协议中再生的小鼠肠道使用条件潘氏细胞中的作用分析的Cre-LOX小鼠模型

该解剖程序的总体目标是演示如何分离和准备小鼠肠道以进行后续表征技术。该方法可用于研究肠道干细胞在实验程序后重新填充肠道的能力。该技术的主要优点是它可以在任何技术或任何程序之后或在基因作后使用 小龙虾锁技术 首先将安乐死的成年小鼠置于仰卧位，并用 70% 乙醇润湿皮毛。

然后用剪刀沿中线纵向打开腹膜腔，并用镊子固定胃。接下来，切断与食道的连接，轻轻拉动胃部，将小肠切除至阑尾。然后轻轻拉动阑尾，将大肠切除至肛门。

分离肠道后，取出阑尾中的胃，并使用配备钝头移液器吸头的注射器在冲洗后立即用 PBS 冲洗肠道，将肠道切成三个大小相等的近端、中段和远端部分。然后将每个切片切成 1 厘米的小块，并将 3 到 5 块组织碎片放在 2 x 2 厘米的手术胶带的中间。在金字塔形中，当所有组织都已连接完毕后，将胶带纵向密封在碎片周围，形成一个原木堆。

然后将胶带放入一个平底容器中，该容器中含有至少 10 倍于组织体积的中性、缓冲、正式和固定体积，并在包埋和切片前将样品储存在 4 摄氏度。固定后，将组织转移到平底容器中，其中含有至少 10 倍体积的 70% 乙醇作为组织体积，以在冲洗后立即将组织固定在 Metcon 中。将肠子切成三个大小相等的部分，就像刚才演示的那样。

然后将每个部分并排放在一张 15 x 15 厘米的滤纸上，当所有部分都被分割后，用弹簧弓剪刀打开 FOSS 上的切片。固定结束时，将滤纸转移到装有新鲜制备的 Metcon 的玻璃皿中，在室温下放置 3 至 24 小时，用镊子一次捡起每块肠子的末端，并将组织缠绕在镊子周围，形成单独的瑞士卷。通过轻轻打开镊子并将 25 号针头插入组织来固定每个卷。

然后将卷好的组织放入一个平底容器中，该容器中含有至少 10 倍体积的中性缓冲配方奶粉和固定剂，与组织相同，至少一小时，然后再处理整个组织破裂的 Mount Laxy 可视化。将熔融的生蜡与矿物油混合倒入 15 厘米的培养皿中。然后，在用冰冷的 PBS 冲洗肠道后，立即用 25 毫升冰冷的停产固定剂冲洗组织。

固定后，将肠子切成 3 到 5 相等的部分，并将每个部分放在其中一个冷却的蜡板上。固定每一端，使切片略微拉伸，板顶部的肠系膜线。修剪多余的肠系膜。

然后用弹簧弓剪断内脏，当所有部分都被固定时，它们被打开。在 4 摄氏度下至少一小时后，用足够的 xal 固定剂淹没板以覆盖所有组织。使用 25 毫升移液器或注射器去除固定剂，并用 30 毫升 PBS 洗涤组织一次。

然后用 30 毫升 DTTD 统一溶液覆盖切片，在室温下摇动孵育 30 至 60 分钟。孵育结束时，用 25 毫升移液管或注射器去除神化溶液，然后用另外 30 毫升 PBS 淹没组织。然后在洗涤后使用后移液管用 PBS 去除粘液。

用 30 毫升 xal 替换 PBS，在室温下在黑暗中进行过夜染色，第二天早上在摇床上轻轻搅拌。如果切片出现蓝绿色染色，请用 30 毫升 PBS 替换 xal。轻轻搅拌 3 分钟后，如刚才所示制作瑞士卷，并将组织放入含有至少 10 倍于组织体积的适当固定剂体积的宽口平底容器中，在 4 摄氏度下放置至少 24 小时，然后再包埋和切片。

使用 ROSA 26 R Laxy 条件报告基因，使用从重组婴儿床中提取的 DNA，可以在诱导后 3 天在小肠中观察到 100% 重组。重组等位基因的 QPCR 显示 VI 折痕系统内的重组没有显着增加，这可能是由于未观察到潘氏细胞中的重组。使用使用 laxy 报告基因的 ah 折痕系统，两个系统还显示重组细胞在诱导后 3 天完全丢失。

有丝分裂和 K 隐窝细胞高度数据表明，ah H Cree 系统可以恢复，这可能是由于未结合的肠道干细胞的重新填充。与此形成鲜明对比的是，反派 Cree 尽管保留了上皮隐窝细胞，但未能恢复。此外，vi Cree Cantin B 植绒小鼠的隐窝细胞不增殖且缺乏肠道干细胞标志物的表达。

EM 四。与 ah cre 小鼠中的隐窝类似，PTH 细胞仅在 VI Cree 系统内发生 Caden b 缺失后发生凋亡。掌握后，这项技术可以在大约 10 分钟内完成。

重要的是要尽量减少延迟以防止组织降解。观看此视频后，您应该对如何从小鼠中取出肠道进行下游分析有很好的了解。