Name: 诱发心肌细胞的使用多顺反子构建表达GATA4，MEF2C和Tbx5中的最优比率改善发电 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 了解如何使用多顺反子构建表达GATA4、MEF2C和Tbx5的最优比率，通过逆转录病毒递送系统高效将心脏成纤维细胞重编程为诱导心肌细胞。该方法为心脏再生研究提供重要平台。

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我们感谢北卡罗来纳大学（UNC）流式细胞术核心实验室和UNC显微成像核心实验室提供的专业技术支持。感谢钱实验室和刘实验室成员在手稿撰写过程中给予的有益讨论和关键性审阅。本研究得到了美国国立卫生研究院/国家心脏、肺和血液研究所（NIH/NHLBI）授予刘博士的R00 HL109079基金、美国心脏协会（AHA）科学家发展基金13SDG17060010以及艾略特医学基金会（EMF）授予钱博士的新学者基金AG-NS-1064-13的资助。

本方案使用新生小鼠。动物护理和实验操作均遵循北卡罗来纳大学教堂山分校实验动物医学部（DLAM）制定的指南进行。
1. 缓冲液和培养基的制备
<ol>
	<li>制备成纤维细胞（FB）培养基：在500 ml IMDM培养基中加入100 ml胎牛血清（FBS）和6 ml青霉素/链霉素。</li>
	<li>制备iCM培养基：在400 ml DMEM培养基中加入100 ml M199培养基和50 ml FBS。</li>
	<li>制备B27培养基：在490 ml RPMI1640培养基中加入10&#160;ml B27添加剂。</li>
	<li>制备Plat-E细胞培养基：在500 ml DMEM培养基中加入50 ml FBS、5 ml青霉素/链霉素和5 ml非必需氨基酸。</li>
	<li>制备Plat-E转染培养基：在500 ml DMEM培养基中加入50 ml FBS和5 ml非必需氨基酸。</li>
	<li>制备明胶包被的24孔板：向24孔板的每个孔中加入0.5 ml 0.1%明胶溶液，37 °C孵育至少10分钟，使用前吸除溶液。</li>
	<li>制备FACS标记缓冲液：在500 ml DPBS中加入10 ml FBS和2 ml EDTA（0.5 M），使EDTA终浓度为2 mM。经0.22 µm滤膜过滤后，4 °C保存。</li>
	<li>制备MACS分选缓冲液：在500 ml DPBS中加入2.5 g BSA和2 ml EDTA（0.5 M），使EDTA终浓度为2 mM。经0.22 µm滤膜过滤后，4 °C保存。</li>
	<li>制备用于转染的2x HBS缓冲液：在500 ml HEPES缓冲液（50 mM）中加入280 mM NaCl（8.1816 g）、10 mM KCl（0.37275 g）、1.5 mM Na2HPO4（0.10647 g）和12 mM葡萄糖（1.08096 g）。加入约650 µl 10 N NaOH，调节pH至7.05–7.12。经0.22 µm孔径滤膜过滤后，4 °C保存。</li>
	<li>制备用于转染的2.5 M CaCl2溶液：将18.376 g CaCl2加入50 ml ddH2O中。经0.22 µm孔径滤膜过滤后，4 °C保存。</li>
	<li>制备ICC（免疫细胞化学）固定缓冲液：将5 ml多聚甲醛（PFA，32%）加入35 ml DPBS中，使终浓度为4%。</li>
	<li>制备ICC透化缓冲液：将0.1 ml Triton加入100 ml DPBS中，使终浓度为0.1%。</li>
	<li>制备ICC封闭缓冲液：将5 g牛血清白蛋白（BSA）加入100 ml DPBS中，使终浓度为5%。</li>
	<li>制备ICC染色缓冲液：将1 g BSA加入100 ml DPBS中，使终浓度为1%。</li>
</ol>
2. 新生小鼠心脏成纤维细胞的制备
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>通过组织块培养法生成心肌成纤维细胞
	<ol>
		<li>用75%乙醇清洁新生αMHC-GFP转基因小鼠（P1至P2期），用无菌剪刀剪去头部，然后从一侧腋下至另一侧做水平切口。使用无菌钝头弯镊分离出心脏，并将其置于含有冰上预冷PBS缓冲液的24孔板的一个孔中。
		<ol>
			<li>或者，在做水平切口后可直接挤出心脏。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过荧光显微镜检测心脏中的GFP表达。由于GFP的表达由αMHC启动子驱动，而该启动子为心肌特异性启动子，因此转基因小鼠的心脏应呈绿色15，而阴性心脏在任何荧光下均呈暗淡状态。</li>
		<li>取3–4个GFP阳性心脏置于一个60 mm中心孔培养皿中，用无菌剪刀和镊子将其剪切成小于1 mm3大小的小块。</li>
		<li>将3–4个剪碎的心脏组织放入一个10 cm培养皿中，加入2 ml FB培养基，让组织自然沉降3小时。</li>
		<li>缓慢向含有心脏组织的培养皿中加入8 ml预温的FB培养基。三天内不要扰动组织。</li>
		<li>每三天更换一次培养基。</li>
		<li>第7天，吸除培养液，并用DPBS洗涤细胞。每孔加入3 ml 0.05%胰蛋白酶，在37 °C下消化5分钟。</li>
		<li>加入5 ml FB培养基以终止胰蛋白酶消化反应。用细胞刮轻轻刮下细胞，并反复吹打混匀以进一步机械解离组织。</li>
		<li>收集细胞，经40 µm细胞滤器过滤，以避免心脏组织碎片污染，随后在200 x g条件下离心5分钟以收集细胞沉淀。</li>
		<li>用MACS缓冲液洗涤细胞一次，细胞即可用于分选。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过酶消化法生成心肌成纤维细胞
	<ol>
		<li>收获GFP阳性心脏（步骤同2.1.1），将所有心脏转移至一个含10 ml冰上预冷DPBS的10 cm培养皿中。</li>
		<li>用无菌镊子挤压心室以去除血液，并用冰上预冷DPBS冲洗一次。</li>
		<li>修剪心脏，去除其他组织和脂肪。</li>
		<li>将每个心脏大致切成4块，但仍保持轻微连接。</li>
		<li>若心脏数量少于20个，将心脏转移至一个15 ml锥形管中，加入8 ml温热的0.05%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C下孵育15分钟。
		<ol>
			<li>若心脏数量为20–30个，则转移至一个50 ml锥形管中，加入10 ml温热的0.05%胰蛋白酶-EDTA，在37 °C下孵育15分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>弃去胰蛋白酶溶液，加入5 ml（适用于少于20个心脏）或10 ml（适用于20–30个心脏）温热的II型胶原酶（0.5 mg/ml，溶于HBSS中）。</li>
		<li>将管子置于涡旋振荡器上，以速度等级4至6涡旋1分钟（若液体未溅至管盖，则速度合适）。</li>
		<li>将管子放入37 °C水浴中孵育3–5分钟。</li>
		<li>再次涡旋1分钟。</li>
		<li>静置沉降1分钟，待组织块沉底后，将上清液转移至另一新管中，该管内预先加入5 ml冷的FB培养基。</li>
		<li>重复步骤2.2.6–2.2.10共3–5次。</li>
		<li>将所有收集的液体合并，经40 µm细胞滤器过滤，以制备单细胞悬液。</li>
		<li>在4 °C下以200 x g离心5分钟。</li>
		<li>用10 ml MACS缓冲液重悬细胞，在4 °C下以200 x g离心5分钟。</li>
		<li>可选步骤：若红细胞较多，将细胞用1 ml红细胞裂解缓冲液（150 mM NH4Cl，10 mM KHCO3，0.1 mM EDTA）重悬，冰上放置1分钟，然后加入10 ml MACS缓冲液稀释，在200 x g条件下离心5分钟。再用MACS缓冲液洗涤一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过MACS（磁激活细胞分选）分离Thy1.2+成纤维细胞
	<ol>
		<li>通过台盼蓝染色确定活细胞数量。
		<ol>
			<li>从步骤2.2.14中10 ml&#160;细胞悬液中取出10 µl，与10 µl 0.4%台盼蓝溶液混合。</li>
			<li>将混合液加入血细胞计数板，静置3–5分钟后立即在显微镜下观察。死细胞被染成蓝色，活细胞则不着色。</li>
			<li>计数血细胞计数板四个1 mm角区方格内的所有活细胞。计算活细胞总数：每格平均计数 × 2（稀释倍数）× 104 × 10（细胞悬液总体积）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>若细胞数少于1 × 107，将细胞用90 µl预冷MACS缓冲液重悬，并加入10 µl Thy1.2微珠；若细胞数超过1 × 107，则按比例增加微珠用量。充分混匀后在冰箱（2–8 °C）中孵育30分钟。</li>
		<li>加入10 ml&#160;MACS缓冲液，以200 x g离心5分钟；用10 ml MACS缓冲液洗涤一次，再次离心。</li>
		<li>用MACS缓冲液将体积调至2 ml。</li>
		<li>在超净台中设置MACS分选仪，将LS柱插入分选仪中，并向柱内加入3 ml MACS缓冲液进行平衡。</li>
		<li>将细胞悬液通过已平衡的LS柱。</li>
		<li>每次用2 ml MACS缓冲液洗涤3次。</li>
		<li>将LS柱从分选仪上取下，用2 ml MACS缓冲液洗脱3次，收集至一个新的50 ml离心管中。</li>
		<li>以200 x g离心5分钟。</li>
		<li>用10 ml FB培养基重悬细胞，计数后按适当密度接种至培养板中。对于通过组织块培养法获得的成纤维细胞，接种密度约为2–3 × 104个细胞/孔（24孔板）。对于通过酶消化法获得的成纤维细胞，接种密度约为4–5 × 104个细胞/孔（24孔板）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 用于iCM重编程的逆转录病毒的制备
注意：以下步骤需在 BSL2 生物安全柜中的无菌条件下进行。建议对转染后的细胞、移液器吸头和试管进行妥善处理，以避免对环境和健康造成危害的风险。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>在含有 1 µg/ml 嘌呤霉素和 10 µg/ml 杀稻瘟菌素的 Plat-E 培养基中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 Plat-E 细胞。</li>
	<li>第 2 天，将培养基更换为不含嘌呤霉素和杀稻瘟菌素的 Plat-E 培养基。</li>
	<li>第 0 天，在转染前一天将 Plat-E 细胞以每皿约 4–5 × 106 个细胞的密度接种至 10 cm 培养皿中。转染当天细胞融合度应达到约 80–90%。</li>
	<li>第 1 天，在转染前 1 小时内将细胞培养基更换为转染培养基。转染操作步骤如下：
	<ol>
		<li>使用 commercial kits 进行转染
		<ol>
			<li>将 20 µl 转染试剂（例如 Lipofectamine）与 500 µl&#160;低血清培养基（例如 Opti-MEM）混合。将 10 µg 逆转录病毒质粒加入另一份 500 µl 低血清培养基中。将两种混合物于室温（RT）孵育 5 分钟。</li>
			<li>将质粒混合物缓慢加入转染试剂混合物中，此步骤可能持续 15–30 秒。将合并后的混合物于室温孵育 20 分钟（溶液可能呈现浑浊）。</li>
			<li>将混合物逐滴加入细胞中。</li>
			<li>于 37 °C 培养箱中过夜孵育。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用磷酸钙法进行转染。
		<ol>
			<li>将 40 µl 2.5 M CaCl2 与 440 µl ddH2O 混合，然后加入 20 µg 逆转录病毒质粒（调整 ddH2O 用量使总体积为 500 µl）。</li>
			<li>将 500 µl 2x HBS 加入 15 ml 圆底离心管中。</li>
			<li>涡旋振荡 HBS 溶液，同时将钙- DNA 混合物逐滴加入 HBS 中。每份样品此步骤约需 30 秒，因此建议同时处理不超过 3–4 个样品。</li>
			<li>于室温孵育 3 分钟。孵育时间过长会导致沉淀颗粒变大，降低细胞对沉淀的摄取效率。</li>
			<li>将混合物逐滴加入细胞中，并在 20X 显微镜下观察，应可见细小沉淀（大量小颗粒为佳，少量大颗粒则不佳）。</li>
			<li>于 37 °C 培养箱中过夜孵育。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第 2 天，用 8 ml 预热的培养基更换细胞培养液，继续孵育 24 小时。</li>
	<li>第 3 天和第 4 天，使用 10 ml 无菌一次性注射器收集培养皿中的培养上清，经 0.45 µm 孔径的醋酸纤维素滤膜过滤后转移至 50 ml 离心管中。每 8 ml 含病毒上清中加入 2 ml 逆转录病毒沉淀液，轻轻混匀后于 4 °C 过夜孵育。</li>
	<li>第 5 天，在 4 °C 条件下以 1,500 × g 离心 30 分钟。病毒颗粒应形成位于管底的白色沉淀。</li>
	<li>弃去上清液。以 1,500 × g 离心 5 分钟以沉淀残留液体。小心吸除所有残留液体，注意勿扰动管底沉淀的逆转录病毒颗粒。</li>
	<li>每 8 ml 病毒上清所得沉淀用 100 µl DPBS 缓冲液重悬。将病毒液分装后置于冰上。可立即使用或储存于 -80 °C。</li>
</ol>
4. 心脏成纤维细胞的重编程

<ol>
	<li>向10 ml iCM培养基中加入4 µl浓度为10 mg/ml的polybrene溶液，通过上下吹打轻轻混匀。polybrene的终浓度为4 µg/ml。</li>
	<li>将含polybrene的500 µl iCM培养基加入已接种成纤维细胞的24孔板的每个孔中。</li>
	<li>向每个含有2-3 × 104个组织块培养来源细胞或4-5 × 104个酶消化法来源细胞的孔中加入10 µl逆转录病毒。若在不同培养板或培养皿中细胞数量增加，病毒用量应按比例增加。将培养板置于37 °C培养箱中培养24–48小时，以允许病毒感染。心脏重编程的时间线见图1。</li>
	<li>病毒感染后，将含病毒的培养基更换为500 µl常规iCM培养基。</li>
	<li>每2–3天更换一次培养基。如需对病毒感染的细胞进行阳性筛选，向目标细胞中加入补充有2 µg/ml嘌呤霉素的iCM培养基，持续三天。之后，将iCM培养基中的嘌呤霉素维持在1 µg/ml浓度。</li>
	<li>病毒感染三天后，将培养板从培养箱中取出，置于倒置荧光显微镜（20X）下观察GFP表达。 
	注意：病毒感染十天后，可收集细胞进行FACS分析和ICC分析，以评估重编程效率（见步骤5和6）。</li>
	<li>病毒感染十四天后，将iCM培养基更换为B27培养基，每三天更换一次培养基。自发搏动细胞灶可能在病毒转导后三周（酶消化法来源细胞）或四周（组织块培养法来源细胞）开始出现。</li>
</ol>
5. 重编程效率的免疫细胞化学分析
<ol>
	<li>用预冷的 PBS 漂洗细胞三次；去除多余的溶液。</li>
	<li>向 24 孔板的每孔中加入 0.5 ml ICC 固定缓冲液，在室温下固定细胞 15–20 分钟。</li>
	<li>用 PBS 漂洗细胞三次。</li>
	<li>向 24 孔板的每孔中加入 0.5 ml ICC 通透缓冲液，在室温下通透细胞 15 分钟。</li>
	<li>用 PBS 漂洗细胞三次。</li>
	<li>向 24 孔板的每孔中加入 0.5 ml ICC 封闭缓冲液，在室温下孵育 1 小时。</li>
	<li>用 ICC 染色缓冲液稀释一抗。向每孔加入 200 µl 抗体溶液，在 4 °C 下孵育过夜。抗体稀释倍数见材料部分。</li>
	<li>次日，用 PBS 洗涤细胞三次。</li>
	<li>向细胞中加入 200 µl 二抗溶液，在室温下避光孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞三次。</li>
	<li>向每孔中加入 150 µl 含 DAPI 的封片液，使细胞核染色 1 分钟。然后用圆形玻璃盖玻片覆盖每孔，并用镊子轻轻按压盖玻片底部以去除气泡。</li>
	<li>吸除多余液体，样品即可用于成像。代表性图像显示了在第 14 天表达心肌标志物 cTnT 和 αActinin 的重编程细胞，如 图 2B 所示。</li>
</ol>
6. 重编程效率的FACS分析
<ol>
	<li>用DPBS彻底清洗细胞一次。每孔加入0.3 ml胰蛋白酶（0.05%），在37 °C孵育5分钟。</li>
	<li>轻轻敲击培养板以促进细胞脱落。在显微镜下观察细胞解离情况。当大部分细胞已解离时，每孔加入1 ml FACS缓冲液。用移液器反复吹打，进一步通过机械方式解离细胞。</li>
	<li>将24孔板中的细胞逐孔转移至96深孔板中。在4 °C以200 × g离心5分钟，收集细胞。</li>
	<li>用FACS缓冲液清洗细胞一次。</li>
	<li>加入100 µl固定/透化溶液，重悬细胞，在4 °C孵育20分钟。</li>
	<li>用1×洗涤液清洗细胞两次，离心收集细胞沉淀，并弃去上清液。</li>
	<li>在1×洗涤缓冲液中配制针对GFP和cTnT的一抗溶液。每份样品加入50 µl抗体溶液，充分重悬细胞后，在4 °C孵育30分钟。</li>
	<li>用1×洗涤液清洗细胞一次，离心收集细胞沉淀，并弃去上清液。</li>
	<li>每份样品中加入50 µl二抗溶液，其中包含Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG和Alexa Fluor 647标记的驴抗小鼠IgG。在避光条件下于4 °C孵育30分钟。</li>
	<li>用1×洗涤液清洗细胞一次，离心收集细胞沉淀，并弃去上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于400 µl固定缓冲液（含1% PFA的DPBS）中。通过带细胞筛网帽的FACS管转移细胞。样品即可用于FACS检测。使用pMxs-嘌呤霉素-MGT载体进行重编程效率的代表性FACS分析结果（有或无嘌呤霉素筛选）如图2A所示。</li>
</ol>

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<li>Mathison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cardiac+cellular+reprogramming+efficacy+is+enhanced+by+angiogenic+preconditioning+of+the+infarcted+myocardium+with+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor.</a> J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).</li>
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<li>Srivastava, D., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+factors+for+cardiac+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Critical factors for cardiac reprogramming.</a> Circ Res. 111, 5-8 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

采用本方案成功生成诱导心肌样细胞（iCM）时，有多个重要因素会影响整体效率。特别是起始成纤维细胞的状态以及编码MGT的逆转录病毒的质量，会显著影响重编程效率。
生成尽可能新鲜且健康的成纤维细胞至关重要。采用组织块培养法时，成纤维细胞可在组织块接种到培养皿后七天内使用。采用酶消化法时，成纤维细胞最早可在分离后的次日使用。不建议将成纤维细胞冻存或传代后再用于重编程，因为这些额外处理会显著降低重编程效率。接种密度是影响重编程效率的另一个重要因素。若细胞接种过稀，细胞容易变得不健康，形态不规则且体积增大，这类细胞极少能转化为诱导心肌样细胞（iCMs）。若细胞接种过密，则病毒转导的感染复数（MOI）会降低，未感染的成纤维细胞过度生长会显著稀释重编程事件，从而导致iCMs的比例降低。我们还注意到，若用于重编程的细胞接种数量过多，会出现具有鹅卵石样形态的小细胞，这些细胞几乎无法被重编程，从而导致重编程效率下降。当将本方案应用于不同规格的组织培养皿时，建议根据培养皿的表面积按比例调整接种的细胞数量。
成纤维细胞的纯度对重编程至关重要。高纯度的...

心血管疾病仍然是全球死亡的首要原因，每年导致1730万人死亡1心肌梗死（MI）或进行性心力衰竭导致的心肌细胞丢失是发病率和死亡率的主要原因2由于再生能力有限，成年哺乳动物心脏在损伤后通常会出现泵血功能受损和心力衰竭3-6因此，心肌细胞的高效（再）生 体内 和 体外 用于心脏病治疗和疾病建模是一个亟待解决的关键问题。
直接重编程技术的最新进展为再生医学提供了一种极具前景的替代策略，该技术可将一种已分化细胞表型直接转化为另一种，而无需经过多能性状态。哺乳动物心脏中含有丰富的心肌成纤维细胞（CFs），约占心脏细胞总数的一半，在心脏损伤后会大量增殖。7-9因此，如果能够将大量存在的成纤维细胞（CFs）直接重编程为功能性心肌细胞（CMs），它们就有望成为再生治疗中内源性的心肌细胞来源。已有研究表明，转录因子（如 Gata4 (G)、Mef2c (M) 和 Tbx5 (T)）的组合，无论是否联合 microRNA 或小分子化合物，均可将成纤维细胞重编程为诱导性心肌样细胞（iCMs）。10-26重要的是，这种转化也可以被诱导 体内，并可改善梗死心脏的心功能，减小瘢痕面积16,27-29这些研究表明，直接心脏重编程可能是修复受损心脏的一种潜在途径。然而，诱导心肌细胞重编程的效率较低，已成为进一步开展机制研究的主要障碍。此外，心脏重编程的可重复性是该技术面临的另一争议性问题。11,30,31. 
最近，我们构建了一整套多顺反子载体，将 G、M、T 三个基因以所有可能的剪接顺序排列，并在单个 mRNA 中使用相同的 2A 序列。这些多顺反子载体导致 G、M 和 T 蛋白的表达水平各不相同，从而产生显著差异的重编程效率25。其中效率最高的构建体命名为 MGT，其表现出相对较高的 Mef2c 表达以及较低的 Gata4 和 Tbx5 表达，显著提高了重编程效率，并生成大量表达心肌细胞标志物、具有强烈钙振荡和自发性搏动功能的诱导心肌样细胞（iCMs）25。此外，通过使用 MGT 多顺反子载体，我们的研究避免了多个载体的使用，获得了 G、M、T 表达比例均一的细胞，从而为心脏重编程研究提供了更优的实验平台。为了提高实验的可重复性，本文详细描述了如何分离成纤维细胞、制备携带 MGT 表达盒的逆转录病毒、诱导生成 iCMs 以及评估重编程效率的方法。

<table><tbody><tr><td>抗心肌肌钙蛋白T</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MS-295-PO</td><td>FACS 为 1:200，ICC 为 1:400</td></tr><tr><td>抗GFP</td><td>Life Technologies</td><td>A11122</td><td>FACS 和 ICC 均按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>抗α-辅肌动蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td>FACS 和 ICC 均按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>抗连接蛋白43</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6219</td><td>1:500 稀释比例用于&amp;nbsp; 免疫细胞化学</td></tr><tr><td>抗-Mef2c</td><td>Abcam</td><td>ab64644</td><td>1:1,000 用于免疫细胞化学&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗Gata4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1237</td><td>1:200 用于免疫细胞化学</td></tr><tr><td>抗Tbx5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17866</td><td>1:200 用于免疫细胞化学</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&amp;ndash;偶联驴抗兔IgG</td><td>杰克逊免疫研究公司</td><td>711-545-152</td><td>FACS 和 ICC 均按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647&amp;ndash;偶联驴抗小鼠IgG</td><td>杰克逊免疫研究公司</td><td>715-605-150</td><td>FACS 和 ICC 均按 1:500 稀释</td></tr><tr><td>胞内染色用Cytofix/Cytoperm试剂盒</td><td>BD 生物科学</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-3 钙离子成像试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>R10145</td><td></td></tr><tr><td>Thy1.2 微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-101</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的Vectashield溶液</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-2442</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%）</td><td>康宁</td><td>25-052</td><td></td></tr><tr><td>PRMI1640 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 低血清培养基</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>M199 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>10-060</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖</td><td>Life Technologies</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>康宁</td><td>30-002</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>Life Technologies</td><td>11130-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668500</td><td></td></tr><tr><td>blasticidin</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶II</td><td>沃辛顿</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PX1405</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>逆转录病毒沉淀液</td><td>ALSTEM</td><td>VC-200</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>不含 CaCl 的杜尔贝科磷酸盐缓冲液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; （D-PBS，1×）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（Hanks平衡盐溶液）</td><td>康宁</td><td>21022</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m 醋酸纤维素滤膜&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>康宁</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 组织培养皿&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>172958</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 中心孔培养皿&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>96孔透明V型底2 ml聚丙烯深孔板</td><td>德文特科学</td><td>P9639</td><td></td></tr><tr><td>带细胞筛帽的聚苯乙烯圆底管&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer MINI</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 细胞成像系统</td><td>Life Technologies</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>圆形玻璃盖玻片</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72195-15</td><td></td></tr></tbody></table>

利用表达最佳比例gata4、mef2c和tbx5的多顺反子载体改进诱导心肌细胞的生成

Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5

将心脏成纤维细胞（CFs）直接转化为诱导性心肌细胞（iCMs）为再生医学提供了治疗心脏病的替代策略，具有广阔的应用前景。这种转化可通过强制表达特定因子实现，例如 Gata4（G）、Mef2c（M）和 Tbx5（T）。传统上，iCMs 的生成依赖于分别表达这些因子的病毒混合物。然而，重编程效率相对较低，且大多数 体外 G、M、T转导的成纤维细胞无法完全重编程，这使得重编程机制的研究变得困难。我们近期已证明，G、M、T三者的表达比例对诱导心肌样细胞（iCM）重编程效率至关重要。通过使用我们构建的多顺反子MGT载体（下文简称MGT），可实现M相对高表达、G和T低表达的最优比例，显著提高重编程效率并改善iCM的质量 体外在此，我们详细描述了利用携带MGT构建体的病毒从心肌成纤维细胞诱导生成诱导性心肌样细胞（iCMs）的方法。本文还包括心肌成纤维细胞的分离、重编程病毒的制备以及重编程过程的评估，旨在建立一个高效且可重复的iCMs生成平台。

重编程步骤的示意图见图1。在MGT转导后，重编程细胞中的GFP表达最早可在第3天检测到。若使用pMx-puro-MGT质粒，则从第3天开始对转导细胞进行嘌呤霉素筛选，并在前两周内持续维持。在第10至第14天，可通过免疫细胞化学染色（图2B，步骤5）和流式细胞术（图2A，步骤6）检测到心肌标志物（如cTnT和α-肌动蛋白）的表达，表明起始的成纤维细胞正在向心肌细胞命运方向进行重编程。
<img alt="心脏细胞重编程时间线示意图；步骤包括分离、感染、嘌呤霉素处理、跳动细胞。" src="/files/ftp_upload/53426/53426fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：直接心脏重编程过程的示意图。 各时间点的操作在黑色方框中描述。每个阶段的培养基显示在时间线下方的彩色方...

本文介绍了一种利用逆转录病毒介导的多顺反子载体递送Gata4、Tbx5和Mef2c来生成诱导心肌样细胞（iCMs）的实验方案。该方案可获得相对均一的重编程细胞群体，且重编程效率和细胞质量得到提升，对今后iCM重编程的研究具有重要价值。

利用表达最佳比例Gata4、Mef2c和Tbx5的多顺反子载体改进诱导心肌细胞的生成

心脏成纤维细胞（CFs）直接转化为诱导性心肌细胞（iCMs）为再生医学提供了替代性策略，具有广阔的应用前景……

本方案的总体目标是展示如何利用表达最佳比例 GATA4、F2C 和 TBX5 的多顺反子 MGT 构建体，高效地将心肌成纤维细胞诱导转化为心肌细胞。该方法为诱导性心肌细胞研究提供了有价值的平台，将有助于开展诱导性心肌细胞编程的高通量筛选和机制研究，同时推动该领域向临床应用迈进。该技术的主要优势在于，仅需使用单一的逆转录病毒载体，即可高效地将心肌成纤维细胞转化为心肌细胞。用75%体积比的乙醇清洁新生α肌球蛋白重链GFP转基因小鼠，实施安乐死。然后使用无菌、钝头弯镊，从一侧腋下至另一侧腋下做水平切口，打开体腔。取出心脏并将其置于含有冰的24孔板的一个孔中，用冰冷的PBS处理，通过荧光显微镜观察整个心脏的GFP表达情况。使用无菌镊子和剪刀将三至四个GFP阳性心脏放入60毫米中心孔培养皿中，将心脏剪切成小于1立方毫米的小块。将剪碎的心脏组织转移至10厘米培养皿中，并用2毫升纤维母细胞培养基（FB培养基）覆盖。将培养皿置于37°C培养箱中，静置至少3小时，期间勿扰动。孵育结束后，缓慢向含有剪碎心脏组织的培养皿中加入8毫升预热的FB培养基。随后在不干扰组织的情况下孵育，仅每三天更换一次培养基。第7天时，吸除培养基，并用DPBS洗涤细胞。每孔加入3毫升含EDTA的0.05%胰蛋白酶溶液，于37°C孵育5分钟。加入 5 mL FB 培养基以灭活胰蛋白酶，然后用细胞刮轻轻刮下细胞。接着收集细胞，并通过 40 µm 细胞滤网过滤，以避免心肌组织碎片污染。将细胞悬液在 200 ×g 离心 5 分钟，形成细胞沉淀，起始材料为分离的新生小鼠心脏。将每个心脏切成四块，仍保持松散连接。将心脏组织转移至含有 8 毫升预热的 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 的 15 毫升锥形管中，在 37 摄氏度孵育 15 分钟。孵育结束后，弃去胰蛋白酶 EDTA 溶液，加入 5 毫升预热的 II 型胶原酶，中等速度涡旋震荡 1 分钟，然后将管子置于 37 摄氏度水浴中孵育 3 至 5 分钟。然后再次涡旋振荡试管一分钟。静置使组织块沉淀，收集上清液至另一含有5 mL冷FB培养基的新试管中。向组织块中加入5 mL新鲜的II型胶原酶，重复涡旋振荡和孵育步骤。通过40微米细胞滤网过滤，合并所有含有上清液的细胞。在4°C条件下，以200 × g离心5分钟。采用任一心肌成纤维细胞分离方法后进行后续操作。用10毫升磁性激活细胞分选缓冲液或max缓冲液将最终的细胞沉淀洗涤一次。取10微升用于活细胞计数，其余细胞在4°C下以200 × g离心5分钟（细胞数量少于1 × 10⁷时）。将细胞沉淀重悬于90微升预冷的max缓冲液中的10微升thigh 1.2偶联磁性微珠中，并混匀。将珠子在4°C下孵育30分钟。为沉淀细胞，加入10 mL Max缓冲液，以200 × g离心样品5分钟。用10 mL Max缓冲液洗涤一次，然后在细胞培养罩中将细胞沉淀重悬于总体积为2 mL的溶液中。安装一个max分离柱并添加LS柱。用3毫升max缓冲液平衡LS柱。将细胞悬液通过LS柱，并用2毫升max缓冲液洗涤3次。然后从分离柱上取下LS柱，并用两毫升最大缓冲液洗脱三次。将洗脱液收集到50毫升锥形管中。以200 × g离心洗脱液5分钟。将分离的成纤维细胞重悬于10毫升FB培养基中，计数细胞后，以适当的密度将细胞接种至经明胶预包被的24孔板中的组织培养皿中，用于重编程心脏成纤维细胞。向接种有细胞的24孔板每孔加入500微升含有poly brain的诱导型心肌细胞（ICM）培养基。向每孔分离的成纤维细胞中加入10微升逆转录病毒。将培养板与逆转录病毒颗粒在细胞培养箱中孵育 24 至 48 小时。然后将含有病毒的培养基更换为 500 µL 新鲜的 ICM 培养基，每两到三天更换一次培养基。通过在 ICM 培养基中添加 2 µg/mL 嘌呤霉素，开始对病毒转导细胞进行阳性筛选。经过三天的筛选后，将培养基更换为维持剂量的嘌呤霉素，浓度为每毫升一微克，以观察心肌成纤维细胞向心肌细胞的转化。使用倒置显微镜观察经嘌呤霉素筛选的培养板中GFP的表达情况。最后，在病毒处理后的第14天，将ICM培养基更换为B 27培养基。在病毒转导后三至四周，可观察到中等程度的自发搏动细胞灶，此时可检测到心肌标志物的表达，包括心肌肌钙蛋白T和α-辅肌动蛋白。通过免疫化学方法，在第10至14天即可检测到α-辅肌动蛋白。此处显示的是由成纤维细胞转化而来的iCMs中心肌肌钙蛋白T的表达，而iCMs中GFP标记的α-辅肌动蛋白表达也可见于此处。流式细胞术分析显示，心脏肌钙蛋白T的表达水平显著升高，尤其是在嘌呤霉素筛选诱导的心肌细胞后更为明显。本文所述的方法可通过单个载体中逆转录病毒递送NGT转录因子，高效地生成诱导性心肌细胞。

improved-generation-induced-cardiomyocytes-using-polycistronic

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

诱发心肌细胞的使用多顺反子构建表达GATA4，MEF2C和Tbx5中的最优比率改善发电

我们已建立了一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导心肌母细胞的方案，该方法能够大量获得用于心血管修复的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞。...

高效诱导多能人胚胎干细胞生成人心脏前体细胞和心肌细胞的小分子方法

生成排列整齐的心肌组织是将干细胞生物学的最新进展应用于临床实用目的的关键要求。本文中，我们描述了一种微接触印刷技术，可精确控制细胞形态与功能。利用高度纯化的胚胎干细胞来源的心脏前体细胞，我们进而生成了各向异性的功能性心肌组织。...

通过微接触印刷技术生成取向功能性心肌组织

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

本方案描述了如何从小鼠多能干细胞（PSC）生成具有功能的窦房结样组织。通过过表达T-Box3（TBX3）并结合心肌肌球蛋白重链（Myh6）启动子驱动的抗生素筛选，可获得高纯度的起搏细胞聚集体。这些“诱导性窦房结样结构”（iSABs）中起搏细胞比例超过80%，表现出显著增高的搏动频率，并能够驱动心肌组织节律性收缩。 离体.

基于ES细胞编程结合Myh6启动子筛选的小鼠心脏起搏细胞聚集体的生成

本论文描述了一种利用逆转录病毒介导的Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5递送方法，逐步生成并定量多种重编程心脏亚型的实验方案。...

通过转录因子介导的重编程评估小鼠胚胎成纤维细胞来源的心肌细胞亚型

本文介绍一种通过过表达GATA4、Hand2、Mef2c、Tbx5、miR-1和miR-133（GHMT2m）并同时抑制TGF-β信号通路，将原代胚胎成纤维细胞重编程为功能性心肌细胞的稳健方法。本方案在转导后最早7天即可生成搏动的心肌细胞，重编程效率高达60%。...

抑制促纤维化信号通路增强因子介导的小鼠胚胎成纤维细胞向诱导型心肌细胞的重编程

本文介绍一种可扩展的方法，通过简单组合使用Activin...

从人多能干细胞生成第一心场样心脏前体细胞及心室样心肌细胞

本文介绍了一种利用模拟心脏生理环境的电刺激和机械刺激来训练细胞群体的实验方案。这种电机械刺激可增强经处理细胞的心肌生成潜能，是在细胞治疗、疾病建模及药物筛选领域具有前景的策略。...

同步电刺激与机械刺激以增强细胞的心肌生成潜能

本方法的目的是在体外生成心区特异的心脏前体细胞，以研究前体细胞的特化过程和功能特性，并生成心腔特异的心脏细胞用于心脏疾病建模。...

体外生成心脏区域特异性心脏前体细胞

本文描述了一种Tg(Myh6-cre)1Jmk/J...

利用GCaMP3报告系统体外评估心脏重编程过程中的心肌特异性钙流

本方案介绍了一种基于电穿孔技术在发育中鼠心心脏细胞中进行转基因操作的详细方法学框架。所提供的视频资料将有助于学习和掌握这一多功能技术。...

一种高效转基因方法用于小鼠胚胎心脏的基因递送

了解如何使用多顺反子构建表达GATA4、MEF2C和Tbx5的最优比率，通过逆转录病毒递送系统高效将心脏成纤维细胞重编程为诱导心肌细胞。该方法为心脏再生研究提供重要平台。

利用表达最佳比例Gata4、Mef2c和Tbx5的多顺反子载体改进诱导心肌细胞的生成

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