无细胞化验，研究染色质解聚在有丝分裂的结束

该实验的总体目标是以无细胞测定的简单方式忠实地重构有丝分裂结束时发生的凝聚染色质。这种方法可以帮助回答有丝分裂研究领域的关键问题，因为它能够表征染色质的分子机制、去定植和鉴定参与调节的因子。该技术的主要优点是它可以很容易地进行生化作和染色质。

去定植可以与其他细胞周期事件分开单独研究。首先从 helo 细胞中分离有丝分裂染色质簇，并准备用于制备 IIC 非洲爪蟾卵提取物的缓冲液，如随附的文本方案中所述。准备好后，使用配备 27 号针头的 5 毫升注射器将 500 国际单位的人绒毛膜促性腺激素注射到排卵诱导的青蛙体内。

在实验前一天晚上将青蛙注射到背侧淋巴囊的皮肤下，以诱导卵的释放 诱导后，将青蛙在 18 摄氏度下放置 13 至 17 小时，这些水箱中含有 1.2 升 mark 改良的林格缓冲液。青蛙产卵后，取出已经激活的鸡蛋以及任何看起来不好的鸡蛋。通过将罐倒入 600 至 1000 毫升玻璃烧杯中正确收集它们。

对鸡蛋进行分类至关重要，因为整体额外质量取决于步骤。取出活化的粘稠和其他看起来不好的鸡蛋。同样在后续步骤中，继续去除坏蛋。

种蛋沉淀后倒出 S 上清液，然后用新鲜缓冲液重新填充烧杯。重复此过程四次，以便在最后一次洗涤后清洗鸡蛋。再次取出旋囊，然后在烧杯中加入 2% L 半胱氨酸溶液以勾勒出鸡蛋。

2 到 4 分钟后，更换为含有 L 半胱氨酸的新鲜缓冲液。当鸡蛋的体积急剧减少，并且鸡蛋在大约 5 到 7 分钟后变得更加密集时，请考虑完全脱胶。接下来，通过在烧杯壁上倾析并重新填充缓冲液，小心地在 mark 改良的林格缓冲液中清洗鸡蛋，而不是直接填充到鸡蛋上。

然后在 100 毫升含有 8 微升每毫升 2 毫克的 Marx 改良林格缓冲液中激活鸡蛋。钙离子。四、当动物帽收缩变得明显时停止激活。

或者在激活后 10 分钟后，在 mark 改良的林格氏液中小心洗涤鸡蛋，通过醒酒缓冲并在最后一次洗涤后重新填充缓冲液 supinate。将种蛋在室温下在 mark 改良的林格缓冲液中孵育 20 分钟。接下来，用 50 微升蔗糖缓冲液、50 微升 100 倍蛋白酶抑制剂制备 5 毫升离心管。

混合 5 微升一摩尔 DTT、12.5 微升 cyclo heide 和 2.5 微升细胞。B.用冷蔗糖缓冲液洗涤鸡蛋两次，然后转移到离心管中。使用宽口塑料牧场移液器，以 130 G 离心管子 1 分钟，包装鸡蛋，离心后，使用塑料牧场移液器去除多余的缓冲液，并用更多的鸡蛋填充额外的房间。

然后将装满鸡蛋的试管放入 6 x 5 毫升的旋转转子中，在 4 摄氏度和 21， 000 倍 g 下离心 20 分钟。现在将溶液分成三层，将带有 16 号针头的 5 毫升注射器穿过试管的侧面，推入顶部黄色蛋黄和底部深色碎蛋碎屑之间的中间层。将低速相提取物转移到冰上的新试管中，然后加入 10 微升 100 倍蛋白酶抑制剂。

混合 1 微升一磨牙 DTT、2.5 微升 20 毫克/毫升的 Cyclo heide 和 0.5 微升细胞 B.向每毫升低速提取物中加入 10 毫克/毫升。在 10 x 2 ml 转子中，以 355， 000 倍 G 的速度旋转低速相萃取物 12 分钟。然后轻轻去除顶部的脂质层，并将含有高速提取物的螺旋体转移到新管中。

此步骤对于生产高质量样品至关重要。注意去除的液体不含来自顶部脂质层或恼人的底层的污染物。将 18 微升高速提取物移液到 1.5 毫升反应管中，然后加入 0.5 微升糖原 0.5 微升能量混合物。

第 3 点，6 微升二甲基嘌呤和 0.7 微升有丝分裂簇。加入染色质后，使用开口较大的吸头混合反应物，以防止剪切去补偿染色质。混合后，将反应混合物在 20 摄氏度下孵育长达两个小时。

然后加入 0.5 毫升冰冷的固定剂，其中含有 4%的石蜡醛、0.5% 戊二醛和 0.1 毫克/毫升 dpi，以固定样品。使用开口较大的吸头，将样品在冰上孵育 20 至 30 分钟。接下来，用 0.1% 重量比的聚 L 赖氨酸溶液对 12 毫米圆形盖玻片进行编码，并将盖玻片孵育 5 分钟，以增加盖玻片的亲和力。

为了干燥染色质，然后将盖玻片放在滤纸上。干燥后，将涂层盖玻片添加到 6 毫升平底离心管的底部，使涂层面朝上。然后加入 800 微升 30% 蔗糖垫，将整个固定样品铺在上面。

将样品在 4 摄氏度和 2， 500 倍 G 下旋转 15 分钟，然后用 16 号针头小心地戳离心管底部，去除 S 上清液并从试管中取出盖玻片。当盖玻片被一侧的针头提起时，用镊子取下盖玻片，将盖玻片浸入去离子水中快速清洗，然后将其侧面接触滤纸轻轻擦干。接下来，将一滴封固剂放在显微镜载玻片上，并降低盖子的样品侧。

滑到封固介质上。用纸擦干盖玻片边缘的指甲油密封，轻轻擦干盖玻片，并将玻片置于黑暗中直至成像。这是失代偿测定的典型时间过程。

在反应开始时可见的染色体簇 decon 凝结并合并成一个圆形光滑的细胞核。当鸡蛋提取物被蔗糖缓冲液取代时，染色体簇保持浓缩，这表明鸡蛋提取物中存在失代偿活性。在此处所示的实验中，向反应中加入非水解 A TP 或 GTP 类似物。

这两种添加剂都抑制了去缩合，证明该活性过程既依赖于 A TP 又依赖于 GTP 水解。一旦掌握，这项技术可以在大约两个小时内完成，用于新加坡水平的卵子提取物制备，以及三个小时的促进去定植测定。在尝试此过程时，请务必记住，成功在很大程度上取决于数据提取质量。

特别是对于免疫耗竭，建议按照此程序使用新鲜制备的提取物。可以执行其他方法，如免疫耗竭和添加重组蛋白，以回答其他问题，例如涉及哪些因素。这项技术将为有丝分裂或核结构和功能领域的研究人员铺平道路，以探索动物细胞有丝分裂结束时发生的染色质非人化。

看完这个视频，你应该对如何制备非洲爪蟾肝卵提取物以及如何应用该方法重建染色质去定植有了很好的了解。不要忘记，与 Paraform Hyde、Hyde 和 DARPA 合作可能是危险的，应采取预防措施，例如戴手套。