利用表达最佳比例Gata4、Mef2c和Tbx5的多顺反子载体改进诱导心肌细胞的生成

本方案的总体目标是展示如何利用表达最佳比例 GATA4、F2C 和 TBX5 的多顺反子 MGT 构建体，高效地将心肌成纤维细胞诱导转化为心肌细胞。该方法为诱导性心肌细胞研究提供了有价值的平台，将有助于开展诱导性心肌细胞编程的高通量筛选和机制研究，同时推动该领域向临床应用迈进。该技术的主要优势在于，仅需使用单一的逆转录病毒载体，即可高效地将心肌成纤维细胞转化为心肌细胞。

用75%体积比的乙醇清洁新生α肌球蛋白重链GFP转基因小鼠，实施安乐死。然后使用无菌、钝头弯镊，从一侧腋下至另一侧腋下做水平切口，打开体腔。

取出心脏并将其置于含有冰的24孔板的一个孔中，用冰冷的PBS处理，通过荧光显微镜观察整个心脏的GFP表达情况。使用无菌镊子和剪刀将三至四个GFP阳性心脏放入60毫米中心孔培养皿中，将心脏剪切成小于1立方毫米的小块。

将剪碎的心脏组织转移至10厘米培养皿中，并用2毫升纤维母细胞培养基（FB培养基）覆盖。将培养皿置于37°C培养箱中，静置至少3小时，期间勿扰动。孵育结束后，缓慢向含有剪碎心脏组织的培养皿中加入8毫升预热的FB培养基。

随后在不干扰组织的情况下孵育，仅每三天更换一次培养基。第7天时，吸除培养基，并用DPBS洗涤细胞。每孔加入3毫升含EDTA的0.05%胰蛋白酶溶液，于37°C孵育5分钟。

加入 5 mL FB 培养基以灭活胰蛋白酶，然后用细胞刮轻轻刮下细胞。接着收集细胞，并通过 40 µm 细胞滤网过滤，以避免心肌组织碎片污染。将细胞悬液在 200 ×g 离心 5 分钟，形成细胞沉淀，起始材料为分离的新生小鼠心脏。

将每个心脏切成四块，仍保持松散连接。将心脏组织转移至含有 8 毫升预热的 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 的 15 毫升锥形管中，在 37 摄氏度孵育 15 分钟。孵育结束后，弃去胰蛋白酶 EDTA 溶液，加入 5 毫升预热的 II 型胶原酶，中等速度涡旋震荡 1 分钟，然后将管子置于 37 摄氏度水浴中孵育 3 至 5 分钟。

然后再次涡旋振荡试管一分钟。静置使组织块沉淀，收集上清液至另一含有5 mL冷FB培养基的新试管中。向组织块中加入5 mL新鲜的II型胶原酶，重复涡旋振荡和孵育步骤。

通过40微米细胞滤网过滤，合并所有含有上清液的细胞。在4°C条件下，以200 × g离心5分钟。采用任一心肌成纤维细胞分离方法后进行后续操作。

用10毫升磁性激活细胞分选缓冲液或max缓冲液将最终的细胞沉淀洗涤一次。取10微升用于活细胞计数，其余细胞在4°C下以200 × g离心5分钟（细胞数量少于1 × 10⁷时）。将细胞沉淀重悬于90微升预冷的max缓冲液中的10微升thigh 1.2偶联磁性微珠中，并混匀。

将珠子在4°C下孵育30分钟。为沉淀细胞，加入10 mL Max缓冲液，以200 × g离心样品5分钟。用10 mL Max缓冲液洗涤一次，然后在细胞培养罩中将细胞沉淀重悬于总体积为2 mL的溶液中。

安装一个max分离柱并添加LS柱。用3毫升max缓冲液平衡LS柱。将细胞悬液通过LS柱，并用2毫升max缓冲液洗涤3次。

然后从分离柱上取下LS柱，并用两毫升最大缓冲液洗脱三次。将洗脱液收集到50毫升锥形管中。以200 × g离心洗脱液5分钟。

将分离的成纤维细胞重悬于10毫升FB培养基中，计数细胞后，以适当的密度将细胞接种至经明胶预包被的24孔板中的组织培养皿中，用于重编程心脏成纤维细胞。向接种有细胞的24孔板每孔加入500微升含有poly brain的诱导型心肌细胞（ICM）培养基。向每孔分离的成纤维细胞中加入10微升逆转录病毒。

将培养板与逆转录病毒颗粒在细胞培养箱中孵育 24 至 48 小时。然后将含有病毒的培养基更换为 500 µL 新鲜的 ICM 培养基，每两到三天更换一次培养基。通过在 ICM 培养基中添加 2 µg/mL 嘌呤霉素，开始对病毒转导细胞进行阳性筛选。

经过三天的筛选后，将培养基更换为维持剂量的嘌呤霉素，浓度为每毫升一微克，以观察心肌成纤维细胞向心肌细胞的转化。使用倒置显微镜观察经嘌呤霉素筛选的培养板中GFP的表达情况。最后，在病毒处理后的第14天，将ICM培养基更换为B 27培养基。

在病毒转导后三至四周，可观察到中等程度的自发搏动细胞灶，此时可检测到心肌标志物的表达，包括心肌肌钙蛋白T和α-辅肌动蛋白。通过免疫化学方法，在第10至14天即可检测到α-辅肌动蛋白。此处显示的是由成纤维细胞转化而来的iCMs中心肌肌钙蛋白T的表达，而iCMs中GFP标记的α-辅肌动蛋白表达也可见于此处。

流式细胞术分析显示，心脏肌钙蛋白T的表达水平显著升高，尤其是在嘌呤霉素筛选诱导的心肌细胞后更为明显。本文所述的方法可通过单个载体中逆转录病毒递送NGT转录因子，高效地生成诱导性心肌细胞。