人类前列腺上皮的激光捕获显微切割的RNA分析

该激光捕获显微解剖方案的总体目标是从异质性冷冻前列腺组织中的前列腺上皮细胞类型的纯群体中分离总 RNA，用于下游基因表达分析。该方法可以帮助分析患者标本并回答前列腺癌研究领域的关键问题，例如 RNA 表达在良性和疾病上皮假体组织样本或临床试验标本中有何不同。该技术的主要优点是激光捕获显微解剖能够从冷冻前列腺组织中分离均匀的上皮细胞或 str 细胞群的 RNA。

通常，刚接触这种方法的人将难以获得高质量的 RNA，因为他们不知道哪些步骤对于维持 RNA 至关重要。免费条件 首先收集程序所需的所有试剂和工具。让冷冻的前列腺组织在低温恒温器内平衡 30 分钟后，将封固剂喷入溶盒底部，并使用冷冻镊子快速封固组织。

将暗盒放入低温恒温器的冷却器中 5 分钟，以固定封固剂。凝固后，将冷冻的封固剂喷到卡盘上，然后小心地将封固的组织压入其中。底部朝上。

让准备工作凝固 5 分钟。在将卡盘放入支架之前，将手柄锁定到位并将新刀片插入低温恒温器。解锁手柄后，小心推进样品，直到达到所需的组织暴露。

准备好后，将低温恒温器调整到 5 微米并切割一两部分。将这些切片放在带电的载玻片上进行血红素和 eoin 染色。立即将玻片放入 100% 乙醇冷中 2 分钟。

在此之后，取下载玻片并在室温下干燥。h 和 d 染色的玻片可以更好地显示细胞核纹理，病理学家应使用它来标记感兴趣的区域。接下来，放置一个室温笔框。

滑入框架支架，将低温恒温器调整到 10 微米并创建切片。每个载玻片上可以放置 1 到 4 个切片，具体取决于组织大小。立即将玻片浸入冷的 100% 乙醇中。

两分钟后取出玻片并存放在冰箱中以备后用。在激光捕获显微解剖的同一天，从无 RNA 区域的冰箱中取出笔框载玻片。将载玻片轻轻浸入 90% 乙醇中 2 分钟，然后浸入 75% 乙醇中 2 分钟，使载玻片水合。

水合后，将载玻片轻轻浸入 0.5% 甲苯蓝中 5 至 30 秒，对前列腺组织进行染色。在深水中洗涤载玻片两次，每次 15 秒，然后用 75% 乙醇洗涤 30 秒至 3 分钟，以滞留组织。最后，将笔框载玻片转移到冰上不含 RNA 的干燥容器中。

在开始手术之前，将玻片放在玻片加热器上晾干 15 分钟。仅干燥将要处理的载玻片，并将其余部分存放在冰上以备不时之需。按以下顺序打开 LCM 组件。

显微镜功率、激光键、激光开关，然后是计算机。接下来，使用该软件启动激光显微切割软件。提示显微镜加载载玻片和收集管。

单击卸载样品架，然后将载玻片加载到载玻片架上，组织朝下。将玻片架插入显微镜中的相应插槽中，然后单击继续。接下来，单击 unload collection tubes（卸载收集管）。

标记试管并将试管装入试管支架上，然后插入适当的插槽中。盖上盖子并加入 35 μL 裂解缓冲液。注意避免气泡。

加载收集上限后，单击 确定。使用软件选择载玻片在支架中的位置，然后选择收集盖以收集标本。通过计算机以 10 倍放大倍率可视化和聚焦载玻片。

使用软件通过选择 laser 来校准激光。然后校准，通过选择激光器调整激光器的功率孔径和速度，然后控制。继续进行调整，直到激光完全切穿组织。

概述通常由董事会认证的病理学家完成的感兴趣区域至关重要，以便准确解剖接受 LCM 的组织的理想区域 使用 8 x 11 h 和 e 病理学家标记作为视觉指南。使用软件中的绘制形状工具在视图中限定所需的上皮区域，并避免收集任何基质。单击"剪切"以启动激光。

如果某个区域未完全剪切，请使用移动和剪切工具手动检查该区域。继续将物镜移动到新的视图并重复激光切割，直到完全解剖载玻片或收集到所需数量的组织。完成后，小心地从收集架中取出试管并盖上盖子，注意盖子中的裂解、缓冲液和组织。

简而言之，离心 30 秒以收集试管底部的液体和组织。将样品在 42 摄氏度下孵育 30 分钟，并在零下 80 摄氏度下储存，直到准备好进行 RNA 分离。这些示例显示了激光捕获良性上皮细胞类型特异性对照前后笔框载玻片上具有代表性的甲苯胺蓝染色前列腺切片。

确认激光捕获的组织区域的特异性。良性上皮和基质。不要表达前列腺癌特异性基因 A-M-A-C-R。

基质不表达上皮特异性基因和 KX 3.1 在尝试此程序时。重要的是要记住在无 RNA 的环境中工作以防止 RNA 降解。观看此视频后，您应该对如何从冷冻组织中的同质上皮细胞群或风暴细胞群中分离 RNA 有很好的了解，以用于多种下游分析技术。

不要忘记，使用低温恒温器在预防措施方面可能非常危险，例如在执行此程序时应始终进行良好的培训和对刀片的极好关注。