中。
在用四种单独的气味刺激苍蝇之后，用四种气味的混合物刺激都至少与混合物中最吸引人的单一化合物一样有吸引力。掌握后，您可以在 1 小时内运行此实验，然后它会运行 8 小时，30 分钟后，您可以可视化您的第一个结果。所以这种方法确实可以在短时间内以高临时分辨率从许多苍蝇那里获取数据。
但要小心。此实验需要在实验之间进行大量清洁。如果您的系统仍然受到上次实验的蚂蚁污染，您可以忘记您在苍蝇漫步中的结果。
当然，您也可以通过测试转基因果蝇，从而研究单个或工厂神经回路对 OD 引导行为的影响。在这项新技术发展之后，它为我们在昆虫派系这个领域进行研究铺平了道路，以了解昆虫大脑中这些气味的编码。重要的是，对苍蝇行走的行为和生理实验使用相同的刺激意味着我们可以真正比较这两种不同的实验范式。
看完这个视频后，你应该对如何建立苍蝇行走有一个很好的了解，你应该能够在自己的腿上建立这个实验，并很快开始你自己的昆虫情感高通量实验。但不要忘记，使用玻璃器皿和化学品可能非常危险，因此，请始终穿着实验服。使用护目镜和手套。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
自动跟踪系统Flywalk能够对果蝇的气味引导行为进行高分辨率定量。这个行为生物测定研究醋苍蝇如何对嗅觉刺激做出反应，提供了对昆虫嗅觉的洞察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 行为生物学
- 昆虫嗅觉
背景
- Flywalk是一个用于跟踪单个果蝇的高通量系统。
- 该系统自动分析对气味的行为反应。
- 它有助于解答关于气味的感官平衡的问题。
- 所用的气味刺激与自然界中遇到的相似。
研究目的
- 量化果蝇的气味引导行为。
- 探索不同气味物质对行为的影响。
- 提高对昆虫嗅觉机制的理解。
使用的方法
- 自动跟踪多个单个果蝇。
- 具有嗅觉刺激的行为生物测定。
- 在光暗周期下的受控养殖条件。
- 使用密封系统以防止实验期间的空气泄漏。
主要结果
- 在跟踪气味引导行为方面具有高时间分辨率。
- 对不同气味的感官平衡有了洞察。
- 了解额外的气味物质如何影响行为。
- 证明了Flywalk系统在行为研究中的有效性。
结论
- Flywalk是研究昆虫嗅觉的有价值工具。
- 该方法提供了关于果蝇行为的高分辨率数据。
- 未来的研究可以在这些发现的基础上探索嗅觉处理。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution behavioral quantification using the Flywalk paradigm enables precise mapping of odor-guided responses in Drosophila, directly aligning behavioral outputs with neurophysiological data. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in early discovery, especially for sensory biology and neurobehavioral target portfolios. The approach enhances predictive confidence for translational research by standardizing stimulus delivery and behavioral measurement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of sensory-driven behavioral hypotheses in a controlled, high-throughput format.
- Supports functional validation of neural circuits and candidate targets involved in olfactory processing.
- Facilitates mechanistic de-risking by correlating behavioral phenotypes with neuronal activity.
- Improves predictive confidence for advancing neurobehavioral targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated behavioral systems for downstream compound or genetic screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative behavioral outputs for assay development.
- Enables scalable, automated tracking for efficient screening of odorant libraries or genetic variants.
- Supports reliable evaluation of modulators affecting olfactory-driven behaviors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral assays with neurophysiological paradigms for translational continuity.
- Provides disease-relevant models for sensory and neurobehavioral research when supported by genetic manipulation.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by integrating behavioral and physiological data.
- Offers predictive de-risking for early-stage neuroactive compound evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The Flywalk system integrates from early discovery through assay development, supporting lead identification and translational research in sensory and neurobehavioral domains.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for olfactory-driven behaviors.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible, and quantitative behavioral outputs for compound or genetic screens.
- Analytics: Generates high-resolution, time-stamped behavioral data for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Enables continuity between behavioral and neurophysiological studies using matched stimulus protocols.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for diverse sensory and neurobehavioral research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, automated, and scalable behavioral quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobehavioral and sensory targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral neuroscience and olfactory system handling.
- Demands airtight instrumentation and precise environmental control for reproducibility.
- Necessitates rigorous cleaning protocols to prevent cross-experiment contamination.
- Adaptable to genetically modified models for mechanistic studies.
- Limited to behaviors and stimuli compatible with the Flywalk system's design.
