Name: 无细胞化验，研究染色质解聚在有丝分裂的结束 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 学习利用HeLa细胞与非洲爪蟾卵提取物进行无细胞染色质解聚实验，以研究有丝分裂末期染色质动态调控的分子机制。该方法可实现生化操控并分离研究染色质解聚过程。

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本工作得到了德国研究基金会和欧洲研究委员会（W.A. 获资助编号 AN377/3-2 和 309528 CHROMDECON）以及勃林格殷格翰基金会博士奖学金（A.K.S.）的支持。图 1 &amp;#38; 2 来自《发育细胞》的转载 31(3)，Magalska 等，RuvB样ATP酶在有丝分裂末期的染色质去凝集过程中发挥作用，305-318，2014年，经Elsevier许可转载。

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<li>Gasser, S. M., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+the+isolation+of+individual+and+clustered+mitotic+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Improved methods for the isolation of individual and clustered mitotic chromosomes.</a> Exp Cell Res. 173, 85-98 (1987).</li>
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<li>Wignall, S. M., Deehan, R., Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+condensin+complex+is+required+for+proper+spindle+assembly+and+chromosome+segregation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The condensin complex is required for proper spindle assembly and chromosome segregation in Xenopus egg extracts.</a> J Cell Biol. 161, 1041-1051 (2003).</li>
<li>Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+nucleus-like+structures+around+bacteriophage+DNA+microinjected+into+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs.</a> Cell. 34, 13-23 (1983).</li>
<li>Hartl, P., Olson, E., Dang, T., Forbes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+assembly+with+lambda+DNA+in+fractionated+Xenopus+egg+extracts%3A+an+unexpected+role+for+glycogen+in+formation+of+a+higher+order+chromatin+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear assembly with lambda DNA in fractionated Xenopus egg extracts: an unexpected role for glycogen in formation of a higher order chromatin intermediate.</a> J Cell Biol. 124, 235-248 (1994).</li>
<li>Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+by+nucleosomes+but+not+H1+in+reconstituted+preblastoderm+Drosophila+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression by nucleosomes but not H1 in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin.</a> EMBO J. 13, 373-379 (1994).</li>
<li>Ulbert, S., Platani, M., Boue, S., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+membrane+protein-DNA+interactions+required+early+in+nuclear+envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct membrane protein-DNA interactions required early in nuclear envelope assembly.</a> J Cell Biol. 173, 469-476 (2006).</li>
<li>Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin-independent+nuclear+envelope+assembly+induced+by+Ran+GTPase+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin-independent nuclear envelope assembly induced by Ran GTPase in Xenopus egg extracts.</a> Science. 288, 1429-1432 (2000).</li>
<li>Paulson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+chromosome+clusters+from+metaphase-arrested+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Isolation of chromosome clusters from metaphase-arrested HeLa cells.</a> Chromosoma. 85, 571-581 (1982).</li>
<li>Ramadan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc48%2Fp97+promotes+reformation+of+the+nucleus+by+extracting+the+kinase+Aurora+B+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cdc48/p97 promotes reformation of the nucleus by extracting the kinase Aurora B from chromatin.</a> Nature. 450, 1258-1262 (2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Xenopus laevis 卵母细胞提取物是真实再现细胞过程的非常有用的工具 体外，并且该系统已成功用于细胞周期和细胞分裂事件的表征 2,3,5,6,17由于在卵子发生过程中卵细胞内储存了大量细胞核组分，因此卵提取物是获取细胞成分的优良来源。与哺乳动物组织细胞系中的RNA干扰或遗传操作等其他方法相比，该系统具有多项优势：无细胞体系可使研究者在不受细胞存活性限制的情况下研究细胞过程；此外，复杂过程中的各个独立步骤亦可通过简单的实验体系进行分析。本文所介绍的染色质去凝集实验，可特异性地研究有丝分裂后染色质去凝集的分子机制，且不受其他有丝分裂事件的干扰。 非洲爪蟾 卵母细胞提取物易于通过去除特定蛋白质以及添加抑制剂或突变蛋白进行操作 8例如， 图2 显示了在去凝集实验中加入不可水解的ATP或GTP类似物ATPγS和GTPγS的结果。通过稀释和差速离心法 非洲爪蟾 卵子组分（如膜和胞质溶胶）可以被分离 16. 图3 显...

Xenopus laevis 卵提取物是一种强大且广泛应用的工具，可在无细胞体系的简化条件下研究复杂的细胞事件。自 Lohka & Masui1首次描述以来，该体系已被广泛用于研究有丝分裂过程，如染色质凝缩2、纺锤体组装3、核膜破裂4，以及核质运输5或DNA复制6。相比之下，有丝分裂末期发生的、对间期细胞核重建至关重要的事件，如核膜重建和核孔复合体的重新组装，其机制尚不清楚，但同样可利用Xenopus卵提取物进行研究7。我们近期建立了一种基于Xenopus卵提取物的实验方法，用于研究有丝分裂末期的染色质去凝缩过程8，这一过程尚未得到充分研究，有待深入表征。
在多细胞动物中，染色质在进入有丝分裂时高度凝缩，以确保遗传物质能够准确分离。为了保证在间期染色质可被基因表达和DNA复制所利用，必须在有丝分裂末期使其去凝缩。在脊椎动物中，有丝分裂期的染色质凝缩程度相比间期可高达五十倍 9与酵母中通常低得多的有丝分裂压缩程度相比， 例如， 仅两倍于 S. cerevisiae 10脊椎动物染色质去凝集的研究主要集中于卵子受精后精子DNA的重组过程。其分子机制涉及核质素（nucleoplasmin）——一种在卵母细胞中含量丰富的蛋白质——将精子特异性的鱼精蛋白置换为卵子中储存的组蛋白H2A和H2B。该过程亦通过以下方法得以阐明： 非洲爪蟾 卵提取物 11,12然而，核质素的表达仅限于卵母细胞 13 有丝分裂期的染色质不含这些精子特异性的鱼精蛋白。因此，有丝分裂末期的染色质去凝集过程不依赖于核质素 8.
对于 体外 解聚反应，我们采用由活化物制备的提取物 X.laevis 来自同步化HeLa细胞的卵母细胞和染色质簇。用钙离子载体处理卵母细胞可模拟受精过程中精子进入所引发的卵细胞内钙离子释放。钙波触发细胞周期的恢复，使停滞在减数第二次分裂中期的卵母细胞进入第一次间期。 14因此，由激活的卵细胞制备的卵提取物代表了有丝分裂退出/间期状态，能够诱导有丝分裂退出特异事件的发生，如染色质去凝集、核膜及核孔复合体的重新形成。为了分离有丝分裂染色质簇，我们采用了一种略作修改的Gasser发表的实验方案 &amp;#38; Laemmli 15，其中通过梯度离心法在含多胺缓冲液中分离经有丝分裂同步化的HeLa细胞，经裂解后释放染色体簇。

<table><tbody><tr><td>亚精胺四盐酸盐</td><td>Fluka analytical</td><td>85610-25G</td><td></td></tr><tr><td>精胺三盐酸盐</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S2501-5G</td><td></td></tr><tr><td>高纯度皂苷</td><td>Millipore</td><td>300410-1GM</td><td>有毒</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Applichem</td><td>A0999,0100</td><td>有毒</td></tr><tr><td>胸腺嘧啶</td><td>Calbiochem</td><td>6060</td><td></td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td>Calbiochem</td><td>487928</td><td>有毒</td></tr><tr><td>37% 甲醛溶液</td><td>Roth</td><td>7398-1</td><td>有毒</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液 (0.4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>有毒</td></tr><tr><td>1,4-二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.2</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF 盐酸盐</td><td>Applichem</td><td>A1421,0001</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂</td><td>Roth</td><td>2936.1/2/3</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Roth</td><td>CN334</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>Percoll（胶体二氧化硅颗粒溶液）</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&amp;sup2; 组织培养瓶</td><td>Greiner Bio-one</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>匀浆器 (40 ml 组织研磨器)</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板（Neubauer 计数室）</td><td>Assistent</td><td>441/1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;橡树岭离心管，聚碳酸酯材质 (50 ml)</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 细胞筛，尼龙材质</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素 B</td><td>Applichem</td><td>A7657,0010</td><td>有毒</td></tr><tr><td>放线菌酮</td><td>Roth</td><td>8682.3</td><td>有毒</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Merck</td><td>1,028,381,000</td><td></td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素 (hCG)，商品名 Ovogest</td><td>MSD</td><td>1431593</td><td></td></tr><tr><td>孕马血清促性腺激素 (PMSG)，商品名 Intergonan</td><td>MSD</td><td>1431015</td><td></td></tr><tr><td>A23187（钙镁混合盐）</td><td>Enzo</td><td>ALX-450-002-M010</td><td>有毒</td></tr><tr><td>注射器针头 (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2&quot;)</td><td>Braun</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Serva</td><td>10920.03</td><td></td></tr><tr><td>GTP, 2 Na x 3 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Roth</td><td>K056.1/2/3/4</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸二钠盐</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>肌酸磷酸激酶</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Sigma</td><td>D2629-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛 (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td>有毒</td></tr><tr><td>TLA 100 用离心管 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>&quot;Cell-Saver&quot;（带宽口吸头，1,000 &amp;micro;l）</td><td>Biozym</td><td>729065</td><td></td></tr><tr><td>50% 戊二醛溶液，I 级</td><td>Sigma alderich</td><td>G7651-10 ml</td><td>有毒</td></tr><tr><td>0.1% (w/v) 聚-L-赖氨酸溶液</td><td>Sigma</td><td>P8920-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>平底管 (6 ml, 16.0/55 mm)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>145211</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂</td><td>Vector laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>TLA120 用离心管 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>&quot;Cell-Saver&quot;（带宽口吸头，200 &amp;micro;l）</td><td>Biozym</td><td>729055</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>0784 #1</td><td></td></tr></tbody></table>

一种无细胞体系检测方法用于研究有丝分裂末期染色质去凝集过程

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

在脊椎动物细胞周期中，染色质经历广泛的结构与功能变化。进入有丝分裂期时，染色质高度凝缩为棒状染色体，并由有丝分裂纺锤体装置独立移动。有丝分裂期间的染色质凝缩使染色体的致密程度比间期增加约五十倍。在退出有丝分裂时，染色体必须重建其功能性的间期状态，该状态由核膜包被，并具备进行DNA复制和转录的能力。染色质去凝缩过程在形态学上已有较清晰的描述，但在分子层面仍知之甚少：我们目前缺乏对潜在分子事件的了解，以及在很大程度上仍不清楚参与该过程的因子及其调控机制。本文描述了一种无细胞体系，能够真实地重现染色质去凝缩过程 体外，基于从同步化的HeLa细胞中纯化的有丝分裂染色质簇 X. laevis 卵提取物。我们的无细胞体系为进一步在分子水平上表征染色质去凝集及其与有丝分裂退出过程中同步发生的其他事件（如核膜和核孔复合体的重新组装）之间的协调机制提供了重要工具。

解凝聚反应的时间依赖性
图1 显示了染色体去凝集实验的典型时间过程。反应开始时可见的染色体簇逐渐去凝集，并融合成一个单一、圆形且表面光滑的细胞核。当用蔗糖缓冲液替代卵母细胞提取物时，染色体簇仍保持凝集状态，这表明去凝集活性存在于卵母细胞提取物中。
染色质去凝集是一个依赖能量的过程
该 体外 去凝聚反应可被方便地操控 例如，&#160;通过添加抑制剂。在下图所示的实验中 图2，不可水解的ATP或GTP类似物，ATP&#947;S 或 GTP&#947;S 被加入反应体系中，两者均抑制了解聚过程，表明该过程是依赖 ATP 和 GTP 的主动过程（图2).
染色质去凝集与核膜重建可被分离
在有或无膜存在的情况下进行了染色质去凝缩实验...

染色体高度凝缩的有丝分裂染色质去凝缩的分子机制尚不明确。我们提出一种基于从HeLa细胞分离的有丝分裂染色质簇建立的无细胞检测方法 Xenopus laevis 能够真实重建解凝过程的卵提取物 体外.

在脊椎动物细胞周期中，染色质会发生广泛的结构和功能变化。进入有丝分裂期时，染色质会大规模凝缩成棒状结构……

本实验的总体目标是在无细胞体系的简化条件下，真实地重建有丝分裂末期发生的染色质去浓缩过程。该方法有助于回答有丝分裂研究领域中的关键问题，因为它能够表征染色质去浓缩的分子机制，并鉴定参与调控的相关因子。该技术的主要优势在于其易于进行生物化学操作，并可直接对染色质进行处理。可以将去定植过程与其他细胞周期事件分离开来单独研究。首先，从helo细胞中分离有丝分裂染色质簇，并按照配套文字方案中的描述，制备用于IIC非洲爪蟾（xenopus lavis）卵提取物的缓冲液。制备完成后，使用配备27号针头的5毫升注射器，向已诱导排卵的青蛙注射500国际单位的人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin）。在实验前一晚，向青蛙背部淋巴囊的皮下注射，以诱导其排卵。诱导后，将青蛙置于含有1.2升Mark改良Ringer缓冲液的独立饲养罐中，在18摄氏度下静置13至17小时。青蛙产卵后，去除已经激活的卵以及外观异常的卵。通过将饲养罐中的液体倒入600至1000毫升的玻璃烧杯中来收集卵，并操作得当。对卵进行筛选至关重要，因为整体的额外质量取决于此步骤。去除已激活的呈丝状或外观不良的卵。在后续步骤中，也需持续剔除不良的卵。待卵子沉淀后，倾去S上清液，然后用新鲜缓冲液重新注满烧杯。在最后一次清洗后，重复此清洗过程共四次。再次移除上清液后，向烧杯中加入2% L-半胱氨酸溶液以解剖卵子。两到四分钟后，更换为含有L-半胱氨酸的新鲜缓冲液。当卵子体积显著缩小且在大约五到七分钟后变得更为紧密聚集时，可认为脱胶已完成。随后，使用马克改良林格缓冲液小心洗涤卵子，通过倾倒并重新加入缓冲液进行，注意将缓冲液沿烧杯壁缓缓注入，避免直接冲到卵子上。然后将卵在含有八微升（2毫克/毫升）钙离子的100毫升Marx改良Ringer缓冲液中激活。四、当动物极帽收缩变得可见时，停止激活。或者在激活后10分钟，通过倾倒并重新填充Mark's改良Ringer液缓冲液，小心洗涤卵子，最后一次洗涤后将缓冲液置于上清。将卵子在室温下于Mark's改良Ringer液缓冲液中孵育20分钟。接着，准备5毫升离心管，每管中加入50微升蔗糖缓冲液和50微升100倍蛋白酶抑制剂。取5 µL 1 M DTT、12.5 µL 环己亚胺和2.5 µL 细胞松弛素B。用冷蔗糖缓冲液洗涤卵子两次，然后将其转移至离心管中。使用开口较宽的塑料移液管，将卵子装入管中，在130 ×g下离心1分钟。离心后，用塑料移液管吸除多余缓冲液，并用更多卵子填充管中空余空间。然后将装有卵的试管在4°C条件下，以21,000 × g离心20分钟，使用六孔5毫升水平转子转子。待溶液分为三层后，将带有16号针头的5毫升注射器从试管侧壁插入，进入中层，即上层黄色蛋黄与下层深色破碎卵物质之间的区域。将低速相提取物转移至预冷的新试管中，随后加入10微升100倍浓度的蛋白酶抑制剂。取1微升1摩尔的DTT、2.5微升浓度为20毫克/毫升的环己亚胺，以及0.5微升细胞松弛素B，加入每毫升低速提取液中，使终浓度为10毫克/毫升。将低速相提取液在10×2毫升转子中以355,000 ×g离心12分钟。然后轻柔地移除顶部的脂质层，并将含有高速提取物的上清液转移至新的离心管中。此步骤对于获得高质量样品至关重要。吸取液体时需注意避免混入顶部的脂质层或底部难处理的沉淀物。将18 µL高速提取液移入1.5 mL反应管中，然后加入0.5 µL糖原和0.5 µL能量混合液。6微升六甲基嘌呤和0.7微升有丝分裂簇。在染色质加入后，立即使用带宽口的枪头混匀反应体系，以防止去凝聚的染色质发生剪切。混匀后，将反应体系在20摄氏度孵育最多2小时。然后，加入0.5毫升冰上预冷的固定液（含4%多聚甲醛、0.5%戊二醛和0.1毫克/毫升dpi）对样品进行固定。使用开口较宽的枪头，将样品在冰上孵育20至30分钟。接下来，用0.1%（重量/体积）的聚-L-赖氨酸溶液对12毫米圆形盖玻片进行编码处理，并将盖玻片孵育5分钟，以增强其黏附性。随后将盖玻片在滤纸上晾干以用于染色质实验。待其干燥后，将涂有材料的盖玻片放入6 mL平底离心管底部，确保涂层面向上。然后加入800 µL的30%蔗糖垫层，并将整个固定样品叠加在其上方。将样品在4°C、2,500 ×g 条件下离心15分钟。随后弃去上清液S，并用16号针头轻轻刺入离心管底部，使盖玻片松动。当针头将盖玻片一侧挑起后，用镊子夹出盖玻片，将其浸入去离子水中快速清洗，然后用滤纸轻触其侧面进行温和干燥。接着，在显微镜载玻片上滴加一滴封片剂，将盖玻片的样品面向下缓慢放置于其上。将盖玻片置于封片剂上，用纸巾轻轻吸干，再用指甲油在盖玻片边缘密封，将载玻片置于避光环境中，直至成像。以下是去代偿实验的典型时间进程。在反应开始时可见的染色体簇会逐渐凝缩并融合成一个单一、圆形且表面光滑的细胞核。当用蔗糖缓冲液替换卵提取物后，染色体簇仍保持凝缩状态，这表明卵提取物中含有去浓缩活性成分。在本实验中，向反应体系中添加了不能水解的ATP或GTP类似物。这两种添加剂均能抑制解凝聚过程，证明该活性过程依赖于ATP和GTP的水解。掌握该技术后，新加坡品系卵提取物的制备大约需要两个小时，而促进去定植实验则需要三个小时。在进行该操作时，必须牢记，实验成功与否关键取决于提取物的质量。尤其对于免疫耗竭实验，建议按照本方案制备新鲜的提取物。还可采用其他方法，如免疫耗竭或添加重组蛋白，以回答其他问题，例如哪些因子参与其中。该技术将为有丝分裂及细胞核结构与功能领域的研究人员探索动物细胞有丝分裂末期发生的染色质去人源化现象提供重要途径。观看本视频后，您应充分了解如何制备异源非洲爪蟾肝卵提取物，以及如何应用该方法重建染色质去凝聚化过程。请务必注意，操作中涉及的多聚甲醛、肼和 DARPA 可能具有危险性，应采取预防措施，例如佩戴手套。

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