可溶和不可溶α-突触核蛋白从帕金森脑连续提取
January 5th, 2016
在这里，我们提出了一种从死后人脑组织中分离越来越不溶/聚集的 α-突触核蛋白 （α-syn） 的方案。通过使用洗涤剂强度增加的缓冲液和高速超速离心技术，可以检查患病和非患病组织中 α-syn 聚集的可变特性。
该方法的总体目标是从死后帕金森病大脑中提取可溶性和不溶性 α-突触核蛋白。这种方法可以帮助回答帕金森病研究中的关键问题。该技术的主要优点是它是一种使用常见实验室试剂和仪器的相对简单的技术。
准备好必要的溶液和缓冲液后，首先将 0.5 g 冷冻基底神经节组织样品放在一个小培养皿上。使用无菌手术刀刀片快速切成一毫米见方的碎片。将切碎的组织收集到 15 毫升试管中，并向试管中加入 10 体积的冰冷的 1X TBS。
使用机械均质器以 20， 000 rpm 的速度匀浆样品 10 秒。然后在冰上冷却 2 分钟。重复均质化 3 次，每次在冰上冷却。
将匀浆在 4 摄氏度下以 10， 000 g 离心 5 分钟。将粗匀浆上清液转移至聚碳酸酯离心管中，并在 4 摄氏度下以 100， 000 gs 离心 1 小时。将上清液转移到冰上的冷却管中，并将其保留为 TBS 可溶性组分。
在 5 倍体积的 1X TBS 缓冲液中洗涤，并在 4 摄氏度下以 100， 000 gs 离心 15 分钟。吸出并丢弃上清液。然后重复洗涤。
在超速离心步骤之间彻底洗涤沉淀对于该程序的成功至关重要。让样品达到 10 摄氏度的温度以避免 SDS 沉淀后，加入 5 体积的 1X TBS-SDS，并在室温下以 20 kHz 的波长超声处理 10 秒，重新悬浮最终沉淀。在 25 摄氏度下以 100， 000 gs 超速离心 30 分钟。
超速离心后，将上清液转移到冰上的冷却管中，并保留为 SDS 可溶性组分。向沉淀中加入 5 体积的室温 1X TBS-SDS 缓冲液，并在 25 摄氏度下以 100， 000 gs 离心 15 分钟。丢弃洗涤缓冲液，然后重复洗涤。
弃去上清液后，加入 50 μL 1X TBS-SDS-尿素，并使用设置为 20 kHz 的超声仪溶解 10 秒。将此样品标记为尿素可溶性馏分。必须彻底确保在程序中提取所有不溶性蛋白质。
用 1X TBS 缓冲液一对一稀释 TBS-SDS-尿素样品，以便与蛋白质检测试剂兼容，并根据制造商的方案使用市售蛋白质检测试剂盒检测每个组分的总蛋白含量。将样品分装成 20 微升等分试样，加入 10% 甘油，以减少未来的冻融循环，并在负 80 摄氏度下储存。使用标准技术，将 10 微升 TBS、TBS-SDS 和 TBS-SDS-尿素提取物加载到 10 孔、4% 至 12% Bis-Tris 聚丙烯酰胺凝胶上，以 MOPS 作为运行缓冲液。
在 200 伏特下电泳 1 小时，或直到上样缓冲液中的蓝色染料到达凝胶底部。在 100% 甲醇中润湿尼龙膜，然后浸泡在含有 20% 甲醇的转印缓冲液中。在印迹上做一个识别标记，以确定蛋白质侧和分子量大小标记的方向。
将凝胶与膜与湿滤纸夹在一起。在 40 伏特下执行传输 2 小时。将 5% BSA 溶液溶于 1X PBS-T 中，以 70 rpm 的速度摇动封闭 30 分钟，以防止一抗与膜发生非特异性结合。
通过在 4 摄氏度下与 6 毫升 α-突触核蛋白一抗 Syn-1 在 PBS-T 中稀释 1 至 750 过夜来探测蛋白质印迹。第二天，用 1X PBS-T 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。然后将印迹与在 PBS-T 中稀释 1 至 2， 000 的适当 HRP 偶联二抗孵育 30 分钟。
像以前一样用 1X PBS-T 洗涤膜。根据制造商的说明，将印迹浸入暗室中的增强化学发光溶液中。用保鲜膜覆盖印迹，并使用放射自显影法捕获信号。
成像后，将蛋白质印迹与 6 mL 蛋白质印迹剥离缓冲液孵育 10 分钟，同时不断摇动以去除 α-突触核蛋白抗体信号的印迹。重复蛋白质印迹程序，用 1 至 8， 000 稀释度的 β-肌动蛋白一抗探测膜。扫描最终图像并将其转换为 Tiff 图像，并使用 NIH ImageJ 测量密度以进行定量。
下图是来自 PD 和对照人基底神经节组织的 α-突触核蛋白水平的代表性免疫印迹。使用 western immunoblot 分析 TBS 、 SDS 和尿素可溶性组分是否存在 α-突触核蛋白。将 10 mg 蛋白质加载到每个泳道中。
在 TBS 组分中，α-突触核蛋白单体存在于所有情况下。星号可能代表 α-突触核蛋白的 C 端截短形式。在 SDS 组分中，可以看到一些 α-突触核蛋白的寡聚体以及单体，由 PD 组织中的实心箭头表示。
在尿素组分中，单体、寡聚体和聚集的 α-突触核蛋白在 PD 病例中表达可变，反映了它们各自的路易体负荷。神经学正常的对照样品显示仅存在少量单体 α-突触核蛋白。一旦掌握，这种蛋白质提取技术可以在一个工作日内完成，如果作得当，第二天可以进行蛋白质免疫印迹。
开发后，这项技术为路易体生物学领域的研究人员探索病理人体组织和体内动物模型中的不溶性和聚集性 α-突触核蛋白物种铺平了道路。不要忘记，处理未固定的人体组织需要采取预防措施，并且在所有处理程序中都应全程佩戴手套和实验室外套。
概述
本文介绍了一种从死后人类脑组织中分离α-突触核蛋白的协议，重点关注其在帕金森病中的聚集性质。该方法采用不同强度的洗涤剂和超速离心技术来分析α-突触核蛋白的可溶和不可溶形式。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 帕金森病研究
背景
- α-突触核蛋白是帕金森病中的关键蛋白。
- 了解其聚集可以提供对疾病机制的洞察。
- 该研究利用死后人类脑组织进行分析。
- 常用实验室试剂和仪器用于该过程。
研究目的
- 从帕金森病脑中提取和分析可溶和不可溶的α-突触核蛋白。
- 研究α-突触核蛋白聚集的可变性质。
- 为该领域的研究人员开发一种简单的方法。
使用的方法
- 制备用于组织均质化的溶液和缓冲液。
- 超速离心分离可溶和不可溶的馏分。
- 通过Western blotting检测α-突触核蛋白水平。
- 使用商业试剂盒定量蛋白含量。
主要结果
- 在不同的馏分中鉴定了α-突触核蛋白的单体和低聚体。
- 在帕金森病样本和对照样本之间观察到α-突触核蛋白表达的变异性。
- 该技术允许分析病理组织中的蛋白聚集。
- 通过仔细的洗涤步骤成功提取了不可溶的蛋白质。
结论
- 该方法促进了帕金森病中α-突触核蛋白的研究。
- 它使研究人员能够探索人类组织中的蛋白聚集。
- 正确执行该协议可以在一个工作日内得到结果。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma researchers to quantify soluble and insoluble alpha-synuclein species from human brain tissue, providing a biochemical readout of pathological aggregation relevant to Parkinson's disease target validation. By isolating progressively insoluble fractions, the method supports mechanistic de-risking of alpha-synuclein as a therapeutic target and informs assay development for oligomer-specific therapeutics. The approach offers a standardized workflow for evaluating target engagement and aggregation-modulating compounds in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of alpha-synuclein oligomerization and fibrillization states in disease-relevant human tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible biochemical assay to distinguish monomeric, oligomeric, and aggregated alpha-synuclein pools.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating insoluble alpha-synuclein burden with pathological Lewy body load.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates fraction-specific extracts compatible with western blotting and ELISA for oligomer-selective antibody screening.
- Operational Value: Uses standard laboratory equipment (homogenizer, ultracentrifuge, sonicator) enabling assay scalability across discovery teams.
- Assay Readiness: Delivers quantifiable protein outputs per fraction, supporting dose-response analysis of aggregation-modulating compounds.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates cross-species comparison of alpha-synuclein pathology in transgenic models versus human tissue.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of insoluble alpha-synuclein accumulation as a pharmacodynamic biomarker.
- Translational Continuity: Supports risk-adjusted advancement by linking biochemical target modulation to pathological burden reduction.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling biochemical assessment of alpha-synuclein modulation prior to phenotypic screening.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about alpha-synuclein aggregation kinetics and species-specific toxicity in human-derived systems.
- Screening: Prepares standardized biological inputs for high-sensitivity detection of oligomeric alpha-synuclein in antibody or small-molecule screens.
- Analytics: Yields fraction-specific quantitative readouts (via immunoblot densitometry) to compare treatment effects on soluble versus insoluble pools.
- Translational Research: Connects in vitro target engagement to biochemical pathology in human tissue, supporting biomarker qualification.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for alpha-synuclein quantification across multiple projects and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving distinct alpha-synuclein species implicated in Parkinson's disease pathogenesis.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized wash and ultracentrifugation steps critical for isolating insoluble proteins.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative aggregation data to prioritize compounds with target-specific effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted compound prioritization based on dose-dependent reduction of insoluble alpha-synuclein.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, ultracentrifugation, and western blotting for accurate fraction separation and detection.
- Dependent on access to ultracentrifuge, sonicator, and standard molecular biology reagents (TBS, SDS, urea, BSA).
- Necessitates cross-team standardization of wash protocols to prevent cross-contamination between soluble and insoluble fractions.
- Adaptation to animal models requires optimization of tissue input weight and homogenization efficiency for consistent recovery.
- Practical limitation: Incomplete washing between steps may lead to fraction contamination, affecting quantification accuracy.
