偏光M1和M2骨髓来源的巨噬细胞的使用实时外流量分析代谢表征

代谢重编程是 M1 和 M2 巨噬细胞极化的特征和先决条件。本手稿描述了一种用于测量小鼠骨髓来源的巨噬细胞中糖酵解和线粒体功能基本参数的测定法。该工具可用于研究特定因素如何影响巨噬细胞的代谢和表型。

这种细胞外通量分析的总体目标是评估初始 M1 和 M 两种极化骨髓来源巨噬细胞的代谢特性。该方法可作为研究特定细胞因子、化合物或基因密码如何影响巨噬细胞代谢表型的框架。该技术的主要优点是它只需要少量的巨噬细胞。

此外，它可以在一次检测中测量所有相关的糖酵解和线粒体参数。虽然这种方法可以深入了解骨髓来源的巨噬细胞的代谢表型，但它也可以应用于所有类型的巨噬细胞或免疫细胞。我们之所以想在 J 上发表这种方法，是因为我们经常收到其他科学家的请求，帮助他们进行代谢通路细胞通量测定。在培养的第 8 天，通过目视检查验证成熟巨噬细胞的存在，并将成熟骨髓衍生的巨噬细胞在 10 毫升柠檬酸盐盐水中孵育 5 分钟。

细胞分离时为 37 摄氏度。用 10 毫升 PBS 洗涤培养物并计数活细胞的数量。然后接种 5 乘以 10 至每孔的第四个细胞。

在 XFE 96 细胞培养物中，将微孔板放入 100 μL 培养基中，将移液器保持在每个孔侧面的一半左右。要分配细胞，请单独向背景校正孔 A 1、A 12、H 1 和 H 12 中加入培养基。然后让细胞在室温下在细胞培养罩中沉淀 1 小时。

确认贴壁培养后，将细胞置于 37 摄氏度 5% 二氧化碳培养箱中。铺板后 3 小时，根据情况刺激 4 至 6 个细胞孔，持续 24 小时。为了在细胞外通量测定前一天对骨髓来源的巨噬细胞进行极化，请将传感器盒倒置在工具板旁边，并用 200 微升 crin 溶液填充每个板孔。

接下来，将传感器盒降低到工具板上，将传感器浸入 Cain 溶液中，并验证 Cain 溶液液位是否足够高，以保持传感器浸没。然后将小柱放入 37 摄氏度的非二氧化碳培养箱中过夜。第二天，轻轻地从极化巨噬细胞中取出上清液，并用 100 微升新鲜制备的测定法洗涤细胞。

每孔中等。向每个孔中加入 180 μL 检测培养基，并使用显微镜验证细胞是否未被洗走。如果细胞仍然附着，请在细胞孵育期间进行检测前，将板置于 37 摄氏度的非二氧化碳培养箱中 1 小时。

按照表中指定准备 10 x 注射化合物混合物，并将混合物加热至 37 摄氏度。然后使用提供的加载指南向传感器盒中加载适当体积的化合物和端口 A、B、C 和 D，以通过细胞外通量测定表征极化巨噬细胞的生物能。使用分析向导创建一个分析模板，其中混合时间为 2 分钟，测量时间为 3 分钟，并且在四次进样之前和最后一次进样之后至少有三个混合和速率测量循环。

然后开始检测并按照设备指示的说明进行作。用水合探针加载卡盒板，以便通过设备和细胞板进行校准。按照指示，在测定结束时，小心丢弃所有测定培养基，并将分析的细胞培养微孔板储存在零下 20 摄氏度直至标准化。

要使用细胞增殖检测试剂盒使细胞标准化，请解冻板，并在室温下将细胞放入每孔 200 μL 新鲜制备的细胞裂解缓冲液中孵育 5 分钟。最后，用约 480 纳米激发和约 520 纳米最大发射波长测量荧光。使用获得的荧光测量值计算所有幼稚巨噬细胞孔的平均细胞计数设置为 1 的比率，然后将这些比率导出到 seahorse wave 分析软件中。

为了使数据正常化，细胞外通量测定通常会产生细胞外酸化率或 ECAR 和耗氧率，或 OCR 图，如注射葡萄糖后该代表性图所示，观察到的 ECAR 增加代表糖酵解率。用所有 liga mycin 抑制 TP 合酶后在 ECAR 中观察到的额外增加提供了有关糖酵解储备和容量的更多信息。在分析 OCR 值时，CIN 注射有助于计算用于线粒体 A TP 合成的耗氧量，FCCP 解耦线粒体呼吸。

相应的 OCR 测量产生有关已知和抗霉素注射的最大和备用呼吸能力的数据，然而，阻断线粒体复合物 1 和 3，残留的 OCR 代表非线粒体耗氧量。LPS 的巨噬细胞活化诱导糖酵解代谢增加。随着 LPS 和 IL 之间的差异，当观察耗氧率时，四种处理的巨噬细胞变得更加明显。

事实上，虽然在 LPS 处理的巨噬细胞中最大氧化代谢受到高度抑制，但 IL 4 在 M 2 巨噬细胞中诱导强劲的呼吸。一旦掌握，如果作得当，细胞外流感检测可以在两个小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住将 VET 与 FCCP 一起注射，以在解耦时为最大呼吸提供燃料。

在这项技术之后，可以进行 Eliza 等其他检测来评估有效的巨噬细胞极化。这项技术为免疫学领域的研究人员探索各种免疫细胞的代谢特性铺平了道路。观看本视频后，您应该对如何进行细胞外通量分析以评估巨噬细胞的代谢表型有很好的了解。