利用实时细胞外通量分析对极化M1和M2型骨髓源性巨噬细胞进行代谢表征

本项细胞外通量分析的总体目标是评估未经处理的M1型和M2型极化骨髓来源巨噬细胞的代谢特征。该方法可作为研究特定细胞因子、化合物或基因编码如何影响巨噬细胞代谢表型的框架。该技术的主要优势在于仅需少量巨噬细胞即可完成实验。

此外，该方法可在单次检测中测量所有相关的糖酵解和线粒体参数。尽管该方法可揭示骨髓来源巨噬细胞的代谢表型，也可应用于各类巨噬细胞或免疫细胞。我们之所以考虑在J期刊发表该方法，是因为我们经常收到来自其他科研人员的请求，希望我们协助他们进行代谢相关细胞通量检测。在培养的第8天，通过显微观察确认成熟巨噬细胞的存在，并将成熟的骨髓来源巨噬细胞在10毫升柠檬酸盐生理盐水中孵育5分钟。

当细胞脱落时，温度为37摄氏度。用10毫升PBS洗涤培养物，并计数活细胞数量。然后每孔接种5×10⁴个细胞。

在 XFE 96 细胞培养板中，每孔加入 100 µL 培养基，将移液器倾斜置于各孔侧壁约一半高度处进行加样。接种细胞时，仅向用于背景校正的 A1、A12、H1 和 H12 孔中加入培养基。随后，将细胞在细胞培养操作台内室温条件下静置 1 小时，使其沉降。

确认培养物贴壁后，将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。接种后3小时，根据需要对每种条件下的四至六个孔细胞进行刺激，持续24小时。为在细胞外通量测定前一天极化骨髓来源的巨噬细胞，将传感器微板倒置放置在功能板旁边，并向每个孔中加入200 µL的crin溶液。

接下来，将传感器 cartridge 轻轻放入功能板中，使传感器浸入 Cain 溶液，并确认 Cain 溶液液面足够高以保持传感器完全浸没。随后将 cartridge 置于无二氧化碳、37°C 的培养箱中过夜。次日，轻轻吸除极化巨噬细胞的上清液，并用 100 µL 新鲜配制的检测液洗涤细胞。

每孔加入培养基。每孔加入180 µL检测培养基，并使用显微镜确认细胞未被冲走。若细胞仍贴壁，将培养板置于37 °C无二氧化碳培养箱中孵育1小时，然后开始检测。

按照表格中指定的配比制备10倍浓度的化合物混合液，并将混合液预热至37摄氏度。然后根据提供的加样指南，向传感器 cartridge 中加入适量的化合物以及分别加入端口A、B、C和D的溶液，以通过细胞外通量检测来表征极化巨噬细胞的生物能量状态。使用检测向导创建检测模板，设定每次混合时间为2分钟，检测时间为3分钟，并在每次四次注射前以及最后一次注射后，至少进行三次混合和速率检测循环。

然后启动检测，并按照仪器所示说明进行操作。将含有水化探针的反应板装入仪器，以便仪器对探针板和细胞板进行校准。当仪器提示检测结束时，小心弃去所有检测培养基，并将已完成分析的细胞培养微孔板于-20摄氏度保存，直至进行标准化处理。

使用细胞增殖检测试剂盒对细胞进行归一化处理时，将培养板解冻，并在每孔中加入200 µL新鲜配制的细胞裂解缓冲液，在室温下孵育5分钟。最后，以约480 nm激发波长和约520 nm发射波长最大值检测荧光信号。利用获得的荧光测定值计算比值，将所有未处理巨噬细胞孔的平均细胞数设为1，然后将这些比值导入Seahorse Wave分析软件中。

为了对数据进行归一化处理，细胞外通量分析通常会产生细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）曲线，如本代表性图示所示。在加入葡萄糖后，ECAR 的升高反映了糖酵解速率。随后加入寡霉素（oligomycin）抑制 ATP 合成酶后，ECAR 进一步升高，由此可获得有关糖酵解储备能力和糖酵解容量的额外信息。在分析 OCR 值时，加入 CIN 可用于计算线粒体 ATP 合成所消耗的氧气量，而 FCCP 则可解除线粒体呼吸的偶联状态。

相应的OCR测量结果提供了关于最大呼吸能力和备用呼吸能力的数据，其中已知的抗霉素A注射可阻断线粒体复合物I和III，残留的OCR代表非线粒体的氧气消耗。用LPS激活巨噬细胞会诱导糖酵解代谢增强。当观察氧气消耗速率时，LPS处理与IL-4处理的巨噬细胞之间的差异变得更加明显。

事实上，尽管经LPS处理的巨噬细胞中最大氧化代谢受到强烈抑制，但IL-4可在M2型巨噬细胞中诱导出显著的呼吸作用。一旦熟练掌握，若操作得当，细胞外耗氧率检测可在两小时内完成。在进行该操作时，务必记住在解偶联时同时注射寡霉素与FCCP，以促进最大呼吸。

采用该技术后，可进一步进行 ELISA 等附加检测，以评估巨噬细胞极化的效率。该技术为免疫学领域的研究人员探索多种免疫细胞的代谢特征铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展细胞外通量分析，以评估巨噬细胞的代谢表型。