通过RNAi控制花生中的黄曲霉毒素：分析花生中霉菌毒素产生及转基因表达的方法曲霉属 病理系统

本研究的总体目标是提供一种可靠、准确、低成本且快速的方法，用于检测转基因花生中RNAi介导的黄曲霉毒素合成基因沉默效果，该方法仅需使用极少量种子即可完成；通常需要数百克种子才能有效定量样品中的黄曲霉毒素。该技术的主要优势在于，仅需不到五粒种子即可对特定处理进行检测，并且比准备种子提前10天进行。建立黄曲霉毒素阳性菌株黄曲霉Aspergillus flavus NR RL 3 3 5 7的培养物于ZAP Pex螺旋培养基中，在25摄氏度条件下培养该菌种。

它将用于种子接种。在制备表达RNAI的转基因植株后（具体步骤详见文字版实验方案），继续收获其种子。首先，使用调至低压的高压水枪通过冲洗去除果皮，或手动刮除果皮。

去除荚果外层后，将荚果放置在成熟度分级板上，根据中果皮的颜色将其归入相应的组别。随后去除空洞部分，并分别处理黄色和棕色的种子。计算实验所需的种子数量，每份花生品系至少需要三个种子片段，即每个花生品系需准备三个完整的子叶半粒。

在无菌烧杯底部铺上一层种子，然后加入适量的75%乙醇，刚好浸没种子，随后将乙醇体积加倍。让种子在溶液中孵育30秒，然后用灭菌的蒸馏水冲洗干净。

接着，用与F乙醇处理相同体积的2%次氯酸钠处理种子，浸泡5分钟。然后用五倍体积的无菌蒸馏水清洗三次。

为了去除次氯酸盐，此步骤中必须彻底洗去所有次氯酸盐溶液。此时种子已完成表面灭菌。接下来，将种子浸入已灭菌的蒸馏水中浸泡两小时以进行水合，随后将水合后的种子置于无菌培养皿中。

此时应将所有材料进行灭菌处理。使用镊子去除种皮，然后分离胚乳。最后用解剖刀取出胚。

胚胎可被丢弃或用于再生新植株。接下来，用解剖刀将子叶切为两半，并将切好的子叶半片浸入无菌蒸馏水中，直至准备进行接种。随后，用无菌纸巾吸去子叶半片上多余的水分，将种子片段分别放入含有种子大小凹槽的1.5%琼脂平板中，并将种子切面朝上放入凹槽内，以完成对子叶半片的接种。

向切面上加入2 µL浓度为每微升10,000个曲霉孢子的悬浮液。注意勿使悬浮液沿种子半片的侧面流下。最后，将培养皿置于30 °C的黑暗培养箱中培养1至4天，直至进行检测。

在一天后、两天后以及三到四天后，轻轻取样，根据需要随机选取接种过的半粒种子。用纸巾擦去多余的孢子和钻屑，将样品放入玻璃螺口小瓶中。将未接种的样品转移至2毫升离心管中，用于RT-PCR分析。

将游离样品置于液氮中，并将冷冻样品储存在冰箱中，直至进行处理。如需进行黄曲霉毒素分析，取接种后的半片子叶放入4毫升玻璃螺口小瓶中。样品在负80摄氏度条件下可稳定保存数月。

当种子处于室温时，加入四倍体积的甲醇提取样品，并将试管在室温下避光静置过夜，不进行振荡。第二天，首先进行超高效液相色谱（UPLC）分析，准备一个1.5毫升的聚丙烯微型柱，配以匹配的烧结滤片，然后加入200毫克氧化铝。

接着，插入另一个烧结片。下一步，将A-U-P-L-C自动进样瓶置于微型柱下方并与之接触，以尽量减少蒸发。现在，将0.5毫升样品的甲醇提取物加入一次性玻璃试管中，切勿使用塑料管。

然后向试管中加入 0.5 毫升乙腈，并用移液器混合溶液。现在将 0.5 毫升混合液加入已制备好的微型柱中，仅依靠重力收集 EIT。收集完 EIT 后，立即在收集管上安装无菌盖，用于 UPLC 分析。

将小瓶放入已用甲醇-水-乙腈三元流动相预平衡的A-U-P-L-C中，然后定量EITs中的黄曲霉毒素含量。更多细节请参见文本方案及UPLC分析部分。

将用于提取的种子样品分别放入玻璃小瓶中。随后将小瓶冷冻干燥过夜，次日早晨测定组织样品的干重，以便将黄曲霉毒素浓度表示为每克样品中含多少纳克。然后从冷冻箱中取出样品，加入三醇，并使用珠磨匀浆机在 3,100 RPM 条件下研磨冷冻组织 40 秒，随后进行 RNA 提取。实验中采用携带来自黄曲霉的五个黄曲霉毒素合成基因小片段的 RNAi 载体转化花生植株。

这些编号对应于从7个PCR阳性株系中克隆并检测的99个再生转化体的布罗德研究所基因组注释编号。与对照株系相比，所有7个株系的黄曲霉毒素积累量均减少了60%至100%。本文展示了其中2个株系的结果。

这两条RN AI品系显示出含有NPT II型选择性标记。根据S-T-N-P-C-R结果，所用阴性对照为经过转化过程的PCR阴性品系，用于检测RNAi品系抵抗黄曲霉毒素的能力。接种物为新收获的、黄曲霉毒素检测呈阳性的kedia，所用菌株为黄曲霉NRRL 3357，在培养长达96小时后，将其接种于去除胚和种皮的半片cotyledon上。

接种的组织采用超高效液相色谱法（UPLC）检测其黄曲霉毒素含量，方法如前所述。这些结果进一步通过液相色谱-质谱法得到确认。总体而言，与对照组相比，RNAi 2 88 72株系的黄曲霉毒素B2减少了94%至100%，黄曲霉毒素B1减少了90%至100%。

而RNAi 2 88 74则显示出对两种黄曲霉毒素的抑制效果达到60%至100%。按照此方法，可利用相同的种子提取物分析植物抗毒素（phytoxin），以更深入地理解种子对真菌侵染的响应机制。该方法还将为开发RNAi技术以控制霉菌毒素提供一种独特的工具。Oxon。