使用 Flywalk 范式对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的嗅觉引导行为进行高分辨率定量分析

本行为生物测定实验的总体目标是研究果蝇在气味引导下的行为。Fly Walk 是一种高通量系统，可自动追踪并分析多只个体果蝇对嗅觉刺激的行为反应。这一新技术有助于回答昆虫嗅觉领域中的关键科学问题。

例如，一种气味的享乐平衡是什么，或者添加额外的气味物质对此平衡意味着什么？本实验的主要优势在于，我们能够以高时间分辨率研究气味引导的行为，并且我们使用的气味刺激与昆虫在自然环境中所经历的刺激相似，也与我们在电生理记录中所使用的刺激一致。通常，尝试使用此方法的研究者可能会遇到困难，因为该方法确实需要一个完全密封的系统，因此您必须清楚气流的路径，并确保系统没有任何漏气之处。对于这些实验，重要的是在12小时光照与12小时黑暗的循环条件下，在低密度至中等密度的培养物中饲养果蝇，培养基应含有正常的食物成分。

准备期间，将室温保持在23至25摄氏度之间，相对湿度约为70%。使用大培养瓶培养果蝇，每瓶饲养20至30只成虫一周，并收集30至40只混合性别的子代个体组成实验组。当实验组个体达到2至4日龄时，将其转移至含有湿润泡沫塞或湿润滤纸的新培养瓶中。

在测试前，让果蝇在此瓶中饥饿处理24小时。在转移过程中，切勿对果蝇进行麻醉。在此装置中，250毫升的瓶子可作为多个加湿器使用。

每个瓶子中加入 100 毫升蒸馏水。接着，将每种气味物质用矿物油稀释 1000 倍，配制成 0.5 毫升的工作储备液。同样，准备一支仅含矿物油的 PCR 管，作为阴性对照。

现在为每种气味物质准备气味递送系统。在实验中，将两个球型单向阀连接到每个气味瓶上。

务必确保气味小瓶按正确的气流方向连接。连接错误不仅会影响预设实验，还可能导致递送系统受到污染。接下来，检查系统是否存在泄漏。

首先，封闭混合室的出口。然后检查刺激装置前的所有气流是否降至零。如果系统存在泄漏，请仔细听辨漏气声。

通常可以通过更换关键连接处的橡胶垫圈或更换聚四氟乙烯管来解决这些问题。在进行此操作的第一步时，需注意玻璃破碎的风险，因此应穿戴好防护装备。使用吸虫器小心地将15只单独的果蝇转移到各自的玻璃管中，然后使用相应的接头从两侧封闭玻璃管，接头必须紧密贴合。

接下来，将装有果蝇的玻璃管连接到果蝇行为分析装置上。待所有玻璃管连接完毕后，让果蝇在新环境中适应至少15分钟，然后开始实验。现在打开光源。

确保提供足够的光照以实现高效追踪，同时避免玻璃管内温度升高。此时所有气味小瓶必须全部连接，以形成一个封闭系统。习惯化阶段依赖于无泄漏的封闭系统，因此流经管道的气流速度需与测试阶段保持一致。

检查计算机的气流，将其连接至数字流量计。系统排出的总气流量应等于进入系统的气流量。若不相等，则表明存在泄漏。

泄漏会影响所有管子的气流，但通常出现问题的管子是气流下降最显著的那一个。如果发现新的泄漏，通常是由于适配器内部的玻璃管破裂，或由于之前实验残留在适配器内的玻璃碎片所致。在此过程中，务必确保系统排出空气的湿度保持在60%至80%之间。果蝇适应其管子环境后，即可开始实验。

原则上，目前可以呈现任意序列的气味。通过随机化刺激并使其间隔至少 90 秒，可获得最佳结果。总计。

每种气味以500毫秒的脉冲呈现40次。接着，通过拖动框选需要监测的区域来设定感兴趣区域。将全部15根玻璃管纳入框选范围内，但排除管端外侧5毫米的区域。

下一步是关闭追踪软件并对脚本进行修改，这将改变分隔各个试管的14条平行线的Y轴位置。当重新开启追踪软件后，任意两条线之间应仅存在一只果蝇。

接下来，确保相机参数已设置妥当，以便在整个玻璃管区域内稳定追踪果蝇。如果果蝇在兴趣区域边缘丢失，可提高追踪软件的亮度或增益。系统现已准备就绪，启动刺激程序。

以每秒 20 帧的速率记录果蝇的位置，并将这些坐标位置与气味阀门状态一并记录到文本文件中。由于实验对气味非常敏感，需要定期清洁玻璃管，将其浸泡在洗涤剂中，然后用流动的蒸馏水冲洗干净。冲洗后，在加压空气中干燥玻璃管，再将其加热至 200 摄氏度，持续 8 小时。

首先清洁气味输送系统时，需从中央混合室中移除所有气味小瓶和管路。然后从混合室上取下管路接头。在通风橱中用溶剂冲洗已清空的混合室，管路也需同样进行清洗。

使用加压空气干燥混合室，并在200摄氏度下加热八小时。清洁气味小瓶和阀门时，取下钢制塞子，丢弃橡胶垫圈，拆下止回阀、皂液止回阀、乙醇以及其他在乙醇和丙酮中的组件。接着，将浸泡过的组件在最大功率下超声处理30分钟，然后用蒸馏水冲洗干净。

与之前相同，使用加压空气进行干燥，并将组件加热至200摄氏度，持续八小时。用乙醇冲洗，冲洗方向应与气流方向一致，因为丙酮会腐蚀橡胶部件。每次冲洗单向阀后，立即使用加压空气将其快速干燥，以彻底去除冲洗后单向阀中的残留气味。随后让空气脉冲通过这些单向阀数天，并将其置于60摄氏度的培养箱中，以每秒一次的频率交替开启和关闭气流脉冲。

将15只饥饿的雌性果蝇暴露于丁酸乙酯中。黄色条形表示气味脉冲。蓝色方块表示在100毫秒时间窗口内的逆风运动。

相应地，红色方块表示顺风移动。这些果蝇在异戊基乙酸酯、乙酸乙酯或两种三丁烷二酸酯的刺激下，也表现出逆风移动，该结果为群体平均值。果蝇对乙酸乙酯的反应具有快速起始、高幅度和持续时间短的特点。

相比之下，对2,3-丁二酮的反应具有较晚的平均起始时间、较低的振幅和较长的持续时间。最终，每种气味物质的数据均以此方式解析后进一步分析，结果显示四种气味在四秒内均比溶剂引发更强的逆风位移。此外，通过同步打开气味物质小瓶，果蝇被同时暴露于所有可能的混合气味中。

在用四种单一气味刺激果蝇后，再用这四种气味的混合物进行刺激，结果发现所有混合物的吸引力均不低于其中最具吸引力的单一组分。一旦掌握该技术，您可在一小时内完成实验设置，随后实验自动运行八小时，仅需半小时后即可观察到初步结果。因此，该方法确实能够在短时间内以高时间分辨率获得大量果蝇的实验数据。

但需谨慎。本实验要求在每次实验之间进行彻底清洁。如果您的系统仍残留上一次实验的蚂蚁污染，则本次果蝇行走实验的结果将无法保证。

当然，您也可以利用该方法测试转基因果蝇，从而研究单个或特定神经回路对气味导向行为的影响。这项新技术的建立，为我们开展昆虫领域相关研究、理解昆虫大脑中气味编码机制开辟了道路。尤为重要的是，由于在果蝇行走行为实验和生理学实验中采用了相同类型的刺激方式，我们能够真正实现对这两种不同实验范式之间的直接比较。

观看本视频后，您应该能够很好地掌握如何建立果蝇行走实验，并能够在您自己的实验室中开展该实验，很快启动您自己的高通量昆虫行为研究。但请切记，操作玻璃器皿和化学品可能具有极高危险性，因此务必穿戴实验服，佩戴护目镜和手套。