诱发心肌细胞的使用多顺反子构建表达GATA4，MEF2C和Tbx5中的最优比率改善发电
2015年11月13日
我们在这里描述了一种使用逆转录病毒介导的多顺反子构建体中 Gata4、Tbx5 和 Mef2c 递送生成 iCM 的方案。该方案产生相对均匀的重编程细胞群，具有更高的效率和质量，对于未来 iCM 重编程的研究很有价值。
该方案的总体目标是展示如何使用聚氯离子 MGT 构建体从心脏成纤维细胞中有效地产生诱导的心肌细胞，表达 gata 4、F 2 C 和 TBX 5 的最佳比例。该方法为诱导心肌细胞研究提供了一个有价值的平台，并将促进诱导心肌细胞编程的后筛选和机制研究，同时也将该领域推向临床应用。该技术的主要优点是仅使用单个逆转录病毒构建体，心脏成纤维细胞可以有效地转化为心肌细胞。
用 75% 体积对体积清洁新生 α 肌球蛋白重链 GFP 转基因小鼠。乙醇执行安乐死。然后用无菌、钝和弯曲的镊子从一个腋窝下方到另一个腋窝下做一个水平切口，打开体腔。
解剖心脏并将其放入含有冰的 24 孔板的一个孔中。冷 PBS 使用荧光显微镜观察整个心脏的 GFP 表达。使用无菌镊子和剪刀将 3 至 4G FP 阳性心脏放入 60 毫米的中心孔培养皿中，将心脏切成小于 1 立方毫米的小块。
将切碎的心形转移到 10 厘米的培养皿中，并用 2 毫升 fiberblast 或 FB 培养基覆盖。将板在 37 摄氏度的培养箱中放置至少三个小时。孵育后，将 8 毫升预热的 FB 培养基缓慢加入含有切碎的心脏组织的培养皿中。
然后孵育组织，除了每三天更换一次培养基外，不受干扰。第 7 天，吸出培养基并用 DPBS 洗涤细胞。向每个板中加入 3 毫升 0.05% 的 EDTA 溶液，并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。
加入 5 ml FB 培养基以使胰蛋白酶失活，然后用细胞刮刀轻轻分离细胞。接下来，收集细胞并通过 40 微米细胞过滤器过滤，以避免被心脏组织碎片污染。以 200 倍 G 离心 5 分钟，从分离的新生小鼠心脏开始，使细胞沉淀。
将每颗心形切成四块，这些块仍然松散地连接在一起。将心脏转移到装有 8 毫升温热的 0.05% tripsin EDTA 的 15 毫升锥形管中，并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。孵育后，弃去 tripsin EDTA，加入 5 毫升温热的 2 型胶原酶涡旋，以中速孵育 1 分钟，然后将试管在 37 摄氏度的水浴中孵育 3 到 5 分钟。
然后再次涡旋试管 1 分钟。让组织块沉淀并将上清液收集到含有 5 毫升冷 FB 培养基的新试管中。向组织块中加入 5 毫升新鲜的 2 型胶原酶，然后重复涡旋和孵育步骤。
通过 40 μm 细胞过滤器过滤所有含有上清液的细胞。将这些细胞在 4 摄氏度下以 200 倍 G 离心 5 分钟。遵循任一心脏成纤维细胞分离方法。
在 10 mL 磁性激活细胞分选或 max 缓冲液中洗涤最终的细胞沉淀一次。取出 10 微升用于活细胞计数，并将剩余细胞以 200 倍 G 离心，在 4 摄氏度下离心 5 分钟，离心少于 1 倍 10 至第 7 个细胞。在 90 μL 冷冻 max 缓冲液中，用 10 μL 大腿 1.2 偶联磁性微珠重悬细胞沉淀并混合。
将珠子在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。要沉淀细胞，请添加 10 mL Max 缓冲液，并以 200 倍 G 离心样品 5 分钟。用 10 mL 最大缓冲液洗涤一次，然后在细胞培养罩中以总体积为 2 mL 的细胞沉淀重悬。
设置 max separator 并添加 LS 列。用 3 mL 最大缓冲液平衡色谱柱。将细胞悬液通过 LS 柱，用 2 ml max 缓冲液洗涤 3 次。
然后从分离器中取出 LS 柱，用 2 ml 最大缓冲液洗脱 3 次。在 50 mL 锥形管中收集 EIT。将 EIT 以 200 倍 G 离心 5 分钟。
将分离的成纤维细胞重悬于 10 ml FB 培养基中并计数细胞，将细胞以适当密度接种到明胶预编码的 24 孔板中的组织培养皿中，以重新编程心脏成纤维细胞。将 500 微升含有多脑的诱导心肌细胞或 ICM 培养基添加到装有细胞的 24 孔板的每个孔中。向分离的成纤维细胞的每个孔中加入 10 微升逆转录病毒。
将板与逆转录病毒颗粒在细胞培养箱中孵育 24 至 48 小时。然后用 500 μL 新鲜 ICM 培养基更换含有病毒的培养基，每 2 到 3 天更换一次培养基。通过在 ICM 培养基中补充每毫升 2 μg pur 霉素，开始病毒转导细胞的阳性选择。
选择三天后，将培养基更改为每毫升 1 微克 pur mycin 的维持剂量，以观察心脏成纤维细胞转化为心肌细胞。使用倒置显微镜观察 pur mycin 选择的板的 GFP 表达。最后，在病毒处理后 14 天，用 B 27 替换 ICM 培养基。
在心脏标志物（包括心肌肌钙蛋白 T 和 α）病毒转导表达后 3 至 4 周，可能会出现中等自发跳动的细胞位点。肌动蛋白可在第 10 至 14 天通过免疫化学检测到。在这里，心肌肌钙蛋白 T 表达在由成纤维细胞转化的 I CMS 中可见，其在 ICM 中表达 GFP α 肌动蛋白表达。
流式细胞术分析显示心肌肌钙蛋白 T 表达的类似增加，尤其是在诱导心肌细胞的 pur 霉素选择之后。这里描述的神话允许基于在单个构建体中逆转录病毒递送 NGT 转录因子有效生成诱导心肌细胞。
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概述
本协议概述了使用多顺反子构建体从心脏纤维母细胞生成诱导心肌细胞（iCMs）的方法。该方法提高了重新编程细胞的效率和质量，有助于未来iCM重新编程的研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 心血管生物学
- 细胞重新编程
- 干细胞研究
背景
- 诱导心肌细胞对心脏再生研究至关重要。
- 当前生成iCMs的方法通常缺乏效率。
- 逆转录病毒传递系统可以增强重新编程。
- 使用多顺反子构建体允许同时表达关键转录因子。
研究目的
- 展示生成iCMs的高效协议。
- 提高重新编程细胞的质量和均一性。
- 促进iCMs的机制研究和临床应用。
使用的方法
- 逆转录病毒介导的Gata4、Tbx5和Mef2c的传递。
- 使用多顺反子构建体进行基因表达。
- 从新生小鼠中分离心脏纤维母细胞。
- 评估重新编程效率和细胞质量。
主要结果
- 该协议产生了均一的iCMs群体。
- 提高了将纤维母细胞转换为心肌细胞的效率。
- 促进了iCMs的高通量筛选。
- 支持未来的心脏生物学机制研究。
结论
- 这种方法代表了iCM研究的重大进展。
- 它为心脏再生的进一步研究提供了宝贵的平台。
- 该方法可能会带来心脏病临床应用的增强。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient generation of induced cardiomyocytes (iCMs) from cardiac fibroblasts addresses a key bottleneck in cardiac disease modeling and regenerative medicine. By optimizing transcription factor stoichiometry via a single polycistronic construct, this method improves reprogramming efficiency and cellular homogeneity, enabling more reliable mechanistic studies and preclinical screening. The approach supports target validation and lead identification efforts by providing a scalable, reproducible human-relevant disease model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac reprogramming mechanisms and functional validation of transcription factor networks.
- Operational Value: Reduces variability in iCM generation, supporting consistent target engagement assays.
- Predictive Value: Improves confidence in phenotypic readouts by increasing the proportion of fully reprogrammed cardiomyocytes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a homogeneous iCM population for quantitative assessment of contractility, marker expression, and drug response.
- Operational Value: Enables high-throughput screening workflows due to improved efficiency and selection compatibility with puromycin.
- Assay Readiness: Supports standardized, reproducible generation of iCMs for downstream functional and imaging-based assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease modeling by enabling conversion of patient-derived fibroblasts into iCMs for genotype-phenotype correlation.
- Operational Value: Supports longitudinal studies through stable expression of cardiac markers like troponin T and alpha-actinin.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing a scalable source of iCMs for efficacy and toxicity profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in cardiovascular biology and enabling scalable production of iCMs for assay deployment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking of transcription factor combinations in cardiac reprogramming.
- Screening: Delivers assay-ready iCMs with quantifiable outputs such as troponin T expression and spontaneous beating.
- Analytics: Enables flow cytometry and immunochemistry-based quantification of reprogramming efficiency and maturation.
- Translational Research: Connects to preclinical applications by providing a renewable source of iCMs for drug testing and mechanism of action studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iCM generation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cardiac phenotypes by reducing incomplete reprogramming.
- Operational Value: Standardizes iCM production through a single-vector system, simplifying workflow and reducing variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by enhancing the reliability of iCM-based assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiac targets through more accurate disease modeling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac fibroblast isolation, retroviral transduction, and flow cytometry.
- Depends on retroviral production infrastructure and biosafety level 2 compliance.
- Necessitates standardized culture conditions including gelatin-coated plates and FB/ICM media formulations.
- Requires adaptation for human fibroblast sources and validation of transgene silencing in long-term culture.
- Limited by the need for antibiotic selection and potential silencing of retroviral constructs over time.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Generation of Neonatal Mouse Cardiac Fibroblasts via Explant Culture
3:20
Generation of Neonatal Mouse Cardiac Fibroblasts via Enzymatic Digestion
5:02
Isolation of Thy1.2+ Fibroblasts by Magnetic-activated Cell Sorting (MACS)
7:17
Retroviral Mediated Reprogramming of Isolated Cardiac Fibroblasts
8:52
Results: Retroviral Reprogramming of Cardiac Fibroblasts to Induced Cardiac Myocytes
9:38
Conclusion
