仿生材料表征细菌宿主相互作用
2015年11月16日
细菌附着在宿主细胞上是宿主定植和感染过程中的关键步骤。该方案描述了聚合物偶联重组粘附素的产生作为仿生材料，其允许分析单个粘附素对这些过程的贡献，独立于其他细菌因子。
该程序的总体目标是生产由纯重组粘附物组成的仿生材料，与聚苯乙烯珠偶联，然后可用于剖析单个细菌粘附物与宿主细胞受体之间的生化和功能相互作用。该方法可以帮助回答宿主病原体相互作用领域的关键问题，例如测量对宿主细胞信号传导的影响和抑制病原体介导的细胞毒性。该技术的主要优点是纯化的粘附 a AEA 与大小与细菌相似的聚合物颗粒定向共价偶联，从而模拟细菌表面显示。
与我们实验室的 TU A-C-E-D-A 博士生将一起演示该程序。这里将演示 thal 胺定向偶联。该方案适用于使用用于 p meli 苯基丁酸酯的 SUL 琥珀酰或SMPB 作为交联剂将含有胱氨酸的蛋白质偶联到胺功能化聚合物珠上，如方案文本中所述，在使用前准备所有必要的试剂，以开始珠子激活程序。
轻轻颠倒混合微珠悬浮液，然后将所需量的微珠悬浮液转移到无菌 1.5 mL 试管中。含有 1 毫升无菌 PBS，pH 7.0，轻轻上下移液，通过在微量离心机中离心来洗涤珠子和沉淀。Huge 用移液管小心地去除 snat 和疤痕。
Reese 将珠子沉淀悬浮在一毫升新鲜的无菌 PBS 中，然后重复洗涤步骤。重悬珠沉淀。在 0.8 毫升 PBS 中加入 200 微升新鲜制备的 10 毫摩尔 SFO SMPB。
要获得 2 毫摩尔的最终浓度，请在珠子孵育时，将微珠悬浮液在 25 摄氏度下在旋转轮上孵育 1 小时。为接下来的偶联步骤准备蛋白质，以便可以立即将其添加到活化的磁珠中。检查蛋白质浓度并将其调整至偶联反应所需的最终浓度。六。
蛋白质和 PBS 的微摩尔量以及 1 毫升的体积通常用于蛋白质还原。加入 TEP 储备溶液，得到最终浓度为 5 毫摩尔。将溶液孵育 30 分钟在室温下，保留几微升蛋白质溶液，以确定初始蛋白质浓度和计算偶联效率。
通过沉淀活化的磁珠并洗涤沉淀来开始蛋白质偶联程序。在一毫升新鲜、无菌 PBS 中后，将沉淀重新悬浮在制备好的蛋白质溶液中，以获得所需的蛋白质浓度。将蛋白珠悬浮液在 25 摄氏度下在旋转轮上孵育 2 小时两小时后，加入终浓度为 50 毫摩尔的西斯廷储备溶液，并在旋转轮上于 25 摄氏度下孵育至悬浮 30 分钟，使珠子上剩余的活化基团失活。
通过离心固定珠子。保留 snat 以确定蛋白质浓度和计算偶联效率。用 1 毫升 PBS 洗涤珠沉淀两次，然后用 Resus 弯曲和 1 毫升新鲜 PBS 在竞争测定前一天用 1 毫升浓度为每毫升 150， 000 个细胞的 hela 细胞接种 24 孔板的每个孔。
这将使细胞在开始实验之前达到大约 80% 的 co 流畅度。用新鲜的对位溶血 V 菌落接种 5 毫升海洋 LB 培养物，并在 30 摄氏度下摇动生长过夜。如前所述，准备足够的珠子偶联多价粘附分子。
在竞争测定当天，允许每孔添加 100 微升 10 x 微珠原液或终浓度为 500 纳摩尔的蛋白质。测量细菌培养物的 OD 600。通过将细菌培养物稀释到无色 DMM 中来制备感染培养基，无需添加剂。
预热至 37 摄氏度，含有 10% 体积到体积跳动悬浮液。要得到 10 的 MOI，每孔准备 1 毫升，每个样品制备 10% 至 20% 的过量体积。从孔中取出旧培养基并清洗培养物。
通过向每个孔中加入 1 毫升无菌 PBS 预热至 37 摄氏度来治愈细胞。去除 PBS 并每孔添加 1 毫升感染培养基。添加含有对照珠和细菌的溶液作为阳性对照，并添加粘附珠和无细菌的溶液作为阴性。控制。
添加含有 0.1%TRITTON X 100 的 DMM 作为裂解对照。设置每个实验条件，包括一式三份的对照。将板在 37 摄氏度的组织培养箱中孵育所需的时间。
评估细胞毒性。感染后 4 小时。从 24 孔板中使用的每个孔中取出 200 μL，然后转移到新的 96 孔板中。
将 96 孔板以 1， 500 G 离心 5 分钟，然后将每个孔中的 100 μL 转移到新的 96 孔板中。将 100 微升感染实验中使用的培养基添加到 96 孔板的三个新鲜孔中，用作空白。使用 LDH 细胞毒性检测试剂盒并按照制造商的说明进行乳酸脱氢酶释放测定。
首先，以 25 为增量计算所需的试剂量。例如，对于 100 个样本。将 11.25 毫升试剂 A 与 250 微升试剂 B 倒置以避免起泡，不要涡旋。
接下来，将混合物放入储液器中。然后向每个样品中加入 100 μL 试剂混合物，并在室温下孵育板 10、20 和 30 分钟。在读板器上读取 490 纳米处的吸光度。
随后计算手稿中描述的细胞毒性百分比，在感染后 1 小时进行细菌粘附的测量。从细胞层中取出培养基，并用无菌预热 PBS 彻底洗涤细胞层，以去除任何未附着的细胞。每次用 1 毫升 PBS 洗涤至少 3 到 4 次，向每个孔中加入 1 毫升无菌 1% 体积对体积的 Triton X 100 PBS 溶液，在 37 摄氏度下孵育板 5 分钟。
在将每个孔的内容物转移到分离之前，将每个样品上下移液数次。1.5 毫升管。将样品的 10 倍连续稀释液制备到无菌 PBS 板中，每个样品 100 微升放在海洋 LB 琼脂上，并使用细胞涂布器根据细菌菌株和该实验设置的时间点优化平板
稀释度。10 倍至第五倍或 10 倍至第六倍稀释将产生合适数量的 CFU。第二天将板在 37 摄氏度下孵育过夜，通过菌落计数计数细菌。在竞争试验中，高跟针细胞感染了 V para 溶血菌株。
差的 1 表示阳性或在存在不同竞争实体的情况下未感染。不良 1 的体外感染导致非常高水平的细胞裂解，这被 MAM 7 偶联珠子抑制，但 MA'AM 1 偶联或 GST 偶联珠子没有抑制。附着在未处理的 HELOC 细胞或与 MAM 一起孵育的细胞上的 v 麻痹物的计数。
7 个 MAM 1 或 GST 对照珠显示 MAM.7 个微珠，但不是 MAM 1 或 GST 对照微珠。在附着宿主细胞表面受体方面胜过 v 对位溶血药物。
粘附与氟耦合。四个标记的微珠可以模拟细菌与宿主细胞的粘附，是细胞成像的强大工具。右侧的试管包含荧光蓝色仿生珠的悬浮液。妈妈。
使用 7 个偶联的荧光蓝色珠子来表征 MAM 7 介导的附着到上皮细胞的过程。MAM 7 与宿主细胞的附着导致肌动蛋白重排和应力纤维的形成，使用 Rumine Phin 对 f 肌动蛋白进行染色时，可以共同可视化。在此程序之后，可以执行其他方法，如亲和纯化与蛋白质组学或蛋白质印迹相结合，以回答其他问题，例如哪些宿主细胞因子参与细菌附着下游的信号传导过程。
概述
本协议概述了生物模拟材料聚合物偶联重组粘附素的生成，用于研究细菌附着于宿主细胞。它允许分析单个粘附素对宿主定植和感染的贡献。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 宿主-病原体相互作用
- 生物材料
背景
- 细菌附着对感染和定植至关重要。
- 理解单个粘附素可以提供对细菌行为的洞察。
- 生物模拟材料可以模仿细菌表面以用于实验目的。
- 这种方法可以帮助阐明宿主细胞信号传导和细胞毒性机制。
研究目的
- 生产用于研究细菌粘附素的生物模拟材料。
- 分析细菌粘附素与宿主细胞受体之间的相互作用。
- 测量粘附素对宿主细胞信号传导的影响。
使用的方法
- 聚合物偶联重组粘附素的制备。
- 蛋白质与聚苯乙烯珠的偶联。
- 使用培养的宿主细胞进行感染测定。
- 通过乳酸脱氢酶释放测定评估细胞毒性。
主要结果
- 成功地将重组粘附素偶联到聚合物珠上。
- 证明了细菌粘附素与宿主细胞之间的相互作用。
- 测量了细菌感染对宿主细胞的细胞毒性效应。
结论
- 该方法为研究细菌粘附提供了一个稳健的平台。
- 获得的见解可以为预防细菌感染的策略提供信息。
- 未来的研究可以扩展个体粘附素在发病机制中的作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This biomimetic material approach enables precise dissection of individual bacterial adhesin functions, reducing confounding factors from complex pathogen surfaces. By isolating specific host-pathogen interactions, it supports target validation and mechanistic de-risking in anti-infective discovery. The method provides quantitative, reproducible readouts for adhesion and cytotoxicity, informing go/no-go decisions in early-stage antimicrobial programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of specific adhesin-receptor interactions to validate therapeutic targets.
- Operational Value: Uses purified recombinant proteins to eliminate interference from virulence factors.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target selection by clarifying mechanism of attachment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, covalently coupled beads for consistent adhesion assays.
- Operational Value: Allows directional immobilization ensuring functional protein orientation.
- Strategic Value: Creates scalable, reusable tools for high-throughput compound screening against adhesion.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Measures inhibition of pathogen-mediated cytotoxicity as a functional readout.
- Operational Value: Employs LDH release assay for quantifiable, plate-based cytotoxicity assessment.
- Strategic Value: Enables evaluation of lead compounds that block adhesion-dependent toxicity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to characterize virulence factors before lead optimization, providing mechanistic insight that informs target prioritization and assay readiness for downstream screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports functional validation of adhesins as drivers of host cell engagement.
- Screening: Delivers standardized biomimetic beads for reproducible adhesion and inhibition assays.
- Analytics: Provides quantitative outputs via CFU enumeration and LDH-based cytotoxicity measurements.
- Translational Research: Links adhesion inhibition to reduced cytotoxicity, supporting translational biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Coupling chemistry protocols allow adaptation across multiple adhesin targets and pathogen systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen interaction studies.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized bead activation and coupling procedures.
- Strategic Value: Improves confidence in target selection by de-risking adhesion mechanisms early.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of adhesin-targeted therapeutics based on functional validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, conjugation chemistry, and aseptic cell culture techniques.
- Dependent on access to microcentrifuges, rotating mixers, plate readers, and cytotoxicity detection kits.
- Necessitates standardization across teams for bead preparation, protein coupling efficiency, and assay timing.
- Must account for variability in adhesin solubility, coupling yield, and bead batch consistency.
- Limited to extracellular adhesins amenable to recombinant expression and chemical coupling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Chemical Coupling of Proteins to Polymer Beads
4:49
Use of Bead-coupled Adhesins in Competition Assays
7:04
Measurement of Cytotoxicity
8:42
Measurement of Bacterial Adhesion
10:17
Results: Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions
11:51
Conclusion
