黄曲霉毒素在花生RNAi介导的控制:方法分析霉菌毒素的产生和转基因表达的花生/黑病害系统

这项工作的总体目标是提供一种可靠、准确、廉价和快速的方法，用于测试转基因花生中曲霉菌黄曲霉毒素合成基因的 RNAi 介导的沉默的功效，使用最少数量的种子，通常需要数百克种子才能有效量化样品中的黄曲霉毒素。该技术的主要优点是，它使用不到 5 颗种子在准备种子前 10 天测试特定处理，在 ZAP Pex 螺旋培养基中设置黄曲霉毒素阳性黄曲霉 NR 3 3 5 7 的培养物。在 25 摄氏度下种植这种培养物。

它将用于种子接种。在准备表达 RNAI 的转基因植物后（在文本方案中详细说明），继续收获它们的种子。首先，使用调低的高压清洗机上的磨损物去除鲤鱼，或用手刮掉鲤鱼。

去除鲤鱼后，通过将豆荚放在成熟板上的适当组来识别中鲤鱼的颜色。现在去除孔并分别处理黄色和棕色种子。计算实验所需的种子数量至少三个种子块，这意味着每个被采样的花生系需要三个 co leadin halfs。

用一层种子覆盖无菌烧杯的底部，然后用测量体积的 75% 乙醇覆盖种子。然后将该音量加倍。让种子在溶液中孵育 30 秒，然后用消毒的蒸馏水冲洗干净。

接下来，用 2% 次氯酸盐的体积处理种子，就像用 F 乙醇一样。让这个孵化进行 5 分钟。然后在 5 倍体积的无菌蒸馏水中使用 3 次冲洗。

要去除次氯酸盐，在此步骤中洗掉所有次氯酸盐溶液至关重要。种子现在已进行表面灭菌。接下来，将种子浸入无菌蒸馏水中两小时，使种子水合，准备将水合的种子放在无菌培养皿上。

此时所有材料都应进行消毒。用镊子去除种皮，然后分离 cohain。最后，用手术刀取出胚胎。

胚胎可以丢弃或用于再生新植物。接下来，用手术刀将油精切成两半，然后将两半和消毒的蒸馏水浸入水中，直到它们准备好接种。接下来，在无菌纸巾上吸干一半 co leadin 中多余的水，然后将种子块放入带有种子大小草皮的单独的 1.5% 螺旋板中，然后将种子塞入其中，切面朝上，以接种 co leadin 的一半。

向切割表面添加每微升悬浮液 2 微升 10， 000 个曲霉孢子。不要让悬浮液沿着种子半部分的侧面流下。最后，将培养皿放入 30 摄氏度的黑暗培养箱中 1 到 4 天，直到它们经过测试。

一天后、两天后以及三四天后，根据需要对种子进行取样，轻轻去除随机选择的接种半部分。用纸巾擦去多余的孢子和螺旋钻，然后将样品放入玻璃螺帽样品瓶中。将未接种的样品转移到 2 mL 试管中进行 R-T-P-C-R 分析。

在液氮中游离样品，并将冷冻样品储存在冰箱中，直到处理完毕。对于黄曲霉毒素分析，如果需要，将接种的半婴儿床铅素放入 4 毫升玻璃螺口盖小瓶中。样品将在零下 80 摄氏度下稳定数月。

当种子处于室温下时，通过加入 4 体积的甲醇提取样品，并让试管在室温下避光孵育过夜而不搅拌。第二天，首先进行 UPLC，制备带有匹配筛板的 1.5 mL 丙烯微型柱。然后加入 200 毫克氧化铝。

接下来，插入另一个熔块。下一个位置，将 A-U-P-L-C 自动进样瓶置于迷你柱下方并与微型柱接触，以最大限度地减少蒸发。现在将样品中的 0.5 毫升甲醇提取物加入到一个一次性玻璃杯中，两个不是塑料。

然后向试管中加入 0.5 毫升乙基丁腈，并用移液管混合溶液。现在将 0.5 毫升混合物涂抹在准备好的迷你柱上，并仅使用重力收集 EIT。收集 EIT 后，快速将化粪池盖连接到收集瓶上，以便在 UPLC 上使用。

将样品瓶放入已经用水、甲醇和乙酸盐试验的流动相制备好的 A-U-P-L-C 中。然后量化 EIT 中的黄曲霉毒素含量。有关 UPLC 分析的更多详细信息，请参阅文本实验方案。

在单个玻璃瓶中设置用于提取的种子块。然后将冻干瓶过夜，并在早上测量组织样品的干重，以便黄曲霉毒素浓度可以以每克样品的纳克表示。然后从冰箱中取出样品，加入三醇，用珠磨匀浆器以 3、100 RPM 的速度研磨冷冻组织 40 秒，然后进行 RNA 提取，携带来自黄藤的五个黄曲霉毒素合成基因的小片段的 RNAI 载体用于转化花生植株。

鉴定号对应于来自 99 个再生 TRANSFORMANTS 的广泛研究所的基因组注释号，7 个 PCR 阳性细胞系被克隆并按描述进行测试。与对照组相比，所有 7 项均显示黄曲霉毒素积累减少 60% 至 100%。显示了 7 行中 2 行的结果。

这两条 RN AI 品系显示了 NPT 两个可选标记的存在。根据 S-T-N-P-C-R 结果，使用的阴性对照是 PCR 阴性细胞系，该细胞系经过转化过程以测试 RNAi 细胞系抵抗黄曲霉毒素新鲜收获的黄曲霉毒素阳性的黄曲霉毒素的能力。黄素系 NRRL 3 3 5 7 在孵育长达 96 小时后应用于缺乏胚胎和睾丸的半婴儿床铅蛋白。

使用 UPLC 处理接种的组织，以测量其黄曲霉毒素水平，如所述。液相色谱质谱法进一步证实了这些结果。总体而言，RNAi 2 88 72 显示与对照相比，黄曲霉毒素 B 2 减少 94% 至 100%，黄曲霉毒素 B 1 减少 90% 至 100%。

而 RNAi 2 88 74 显示两种黄曲霉毒素均减少了 60% 至 100%。按照此程序，相同的种子提取物可用于分析植物 Xin，以便更好地了解种子对真菌入侵的反应。该方法还将提供一种独特的工具，帮助开发用于控制霉菌毒素的 RNAI 技术。