用于表征细菌-宿主相互作用的仿生材料

本实验的总体目标是制备由纯重组黏附蛋白与聚苯乙烯微球偶联而成的仿生材料，该材料可用于解析单个细菌黏附蛋白与宿主细胞受体之间的生化及功能相互作用。该方法有助于回答宿主-病原体相互作用领域中的关键问题，例如评估对宿主细胞信号通路的影响以及抑制病原体介导的细胞毒性效应。该技术的主要优势在于，纯化的黏附蛋白（AEAs）能够以定向且共价的方式与大小近似于细菌的聚合物颗粒结合，从而模拟细菌表面的展示状态。

与我共同演示该实验步骤的是本实验室的博士研究生 TU A-C-E-D-A。本实验将演示硫胺素定向偶联方法。该方案适用于利用 SUL 琥珀酰亚胺基-4-（对马来酰亚胺苯基）丁酸酯（SMPB）作为交联剂，将含半胱氨酸的蛋白质与胺基功能化的聚合物微珠进行偶联。在开始微珠活化步骤前，请按照方案文本所述，预先配制所有必要的试剂。

轻轻倒置混匀磁珠悬浮液，然后将所需量的磁珠悬浮液转移至无菌的 1.5 毫升离心管中。加入 1 毫升无菌 PBS（pH 7.0），轻轻吹打混匀以洗涤磁珠，随后在微量离心机中通过离心形成沉淀。小心使用移液器和吸头吸除上清液。

将珠粒重悬于1毫升新鲜无菌PBS中，并重复洗涤步骤。将珠粒重新悬浮于0.8毫升PBS中，加入200微升新配制的10毫摩尔SFO SMPB。

为了达到2 mM的终浓度，将珠子悬浮液置于旋转轮上，在25°C孵育1小时，同时准备下一步偶联所需的蛋白质，以便立即加入活化的珠子中。检测蛋白质浓度，并将其调整至偶联反应所需的终浓度。六。

通常使用微摩尔级的蛋白质和磷酸盐缓冲液（PBS），体积为一毫升，用于蛋白质还原。加入TEP储存液，使其终浓度为5毫摩尔。室温下孵育30分钟，保留数微升蛋白质溶液，用于测定初始蛋白质浓度及偶联效率的计算。

开始蛋白偶联操作时，先离心收集活化磁珠，并用缓冲液洗涤沉淀。随后将其重悬于一毫升新鲜无菌的 PBS 中，再将沉淀重悬于预先配制的蛋白溶液中，以达到所需的蛋白浓度。将蛋白-磁珠悬液置于旋转仪上，25 摄氏度孵育 2 小时。孵育 2 小时后，加入半胱氨酸储备液，使终浓度为 50 毫摩尔/升，并将悬液继续在旋转仪上于 25 摄氏度孵育 30 分钟，以封闭磁珠上剩余的活化基团。

通过离心收集珠子。保留上清液用于测定蛋白浓度并计算偶联效率。用一毫升 PBS 和 Resus 缓冲液洗涤珠子沉淀物两次，再用一毫升新鲜 PBS 洗涤，于竞争测定前一天制备终产物。向 24 孔板的每孔接种一毫升海拉细胞，细胞浓度为每毫升 150,000 个细胞。

这将使细胞在实验开始前达到约80%的融合度。用一个新鲜的副溶血性弧菌菌落接种5毫升海洋LB培养基，在30摄氏度下振荡培养过夜。制备足量的珠耦联多价黏附分子，方法如前所述。

在竞争结合实验当天，每孔加入100微升10倍浓度的磁珠储备液，或使蛋白终浓度达到500纳摩尔。测定细菌培养物在600 nm处的光密度（OD 600）。通过将细菌培养物稀释至无色DMM培养基（不含添加剂）中，制备感染用培养基。

将含有 10%（体积比）胎牛血清的培养基预热至 37 摄氏度。为达到 MOI 为 10，每孔准备 1 毫升，每份样品额外准备 10 至 20% 的过量体积。吸除各孔中的旧培养基，并清洗培养细胞。

通过向每个孔中加入一毫升预热至37摄氏度的无菌PBS来恢复细胞。吸除PBS，每孔加入一毫升感染培养基。加入含有对照微珠和细菌的溶液作为阳性对照，以及含有黏附微珠但无细菌的溶液作为阴性对照。

加入含有0.1% TRITON X-100的DMM作为裂解对照。每个实验条件（包括对照）均设置三个重复。将培养板置于37°C的组织培养孵育箱中，孵育所需时间。

评估细胞毒性。感染后4小时，从24孔板的每个孔中移除200微升液体，并转移至新的96孔板中。

将96孔板在1,500 G下离心5分钟，然后从每个孔中转移100微升至新的96孔板中。向96孔板中的三个新孔加入100微升感染实验中使用的培养基，作为空白对照。使用LDH细胞毒性检测试剂盒，并按照制造商说明书进行乳酸脱氢酶释放实验。

首先，以25为增量计算所需试剂的用量。例如，对于100个样本，将11.25毫升的试剂A与250微升的试剂B混合，轻轻倒置混匀以避免产生泡沫，切勿涡旋震荡。

接下来，将混合物放入储液槽中。然后向每个样本中加入100微升试剂混合液，并在室温下分别孵育10、20和30分钟。使用酶标仪在490纳米处读取吸光度。

随后根据论文中所述方法计算细胞毒性的百分比。细菌黏附的测定在感染后一小时进行。移除细胞层中的培养基，并用无菌预热的 PBS 彻底清洗细胞层，以去除未黏附的细胞。每次使用一毫升 PBS，至少清洗三到四次。通过向每孔加入一毫升无菌的、含 1%（体积比）Triton X-100 的 PBS 溶液，使细胞裂解并释放出被感染的宿主细胞内容物，然后将培养板在 37°C 下孵育五分钟。

在将每个孔中的内容物转移至单独的1.5毫升离心管之前，需用移液器将各样品上下吹打数次。将样品用无菌PBS进行10倍系列稀释，取每种稀释样品100 µL接种于海洋LB琼脂平板上，使用细胞涂布器均匀涂布。根据细菌菌株及实验时间点，优化适宜的稀释倍数进行涂板。

10的5次方或10的6次方倍稀释可获得适量的菌落形成单位（CFUs）。将平板在37°C下孵育过夜，次日通过菌落计数法对细菌进行计数。在竞争实验中，Heela细胞被副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）毒株感染。

弱毒株在存在不同竞争实体的情况下表现出阳性或未被感染的特征。体外感染弱毒株导致极高水平的细胞裂解，这种裂解可被MAM7偶联的磁珠抑制，但不能被MA'AM1偶联磁珠或GST偶联磁珠抑制。对结合到未经处理的HELOC细胞或经MAM处理的细胞上的v麻痹病毒进行计数。

七种MAM单体或GST对照珠粒显示，MAM七聚体珠粒而非MAM单体或GST对照珠粒，能够竞争性抑制副溶血性弧菌与宿主细胞表面受体的结合。

与荧光偶联的黏附。四个标记的微珠可模拟细菌对宿主细胞的黏附，是细胞成像的有力工具。右侧的试管中含有荧光蓝色仿生微珠的悬浮液。MAM。

使用七个偶联的荧光蓝色珠子来表征MAM seven介导的细菌与上皮细胞的黏附过程。MAM seven与宿主细胞的黏附导致肌动蛋白重排以及应力纤维的形成，通过用Rumine Phin对F-肌动蛋白进行染色可实现共可视化观察。在此之后，可进一步采用亲和纯化联合蛋白质组学或蛋白质印迹等方法，以回答更多相关问题，例如哪些宿主细胞因子参与了细菌黏附下游的信号传导过程。