Name: 可溶和不可溶α-突触核蛋白从帕金森脑连续提取 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T14:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学习从帕金森病患者死后脑组织中连续提取可溶性和不可溶性α-突触核蛋白的方法。该技术利用差速离心和去污剂分级分离蛋白质聚集体，通过蛋白质免疫印迹分析单体、寡聚体及聚集体，为研究路易小体病理机制提供可靠实验手段。

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感谢Adamantios Mamais博士从人组织中提取α-突触核蛋白并进行印迹实验。本工作部分由英国医学研究理事会（MRC）资助（项目编号MR/L010933/1），部分由惠康信托基金/医学研究理事会神经退行性疾病联合资助项目（WT089698）支持，该资助授予英国帕金森病联盟（UKPDC），其成员来自伦敦大学学院神经病学研究所、谢菲尔德大学以及邓迪大学的医学研究理事会蛋白质磷酸化单位。RB为此项工作获得了迈克尔·J·福克斯基金会的资助，同时也得到Reta Lila Weston信托基金的支持。

死后脑组织通过符合伦理审批的程序捐献至伦敦大学学院神经病学研究所的女王广场脑库（Queen Square Brain Bank for neurological disorders），并根据英国人类组织管理局（HTA）颁发的许可证（编号：12198）储存用于研究。参见本方案所用病例列表（表1）。
1. 缓冲液的配制
<ol>
	<li>配制1X TBS（Tris缓冲盐水）缓冲液：
	<ol>
		<li>配制10X TBS作为储备液，含500 mM Tris-HCl（pH 7.4）和1,500 mM NaCl。
		<ol>
			<li>在800 ml高纯度水中称取60.5 g Tris-Cl（pH 7.6）和87.6 g NaCl。用1 M HCl调节pH，并将最终体积定容至1 L。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将10X储备液用蒸馏水稀释10倍，得到1X TBS的终浓度。</li>
		<li>加入蛋白酶抑制剂（PI）（每50 ml缓冲液加1片）和Phos-stop磷酸酶抑制剂片剂（每10 ml缓冲液加1片），以消除蛋白酶和磷酸酶的非特异性酶活性影响。 
		注意：此处我们使用了罗氏（Roche）的酶抑制剂片剂，但也可根据制造商说明使用其他市售的等效抑制剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过向1X TBS缓冲液（pH 7.4）中加入5% w/v十二烷基硫酸钠（SDS）配制TBS-SDS缓冲液。使用磁力搅拌器在60 °C下持续搅拌加热，以溶解SDS。</li>
	<li>向1X TBS-SDS缓冲液（pH 7.4）中加入尿素，使其终浓度达到8 M w/v，配制TBS-SDS-尿素缓冲液。使用磁力搅拌器在60 °C下持续搅拌加热，以溶解尿素。</li>
</ol>
2. 样品匀浆与差速超速离心
注意：以下工作部分涉及根据英国人类组织管理局（HTA UK）的规定处理人类脑组织。全程遵循当地的标准操作程序。脑样本从冷冻脑组织块中解剖获取，并在维持负压的生物安全柜内对组织材料进行匀浆处理。操作过程中始终穿戴一次性防护服、手套、口罩、鞋套及安全护目镜。人类组织废弃物经121 °C高压灭菌20分钟后安全丢弃。锐器（如手术刀片）须放入专用的锐器盒中，以确保 containment 及安全处置。
<ol>
	<li>取一块冷冻的人体组织（约0.5 g，来自基底神经节区域），在冰上使用小型培养皿和无菌手术刀片迅速切成小碎片（约1 mm2）。每个样本使用单独的培养皿和手术刀片。将切碎的组织收集至15 ml离心管中，并向管中加入10倍体积的冰冻1×TBS缓冲液。</li>
	<li>使用机械匀浆器在20,000 rpm条件下匀浆10秒，然后在冰上冷却2分钟。重复此步骤三次。 
	注意：此操作可防止样品在匀浆过程中过热。</li>
	<li>在4 °C条件下以1,000 × g离心5分钟，澄清样品。弃去未匀浆物质形成的沉淀。</li>
	<li>取上清液（粗匀浆液），加入聚碳酸酯离心管中（管的尺寸取决于转子大小），并仔细平衡。在4 °C条件下以100,000 × g离心1小时。</li>
	<li>保留上清液，此为TBS可溶性组分。</li>
	<li>用五倍体积的1×TBS缓冲液将沉淀洗涤两次，每次在4 °C条件下以100,000 × g离心15分钟。弃去上清液。
	<ol>
		<li>在室温下，用约五倍体积的1×TBS-SDS缓冲液重悬最终沉淀，并以20 KHz超声处理10秒。 
		注意：在加入含SDS的缓冲液前，应将样品冷却至10 °C，以避免SDS析出。</li>
		<li>在25 °C条件下以100,000 × g超速离心30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保留上清液，此为SDS可溶性组分。
	<ol>
		<li>在室温下，用五倍体积的1×TBS-SDS缓冲液将沉淀洗涤两次，每次在25 °C条件下以100,000 × g离心15分钟。</li>
		<li>使用设定为20 KHz的超声破碎仪，在50 μl的1×TBS-SDS-UREA缓冲液中对最终沉淀进行超声处理10秒&#160;，以实现完全溶解；此组分称为尿素可溶性组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据试剂盒说明书，使用商用蛋白定量试剂盒测定各组分的总蛋白含量。将TBS-SDS-尿素样品用1×TBS缓冲液按1:1稀释，以确保与蛋白检测试剂兼容。将样品分装成小份（20 μl），于-80 °C保存，以减少冻融循环次数。 
	注意：建议在样品中添加10%甘油，以便于在-80 °C长期保存。</li>
</ol>
3. 样品的免疫印迹及结果分析
<ol>
	<li>使用标准技术，将 TBS、TBS-SDS 和 TBS-SDS-尿素提取物的样品在 10 孔 4-12% Bis-Tris 聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，以 MOPS 作为运行缓冲液。详细的 Western 印迹实验方案请参见 Gallagher 和 Chakravarti（2008）29。</li>
	<li>每个样品取 10 µg 蛋白质上样至各泳道，并同时加入分子量标记物，分别用于 TBS、SDS 和尿素组分。</li>
	<li>以 200 V 恒压电泳 1 小时，或直至加样缓冲液中的蓝色染料迁移至凝胶底部。</li>
	<li>将凝胶中的蛋白质通过电转移法转印至尼龙膜28，转移前先将膜在 100% 甲醇中预湿，再置于含 20% 甲醇的转移缓冲液中。在印迹膜上做识别标记，以确定蛋白质所在面以及分子量标记物的方向。
	<ol>
		<li>将凝胶与膜夹在湿润的滤纸之间形成“三明治”结构。膜的正确放置至关重要，需确保膜位于凝胶与阳极之间。在 40 V 条件下转移 2 小时。</li>
		<li>配制 1X PBS-吐温（1X PBS-T）缓冲液：将 1 片 PBS 片剂溶于 200 ml 水中，得到终浓度为 0.01 M 磷酸盐缓冲液、0.0027 M 氯化钾和 0.137 M 氯化钠，pH 7.4。</li>
		<li>将膜在含 5% BSA 的 1X PBS-T 溶液中封闭 30 分钟，于 70 rpm 摇床上振荡。此步骤可防止一抗与膜发生非特异性结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 6 ml α-突触核蛋白一抗 Syn-1（BD Biosciences；小鼠单克隆抗体），按 1:750 稀释比例孵育蛋白印迹膜（4 °C 过夜），随后用 1X PBS-T 缓冲液进行一系列洗涤（每次 5 分钟，共 3 次）28。</li>
	<li>加入相应 HRP 标记的二抗，按 1:2,000 稀释比例孵育 30 分钟，并用 1X PBS-T 缓冲液进行一系列洗涤（每次 5 分钟，共 3 次）。
	<ol>
		<li>在暗室中将印迹膜浸入增强型化学发光溶液中 15 秒&#160;。用保鲜膜覆盖膜，然后将放射自显影胶片紧贴印迹膜（蛋白质面向上）放入避光暗盒中，以捕获相应信号（即适当大小的条带）。</li>
		<li>将放射自显影胶片放入自动显影仪中显影。 
		注意：若无自动显影仪，也可使用市售的显影液和定影液手动显影。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 Western 印迹膜与 6 ml Western 印迹 stripping 缓冲液孵育 10 分钟，并持续振荡，以去除 α-突触核蛋白抗体信号。随后按照步骤 3.43 至 3.6.2，使用 β-肌动蛋白一抗（小鼠单克隆抗体）按 1:8,000 稀释比例进行后续操作。</li>
	<li>扫描最终图像并转换为 Tiff 格式，使用 NIH ImageJ 软件进行密度测量以实现定量分析（该软件可免费下载）。 
	注意：该软件可读取目标区域（即适当大小的条带）的相对密度值，数据可表示为 α-突触核蛋白密度与 β-肌动蛋白（一种看家基因）密度的比值（以任意单位表示），或在看家基因不适用时（如尿素可溶性样品）单独表示 α-突触核蛋白密度。</li>
</ol>

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<li>Lee, B. R., Kamitani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+immunodetection+of+endogenous+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improved immunodetection of endogenous α-synuclein.</a> PLoS ONE. 6, e23939(2011).</li>
<li>Newman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+%CE%B1-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous α-synuclein.</a> PLoS ONE. 8 (11), e81314(2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种生物化学实验方案，利用变性凝胶电泳条件，从病变脑组织中提取并分析单体、寡聚体及聚集态α-突触核蛋白（α-syn）的差异溶解特性。该方法是一种成熟的技术，用于研究α-突触核蛋白的聚集形式17, 18, 20, 21——这种蛋白在天然状态下通常可溶，但在疾病进展或发生基因突变时会获得淀粉样变性或增强的聚集倾向。尽管如此，一些研究团队在其缓冲液中使用了略有不同的SDS浓度（8%或10%，而非5%）21,22, 30。SDS是一种阴离子去垢剂，可溶解包括膜结合形式在内的α-突触核蛋白寡聚体；而尿素作为一种变性剂，则可使不溶性的聚集态、纤维状或淀粉样变性的α-突触核蛋白发生变性20。在此方面，Paleologou等人31开展了一项系统性研究，考察了不同浓度尿素（6.5–8 M）或SDS（0.25–2%）对α-突触核蛋白寡聚体和纤维的稳定性影响，结果表明寡聚体在SDS中稳定，但在高浓度尿素中不稳定。他们所使用的FILA-1抗体（特异性识别α-突触核蛋白寡聚体和纤维）在非变性条件下检测到6.5 M尿素浓度下纤维含量更高。本方案所用缓冲液的浓度与Culvenor et al.（1999）32中描述的条件高度一致。
应谨慎选择用于提取不溶性 α-突触核蛋白（α-syn）的脑区解剖部位，该选择需根据疾病进展阶段反映路易小体（LB）和路易神经突（LN）中 α-syn 的负荷情况33,34。本研究中所用病例为帕金森病（PD）新皮层型和边缘系统型的基底神经节样本，依据 McKeith 标准代表 PD 进展的晚期和中期阶段34。在女王广场脑库，通常将一半脑组织用福尔马林固定以进行组织化学分析，另一半则被仔细分离为不同的解剖区域，快速冷冻后储存在 -80 oC 冰箱中，用于后续生物化学及 DNA/RNA 分析研究。脑组织经福尔马林固定并由神经病理学家完成解剖后，使用 α-syn 抗体进行免疫组织化学检测，并归档结果。此外，作为常规操作，脑组织送达后即测定其 pH 值，以评估脑组织的濒死状态。这为生物化学分析所用组织样本的保存质量提供了可靠依据。
我们的数据表明，与对照组相比，帕金森病（PD）病例中可溶于SDS的α-突触核蛋白单体更多；特别是新皮层型PD病例的α-突触核蛋白负荷高于边缘系统型PD病例。新皮层型病例代表PD相关的α-突触核蛋白病理在新皮层区域（如额叶和顶叶皮层）有更广泛的进展33,34。而边缘系统型PD病例在基底前脑/边缘区域（如杏仁核、内嗅旁回和扣带皮层区域）的路易小体（LB）评分更高。为了获得有意义的数据和进行统计学分析，每个队列至少需要检测4个病例。同样，我们未对本文展示的印迹实验数据进行统计学分析。
还必须注意到，不同的抗体可能识别不同形式或组成的高级α-突触核蛋白寡聚体，且每种抗体可能具有各自相对的敏感性和偏好性。Tong et al.29的研究结果表明，4种不同的α-突触核蛋白抗体（Syn-1、SS、Onco和LB509）至少在α-突触核蛋白寡聚体/聚集物的检测中呈现出可变的结果。尽管所有4种抗体对α-突触核蛋白单体的识别程度相似，但识别效果仍可能存在差异，具体取决于α-突触核蛋白抗体的表位位于N端还是C端29。类似地，针对磷酸化α-突触核蛋白的特异性抗体可识别出不同的高分子量α-突触核蛋白物种20,21。在本方案中，采用了经过充分表征的抗体Syn-119-21。
然而，通过抗体预吸收实验以及在细胞中对蛋白进行过表达和敲低，来验证任何新抗体在蛋白质印迹中的特异性是非常重要的。
需要考虑研究人员已采用的其他实验方法，以检测α-突触核蛋白的较小片段或不稳定的四聚体形式。这些方法可能包括使用含0.4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液对膜进行温和固定，以保留α-突触核蛋白的截短形式35，或使用交联剂处理样品匀浆以稳定四聚体结构36。
使用死后组织对蛋白质进行准确的生化评估，需要尽量减少酶介导的蛋白质降解和修饰。因此，建议使用死后延迟时间最短的组织，和/或在病例队列中选择匹配的样本。在开始分离方案之前，应先使用标准抗体进行α-突触核蛋白（α-syn）免疫组织化学染色。α-syn病理程度具有高度变异性，可能因所选脑区不同而异。建议每次实验均选择病理丰富的脑区作为阳性对照，以获得最佳得率。在细胞裂解过程中，细胞内蛋白酶或磷酸酶会释放，因此使用蛋白酶抑制剂，必要时同时使用磷酸酶抑制剂，以防止非预期的酶解降解，并将样品维持在4 °C，至关重要。
在同一批实验中，所有样品必须以均匀且一致的方式处理，以避免操作者内部的差异；应避免多次冻融循环，因为这可能会逆转翻译后修饰（如磷酸化）。在检测大量样品时，一个关键点是：免疫印迹数据应归一化至一个参照样品，该样品应与所有其他样品同时在凝胶上平行电泳，并将所有数据与该样品进行比较。此方法可确保不同印迹膜之间免疫印迹数据的归一化。这是我们近期研究中采用的方法22。
需要注意的是，为了保持背景ECL信号较低，在整个Western印迹实验过程中，印迹膜不得在任何阶段干燥。此外，应避免在X射线自显影胶片上进行过长时间的曝光（&#62;10分钟），因为这会导致ECL信号饱和，从而引起定量结果不准确。
上述方案是一种相对简单的方法，使用常见的实验室试剂和仪器，可为帕金森病（PD）研究中α-突触核蛋白（α-syn）的病理生理学研究提供有价值的工具。该方法不仅可通过适当修改拓展应用于α-突触核蛋白转基因动物中α-syn生物学的研究，还可用于其他以异常聚集蛋白沉积为特征的神经退行性疾病的研究，如阿尔茨海默病（AD）、多系统萎缩（MSA）、路易体痴呆（DLB）、亨廷顿病（HD）以及额颞叶痴呆。然而，本文所述的Western blot数据也可通过酶联免疫吸附试验（ELISA）使用针对α-syn特定形式的抗体进行验证31。

多种神经退行性疾病共有的一个关键病理特征是异常蛋白质聚集物的形成，这种聚集以特定蛋白质/疾病特异性的方式发生1。因此，在阿尔茨海默病（AD）中，存在特征性的细胞外淀粉样β斑块以及神经元内聚集的过度磷酸化tau蛋白沉积；在帕金森病（PD）、帕金森病痴呆和路易体痴呆（DLB）中，α-突触核蛋白（α-syn）聚集物存在于路易小体（LBs）——一种位于神经元内的包涵体——以及称为路易神经突（LNs）的营养不良性神经突起中2-4。在多系统萎缩（MSA）的标志性病变——少突胶质细胞胞质包涵体中，也可观察到异常的α-syn沉积5。在亨廷顿病中，存在特征性的多聚谷氨酰胺（Poly-Q）沉积，而在额颞叶痴呆中则沉积有异常的Tar DNA结合蛋白-43和融合肉瘤蛋白（FUS）。对于PD而言尤为重要的是，已发现α-syn基因突变可导致常染色体显性遗传的PD6-11。此外，α-syn基因的三倍体12和重复扩增（ duplication）13也会引起家族性PD，表明α-syn表达水平升高与PD的致病机制相关。值得注意的是，无论是散发性还是家族性PD病例，均存在α-syn病理的异常沉积14。目前可用于PD的治疗方法仅为对症治疗，无法阻止或延缓疾病的不可逆进展。
α-syn 在人脑中大量表达，约占总脑蛋白的 1%。它主要存在于神经元内，但在胶质细胞中也存在，尽管含量较低。关于 α-syn 的天然结构尚存争议，其可表现为无规单体15 或折叠的四聚体16。在疾病状态下，α-syn 会改变其构象，从而发生错误折叠，这一过程被认为是疾病发病机制的原因。尽管多年来对 α-syn 与疾病的病理生理学方面进行了大量研究，但其致病机制的确切原因仍不明确14。
迄今为止，对帕金森病患者脑组织的尸检分析为了解α-突触核蛋白（α-syn）在散发性帕金森病（PD）以及与LRRK2基因突变相关的帕金森病中的正常与异常生物学特性提供了重要线索17-22。本文描述了一种生化提取方案（见图1所示流程），用于从不同程度含有α-syn聚集物的人类PD尸检脑组织中逐步提取 increasingly insoluble 的α-syn沉积物。该技术还可通过调整缓冲液成分，适用于研究其他神经退行性疾病中的聚集蛋白23,24，以及转基因动物脑组织中的聚集蛋白25-27。进行这些调整时主要需考虑不同蛋白在溶解度和总含量上的差异，其中某些蛋白主要位于细胞核内，可能需要高盐缓冲液才能实现最佳提取，FUS蛋白即为一例28。

<table><tbody><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fluka</td><td>71727</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂片&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>04 693 116001</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂片&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>04 906 837001</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液片&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 转膜缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-P 膜&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303F</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3MM 滤纸</td><td>Sigma</td><td>WHA30306185</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris 胶 4-12%&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Supersignal West Pico 化学发光底物</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Bio-RAD DC 蛋白定量试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>厚壁 Beckman 聚碳酸酯管</td><td>Beckman</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>Western blot 洗脱缓冲液</td><td>Thermo scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>Syn-1 一抗（小鼠单克隆抗体）</td><td>BD Biosciences</td><td>610786</td><td></td></tr><tr><td>β-肌动蛋白一抗（小鼠单克隆抗体&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>HRP 标记的山羊抗小鼠二抗</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2031</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>仪器</td><td>公司</td><td>转子/型号&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>台式超速离心机 Optima Max</td><td>Beckman</td><td>MLA-80</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Heat Systems</td><td>XL20-20</td><td></td></tr><tr><td>匀浆器</td><td>Jenke and Kunkel</td><td>TP18/10</td><td></td></tr></tbody></table>

从帕金森病患者脑组织中连续提取可溶性与不可溶性α-突触核蛋白

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

α-突触核蛋白（α-syn）主要在神经元内大量表达，存在多种不同形式——单体、四聚体、寡聚体和纤维。在疾病过程中，α-syn 会发生构象改变，形成寡聚体和高分子量的聚集物，导致蛋白质溶解度降低。异常聚集的 α-syn 是帕金森病（PD）、路易体痴呆（DLB）和多系统萎缩（MSA）的神经病理学特征。利用 detergent 强度递增的缓冲液结合高速超速离心，对不溶性 α-syn 进行生化表征与分析，是研究 α-syn 病理随疾病进展发展的有力工具。本方案描述了从死后人脑组织中分离出逐渐不溶/聚集的 α-syn 的方法。该方法经适当修改后，也可适用于携带不同 α-syn 突变的转基因动物模型中正常与异常 α-syn 生物学的研究，以及其它以异常纤维样蛋白沉积为其相应病理特征的神经退行性疾病的研究。

根据图1所示方案，从基底节提取TBS、SDS和尿素可溶性蛋白，进行凝胶电泳并使用Syn-1小鼠单克隆α-突触核蛋白（α-syn）一抗进行免疫印迹检测。在帕金森病（PD）及对照病例中，TBS可溶性组分均显示存在单体α-syn（约14 kDa条带）（图2A）。SDS可溶性组分在所研究的三种病例亚型中均显示出丰富的单体α-syn，低曝光印迹图中可见（图2C）。PD病例在高曝光印迹图中还显示出较高分子量（MW）的α-syn条带，可能为寡聚体（图2C）。PD病例的尿素可溶性组分中，α-syn单体、寡聚体及聚集型物种的含量均高于对照病例。特发性PD的新皮质型病例表现出更高水平的聚集型α-syn物种，而边缘系统型病例则显示中等水平的不溶性α-syn。在特发性PD病例中，SDS和尿素可溶性组分均显示出12 kDa和6 kDa截短型α-syn产物的可变水平，如文献20所述。相比之下，对照病例未检测到任何不溶性或聚集型α-syn（图2E）。半定量密度测定结果反映了路易小体负荷量，该结果基于α-syn免疫组织化学分类，证实了聚集型α-syn在新皮质型和边缘系统型PD病例中的不溶性特征（图2B、图2D、图2F）。
<img alt="蛋白质提取流程图；离心步骤；TBS/SDS组分；免疫印迹样品制备。" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 不溶性α-突触核蛋白提取流程示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Western blot 分析；使用 TBS、SDS 和尿素进行蛋白质分离；蛋白质密度的柱状图。" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 帕金森病（PD）和对照人脑组织中 α-突触核蛋白（α-syn）水平的代表性免疫印迹图。 对特发性帕金森病病例和神经系统正常（对照）脑组织的基底神经节（在帕金森病病例中存在 α-syn 病理改变的脑区）分别提取 TBS、SDS 和尿素可溶性组分，并通过 Western 免疫印迹法检测 α-syn 的存在情况。每条泳道上样蛋白量为 10 μg。在 TBS 组分（A）中，所有样本主要显示 α-syn 单体。在 SDS 组分（B）中，帕金森病组织中除单体外还可观察到部分 α-syn 寡聚体。在尿素组分（C）中，帕金森病病例中单体、寡聚体及聚集态 α-syn 的表达水平各异，反映了各自路易小体（LB）的负荷程度。神经系统正常的对照样本仅显示少量单体形式的 α-syn。请注意，在部分路易小体负荷较高的病例中可见 α-syn 的可能降解产物。实心箭头表示 α-syn 的单体形式。星号（*）可能代表一种此前已有描述的 C 末端截短型 α-syn20,26。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>病例</td>
			<td>性别</td>
			<td>死亡年龄（岁）</td>
			<td>死后延迟时间（小时）</td>
			<td>组织pH值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>新皮层 1</td>
			<td>M</td>
			<td>82</td>
			<td>40</td>
			<td>6.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>新皮层 2</td>
			<td>F</td>
			<td>75</td>
			<td>35.3</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>边缘系统 1</td>
			<td>M</td>
			<td>81</td>
			<td>28.5</td>
			<td>6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>边缘系统 2</td>
			<td>F</td>
			<td>79</td>
			<td>36.5</td>
			<td>6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照 1</td>
			<td>M</td>
			<td>80</td>
			<td>38</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>对照 2</td>
			<td>F</td>
			<td>83</td>
			<td>32.5</td>
			<td>6.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 所用病例的有限人口统计学信息

本文介绍了一种从人死后脑组织中分离出溶解度逐渐降低/聚集态α-突触核蛋白（α-syn）的实验方案。通过使用去垢剂强度逐步增强的缓冲液，并结合高速超速离心技术，可检测病变与非病变组织中α-syn聚集特性的差异。

α-突触核蛋白（α-syn）在神经元内大量表达，主要存在于多种形式中，包括单体、四聚体……

本方法的总体目标是从帕金森病死者脑组织中提取可溶性和不可溶性α-突触核蛋白。该方法有助于解答帕金森病研究中的关键问题。该技术的主要优势在于其操作相对简单，仅需使用常规实验室试剂和仪器即可完成。在配制好所需的溶液和缓冲液后，取0.5克冷冻的基底神经节组织样本置于小型培养皿中。使用无菌手术刀片迅速将其切成1毫米见方的碎片。将切碎的组织收集到15毫升离心管中，并向管中加入10倍体积的冰上预冷的1X TBS溶液。使用机械匀浆器在 20,000 rpm 条件下匀浆样品 10 秒。然后在冰上冷却 2 分钟。重复匀浆三次，每次均需在冰上冷却。将匀浆在4°C条件下以10,000 ×g离心5分钟。将粗匀浆上清液转移至聚碳酸酯离心管中，在4°C条件下以100,000 ×g离心1小时。将上清液转移至预冷的冰上试管中，此上清液即为TBS可溶性组分。用五倍体积的1× TBS缓冲液洗涤，在4°C条件下以100,000 ×g离心15分钟。吸除并弃去上清液，然后重复洗涤一次。在超速离心步骤之间彻底清洗沉淀物对本实验的成功至关重要。为避免SDS析出，先将样品温度升至10摄氏度，然后加入五倍体积的1× TBS-SDS，通过在室温下以20千赫兹超声处理10秒重新悬浮最终沉淀物。在25摄氏度下以100,000 ×g超速离心30分钟。超速离心后，将上清液转移至预冷的冰上试管中，作为SDS可溶性组分保留。向沉淀中加入五倍体积的室温1X TBS-SDS缓冲液，在25摄氏度下以100,000 ×g离心15分钟。弃去洗涤缓冲液，并重复洗涤一次。弃去上清液后，加入 50 微升 1X TBS-SDS-尿素溶液，并使用设定为 20 千赫兹的超声波破碎仪处理 10 秒以实现溶解。将此样品标记为尿素可溶性组分。必须充分确保在此步骤中提取所有不溶性蛋白质。用1×TBS缓冲液将TBS-SDS-尿素样品按1:1稀释，以适配蛋白检测试剂，并根据生产商说明书使用商用蛋白检测试剂盒测定各组分的总蛋白含量。将样品分装为含10%甘油的20微升分装液，以减少后续冻融循环，并于-80摄氏度保存。采用标准技术，将10微升TBS、TBS-SDS和TBS-SDS-尿素提取物以及分子量标记物加样至10孔、4%–12% Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶中，以MOPS作为电泳缓冲液进行电泳。以 200 伏电压电泳运行一小时，或直至加样缓冲液中的蓝色染料迁移至凝胶底部。将尼龙膜浸入 100% 甲醇中润湿，然后转移至含 20% 甲醇的转膜缓冲液中浸泡。在印迹膜上制作标记，以确定蛋白所在面以及分子量标准蛋白的取向。将凝胶与膜夹在湿润的滤纸之间。在40伏电压下电泳转移2小时。用含5% BSA的1× PBS-T溶液在70 rpm振荡条件下封闭30分钟，以防止一抗与膜发生非特异性结合。将蛋白印迹膜与6毫升抗α-突触核蛋白一抗Syn-1在PBS-T中按1:750稀释后，在4摄氏度下孵育过夜，以进行探针杂交。次日，用1× PBS-T缓冲液洗涤膜三次，每次5分钟。随后将印迹膜与相应的HRP标记二抗在PBS-T中按1:2,000稀释后孵育30分钟。用 1× PBS-T 按前述方法洗涤膜。在暗室中，根据制造商说明将印迹浸入增强型化学发光溶液中。用保鲜膜覆盖印迹，并使用放射自显影技术捕获信号。成像后，将蛋白印迹膜与6毫升蛋白印迹剥离缓冲液在持续振荡条件下孵育10分钟，以去除α-突触核蛋白抗体信号。重复蛋白印迹实验步骤，使用β-actin一抗（1:8,000稀释）孵育膜。扫描最终图像并将其转换为Tiff格式图像，使用NIH ImageJ进行密度测量以用于定量分析。以下图片展示了帕金森病（PD）和对照组人脑基底神经节组织中α-突触核蛋白水平的代表性免疫印迹结果。采用Western免疫印迹法检测TBS、SDS和尿素可溶性组分中的α-突触核蛋白。每条泳道上样蛋白量为10毫克。在 TBS 上清中，所有样本均存在 α-突触核蛋白单体。星号可能代表一种C端截短形式的 α-突触核蛋白。在 SDS 上清中，帕金森病组织中除单体外，还可观察到一些 α-突触核蛋白寡聚体，由实心箭头指示。在尿素组分中，帕金森病病例中单体、寡聚体和聚集态α-突触核蛋白的表达水平各不相同，反映了各自路易小体的负荷情况。神经系统正常的对照样本中仅检测到少量单体形式的α-突触核蛋白。一旦掌握该蛋白质提取技术，可在一天内完成提取操作，若操作得当，次日即可进行蛋白质免疫印迹分析。该技术问世后，为路易体生物学领域的研究人员探索病理性人组织及体内动物模型中不溶性和聚集态的α-突触核蛋白提供了新的途径。请注意，处理未经固定的人体组织时需采取预防措施，所有操作过程中均应佩戴手套和实验服。

sequential-extraction-soluble-insoluble-alpha-synuclein-from

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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通过游离免疫荧光检测法靶向皮肤外周神经纤维中的α-突触核蛋白聚集体

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由单体生成α-突触核蛋白预制纤维及其在体内的应用

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