从帕金森病患者脑组织中连续提取可溶性与不可溶性α-突触核蛋白

本方法学的总体目标是从帕金森病死者脑组织中提取可溶性与不可溶性α-突触核蛋白。该方法有助于解答帕金森病研究中的关键科学问题。该技术的主要优势在于其操作相对简便，仅需使用常规的实验室试剂和仪器即可完成。

准备好所需的溶液和缓冲液后，取0.5克冷冻的基底神经节组织样本置于小型培养皿中。使用无菌手术刀片迅速将其切成1毫米见方的碎片。将切碎的组织收集到15毫升离心管中，并向管中加入10倍体积的冰冻1×TBS溶液。

使用机械匀浆器以 20,000 rpm 的速度匀浆样品 10 秒。然后在冰上冷却 2 分钟。重复匀浆三次，每次均在冰上冷却。

在 4 °C 条件下，将匀浆以 10,000 ×g 离心 5 分钟。将粗匀浆上清液转移至聚碳酸酯离心管中，在 4 °C 条件下以 100,000 ×g 离心 1 小时。将上清液转移至置于冰上的预冷试管中，此上清液即为 TBS 可溶性组分。

用五倍体积的1× TBS缓冲液洗涤，在4°C条件下以100,000 ×g离心15分钟。吸除并弃去上清液，然后重复洗涤一次。

在超速离心步骤之间彻底洗涤沉淀物对该实验的成功至关重要。为避免SDS析出，先将样品温度升至10摄氏度，然后加入五倍体积的1X TBS-SDS，于室温下以20千赫兹超声处理10秒，重新悬浮最终沉淀。在25摄氏度下以100,000 ×g超速离心30分钟。

超速离心后，将上清液转移至预冷的冰上试管中，作为SDS可溶性组分保留。向沉淀中加入五倍体积的室温1×TBS-SDS缓冲液，在25摄氏度下以100,000 ×g离心15分钟。弃去洗涤缓冲液，并重复洗涤一次。

弃去上清液后，加入 50 µL 1× TBS-SDS-尿素溶液，并使用设定为 20 千赫兹的超声波破碎仪超声处理 10 秒以充分溶解。将此样品标记为尿素可溶性组分。必须确保在该步骤中彻底提取所有不溶性蛋白质。

用1×TBS缓冲液将TBS-SDS-尿素样品按1:1稀释，以适配蛋白检测试剂，并根据制造商说明书，使用商用蛋白检测试剂盒测定各组分的总蛋白含量。将样品分装为含10%甘油的20微升分装液，以减少后续冻融循环，并于-80摄氏度保存。采用标准技术，将10微升TBS、TBS-SDS和TBS-SDS-尿素提取物以及分子量标记物加样至10孔、4%–12% Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶（以MOPS作为电泳缓冲液）中进行电泳。

以 200 伏电压电泳运行一小时，或直至加样缓冲液中的蓝色染料迁移至凝胶底部。将尼龙膜浸入 100% 甲醇中润湿，然后转移至含 20% 甲醇的转膜缓冲液中浸泡。在印迹膜上制作一个识别标记，以确定蛋白所在面以及分子量标准蛋白的取向。

将凝胶与膜夹在湿润的滤纸之间。在40伏电压下电泳转移2小时。用含5% BSA的1× PBS-T溶液在70 rpm振荡条件下封闭30分钟，以防止一抗与膜发生非特异性结合。

将蛋白印迹膜与6毫升抗α-突触核蛋白一抗Syn-1在PBS-T中按1:750稀释后，在4°C下孵育过夜，以进行探针杂交。次日，用1× PBS-T缓冲液洗涤膜三次，每次5分钟。随后将印迹膜与相应的HRP标记二抗在PBS-T中按1:2,000稀释后孵育30分钟。

用 1× PBS-T 按前述方法洗涤膜。在暗室中，根据制造商说明将印迹浸入增强型化学发光溶液中。用保鲜膜覆盖印迹，并使用放射自显影技术捕获信号。

成像后，将蛋白印迹膜与6毫升蛋白印迹洗脱缓冲液在持续振荡条件下孵育10分钟，以去除α-突触核蛋白抗体信号。重复蛋白印迹实验步骤，使用β-actin一抗（1:8,000稀释）孵育膜。扫描最终图像并将其转换为Tiff格式图像，使用NIH ImageJ进行密度测量以实现定量分析。

以下图片展示了帕金森病（PD）和对照组人脑基底节组织中α-突触核蛋白水平的代表性免疫印迹结果。使用TBS、SDS和尿素可溶性组分，通过蛋白质印迹法检测α-突触核蛋白的存在情况。每条泳道上样蛋白量为10毫克。

在 TBS 上清中，所有样本均存在 α-突触核蛋白单体。星号可能代表一种C端截短形式的α-突触核蛋白。在SDS上清中，除单体外，还可观察到部分α-突触核蛋白寡聚体，由帕金森病（PD）组织中的实心箭头所示。

在尿素组分中，帕金森病病例中单体、寡聚体和聚集态α-突触核蛋白的表达水平各不相同，反映了各自路易小体的负荷情况。神经系统正常的对照样本仅显示存在少量单体形式的α-突触核蛋白。一旦掌握该蛋白质提取技术，可在一个工作日内完成操作，若操作得当，次日即可进行蛋白质免疫印迹分析。

该技术问世后，为路易体生物学领域的研究人员探索病理性人体组织及体内动物模型中不溶性和聚集态的α-突触核蛋白提供了新的途径。请注意，处理未经固定的人体组织时需采取预防措施，所有操作过程中均应佩戴手套和实验服。