Name: 对肌红蛋白鲸类检测基于金免疫层析胶体试纸条的研制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 了解基于胶体金免疫层析技术快速检测鲸类肌红蛋白的方法，用于区分鲸肉与海豹及其他动物肉类。该技术可在5至10分钟内完成现场筛查，具有高特异性和灵敏度，有助于打击非法鲸类贸易并保护海洋生物多样性。

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我们感谢中国台湾鲸豚学会、国立成功大学海洋生物及鲸豚研究中心、远雄海洋公园以及国立嘉义大学动物疾病诊断中心的同仁在样本采集方面提供的协助。本项目由台湾行政院农业委员会（100AS-02.1-FB99）向 WCY 提供资助。

伦理声明：本研究遵循国际指南，并经国立嘉义大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，批准编号：99022。鲸类样本的使用已获得中国台湾行政院农业委员会的许可（研究许可编号：100M-02.1-C-99）。
1. 肌肉样品制备和SDS-PAGE
注：本研究使用了来自23个物种的肌肉样本，包括16种海洋哺乳动物、5种陆生哺乳动物、金枪鱼和鸡（表1）。鲸类肌肉样本来源于搁浅个体、渔业兼捕及执法查没。兔、大鼠、犬和鸡的肌肉组织来自中国台湾嘉义大学动物疾病诊断中心。牛肉、猪肉、羊肉和金枪鱼样本购自当地超市。港海豹（Phoca vitulina）的肌肉样本由远雄海洋公园提供。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离肌肉样本中不同分子量的可溶性蛋白质。
<ol>
	<li>所有样品在使用前均需在 -20 °C 下保存。</li>
	<li>将研钵预冷至 -20 °C，然后加入 3 g 冷冻肌肉样品。</li>
	<li>使用组织匀浆器，加入 10 ml 冷的磷酸盐缓冲液（PBS）对样品进行匀浆处理。</li>
	<li>将匀浆后的样品在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟，收集上清液，并在使用前于 -20 °C 保存。</li>
	<li>配制 5 ml 的 5% 浓缩胶（含 3.07 ml 蒸馏水、1.25 ml pH 6.8 的 4× 上层胶缓冲液、625 µl 40% 丙烯酰胺、50 µl 10% 过硫酸铵（APS）和 5 µl 四甲基乙二胺（TEMED））以及 10 ml 的 15% 分离胶（含 3.65 ml 蒸馏水、2.5 ml pH 8.8 的 4× 下层胶缓冲液、3.75 ml 40% 丙烯酰胺、100 µl 10% APS 和 4 µl TEMED）。
	<ol>
		<li>在电泳槽中，待分离胶（15% 丙烯酰胺）凝固后，将浓缩胶（5% 丙烯酰胺）倒入其上层，并插入梳子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下条件进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：初始电泳条件为 100 伏，20 分钟；最终条件为 120 伏，40 分钟。</li>
	<li>用考马斯亮蓝在室温下染色 30 分钟，直至凝胶呈现均匀蓝色。 
	注意：当凝胶在染色液中不再可见时，表明染色已完成。</li>
	<li>用 10% 乙酸溶液在室温下脱色 1 小时，条带将开始显现。随后在 4 °C 继续脱色过夜，直至背景清晰。</li>
</ol>
2. 肽的合成与单克隆抗体的制备
<ol>
	<li>从 GenBank 中获取包括金枪鱼、鸡、鸵鸟、家养哺乳动物、海豹以及 18 种鲸类动物的肌红蛋白（Mb）氨基酸序列表 2).</li>
	<li>使用适当的软件对序列进行比对16:
	<ol>
		<li>通过选择启动比对浏览器 比对：编辑/构建比对 在启动栏中；选择 创建新比对 并点击 好的将出现一个对话框，询问 &#34;您正在构建DNA或蛋白质序列比对吗？&#34;</li>
		<li>点击标有 &#34;蛋白质&#34;；选择 数据：打开：从文件中检索序列 并选择序列文件；选择序列 编辑：全选 用于选择数据集中每条序列的所有位点，以创建多序列比对的菜单命令。</li>
		<li>选择 比对：使用 ClustalW 进行比对 从主菜单中选择使用 ClustalW 算法对选定的序列数据进行比对；选择 &#34;BLOSUM&#34; 作为蛋白质权重矩阵，然后单击 好的 按钮</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析序列比对：
	<ol>
		<li>聚焦于5个抗原反应位点17：位点1（AKVEADVA，15-22）、位点2（KASEDLK，56-62）、位点3（ATKHKI，94-99）、位点4（HVLHSRH，113-119）和位点5（KYKELGY，145-151），并找出在鲸类中保守的片段。*（星号；序列比对中的共识符号（方案2.2.3））表示具有单一且完全保守残基的位置。在鲸类中发现以下保守片段：序列KASEDLKKHG（包含位点2）和序列HVLHSRHP（包含位点4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据序列分析结果合成候选序列片段，并使用商业服务将其与卵清蛋白（OVA）偶联作为载体蛋白。
	<ol>
		<li>添加疏水性氨基酸（例如，甲硫氨酸）添加至抗原反应位点的N端，以防止该肽段降解（例如，M-KASEDLKKHG）。</li>
		<li>延长抗原反应位点的C端，以暴露核心抗原位点，使其更易被免疫细胞识别。此外，通过在肽段的C端添加一个半胱氨酸（Cys, C），将该肽与卵清蛋白（OVA）进行偶联。例如, M-KASEDLKKHG-NTVL-C)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将完全弗氏佐剂（用于免疫原1）或不完全弗氏佐剂（用于免疫原2）与等体积的各合成肽PBS溶液混合乳化（3 ml，终浓度为30–50 µg/100 µl）。</li>
	<li>将免疫原1（0.1 mg）经皮下注射至5只雌性BALB/c小鼠，每只小鼠注射一次。</li>
	<li>使用免疫原2进行皮下加强注射，每两周一次，共注射五次；每次加强注射前，通过尾部采样法采集小鼠测试血清。</li>
	<li>确定血清在初次筛选中的滴度。
	<ol>
		<li>将100 µg游离肽溶解于25 ml反应缓冲液中，取50 µl该溶液分装至96孔板的每个孔中。向每孔加入10 µl偶联试剂溶液，混匀。室温孵育2小时。</li>
		<li>移除孔内液体，每孔用蒸馏水洗涤3次，每孔加入200 µl封闭液封闭。室温孵育1小时。移除孔内液体，每孔用蒸馏水洗涤3次。</li>
		<li>采用间接ELISA法（方案5.1-5.7）测定血清效价，进行初筛。选择效价最高（光密度值最高）的小鼠，用于脾脏采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在采集脾脏前3天，将0.1 mg免疫原1经皮下接种至滴度最高的小鼠体内。</li>
	<li>从选定的免疫小鼠中收集脾细胞，并与小鼠骨髓瘤细胞 F0 (sp2/0-Ag14) 融合，以获得用于单克隆抗体生成的杂交瘤细胞18.</li>
	<li>融合后14天，通过间接ELISA（方案5.1-5.7）检测杂交瘤上清液对游离合成肽的反应性，筛选阳性克隆。</li>
	<li>将细胞稀释至每孔适当数量，以最大化每孔仅含单个克隆的比例（稀释克隆法）。
	<ol>
		<li>向除A1孔（保持空置）外的所有96孔板孔中加入100 µl细胞培养基。</li>
		<li>向 A1 孔中加入 200 µl 细胞悬液。然后迅速从 A1 孔转移 100 µl 至 B1 孔，并通过轻柔吹打混匀。沿该列依次进行 1:2 梯度稀释，最后从 H1 孔弃去 100 µl，使其最终体积与上方各孔一致。</li>
		<li>使用八通道移液器向第1列中再加入100 µl培养基。然后用同一移液器迅速将第1列各孔中的100 µl液体转移至第2列对应孔中，并通过轻柔吹打混匀。</li>
		<li>使用相同的方法，在整块板上重复进行1:2稀释。从最后一列各孔中弃去100 µl。</li>
		<li>向每个孔中加入 100 µl 培养基，使所有孔的终体积达到 200 µl。将培养板置于 37 °C、湿润的 CO₂ 培养箱中静置孵育。2 培养箱</li>
		<li>检查每个孔，标记出仅含有单个菌落的孔。重复进行两次或更多次单克隆筛选，直至 &#62;90% 的含有单克隆的孔中可检测到抗体产生。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过蛋白质印迹和点印迹筛选克隆（方案 3.1-4.6）。随后将来自孔中的菌落转接至较大的容器中进行扩增培养，以获得单克隆抗体。通常将每个克隆转移至 12 孔板或 24 孔板中的单个孔内。</li>
	<li>通过蛋白质印迹和点印迹（方案 3.1-4.6）测定单克隆抗体与牛、山羊、猪、狗、兔、金枪鱼、鸡、海豹以及四种代表性鲸类物种肌肉提取物之间的亲和力。</li>
	<li>接种选定的杂交瘤细胞（最多 3 x 106) 腹腔注射小鼠以诱导腹水。通常在杂交瘤细胞注射后7-10天可观察到腹部肿胀。使用皮下注射针头（小于20号）收集液体。</li>
	<li>离心腹水液（10,000 × g，10 分钟），以去除细胞和碎片。经 0.45 µm 滤膜过滤。向蛋白 G Sepharose 柱中加入 1 至 20 ml 样品、15 ml 结合缓冲液以及 3 至 5 ml 洗脱缓冲液。收集洗脱组分，其中含有从小鼠腹水液中纯化的抗体。</li>
	<li>使用抗体分型试剂盒，按照制造商说明书确定抗体的同种型。</li>
</ol>
3. 蛋白质印迹
<ol>
	<li>通过将950 µl的2x Laemmli上样缓冲液与50 µl的β-巯基乙醇（BME）混合，制备含β-巯基乙醇的2x上样缓冲液。将肌肉上清液（方案1.1–1.4）按适当比例用上样缓冲液稀释，以获得良好的信号：当使用多克隆兔抗人肌红蛋白抗体时，稀释比例为1:50（鲸类和海豹）和1:5（家养动物和金枪鱼）；当抗体来自杂交瘤上清液时，稀释比例为1:1（猪、兔、鸡和金枪鱼）、1:5（牛、山羊和狗）以及1:25（鲸类和海豹）。</li>
	<li>在95 °C加热样品5分钟。将样品连同分子量标记物一起加入SDS-PAGE凝胶（4%丙烯酰胺浓缩胶和12%丙烯酰胺分离胶）的加样孔中。先以50 V电压电泳5分钟，然后将电压升至150 V，继续运行约1小时完成电泳。</li>
	<li>将凝胶置于1x转移缓冲液中15分钟。在蛋白质经PAGE分离后，将其转移至硝酸纤维素（NC）膜上。转移可在100 V条件下进行60–90分钟。</li>
	<li>配制封闭液：含0.1% Tween 20和5%脱脂奶粉的1x PBS溶液。将NC膜置于25 ml封闭液中，室温下封闭1小时。随后用15 ml含吐温20的磷酸盐缓冲盐水（PBST）洗涤三次，每次5分钟。</li>
	<li>将膜与一抗（腹水液或杂交瘤上清液）共同加入10 ml抗体稀释缓冲液中，该缓冲液用5%封闭液稀释，于4 °C孵育过夜。</li>
	<li>再次用PBST洗涤膜三次，每次5分钟，以去除未结合的过量抗体。</li>
	<li>将膜与碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体按1:1,250比例溶于封闭液中，室温下轻柔振荡孵育1小时。</li>
	<li>再次洗涤膜，然后将其置于5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四氮唑氯化物（BCIP/NBT）碱性磷酸酶底物混合液中，孵育10至20分钟，直至显色出现。</li>
	<li>通过多次更换蒸馏水洗涤膜，终止反应。</li>
</ol>
4. 点印迹
<ol>
	<li>将肌肉上清液（方案 1.1–1.4）用含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBST 按适当比例稀释，以获得良好的信号：家畜和金枪鱼为 1:5，鲸类和海豹为 1:25。取 5 µl 样品点样至膜上。缓慢加样以尽量缩小溶液渗透面积（通常直径为 3–4 mm）。</li>
	<li>室温下干燥膜例如， 在层流条件下静置30-60分钟，于培养皿中用封闭液在室温下封闭1小时，然后用PBST洗涤。</li>
	<li>将膜与一抗（杂交瘤上清液按1:10,000稀释或腹水按1:100,000稀释，溶于5%封闭液）在室温下孵育1小时。</li>
	<li>用PBST洗涤膜3次，每次5分钟，以去除过量的一抗，然后在室温下用二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG，按1:1,250比例溶于5%封闭液）孵育1小时。</li>
	<li>再次洗涤膜，并在10至20分钟内将其孵育于BCIP/NBT磷酸酶底物混合液中，直至显色。</li>
	<li>通过多次更换蒸馏水洗涤膜来终止反应。</li>
</ol>
5. 间接ELISA
<ol>
	<li>配制洗涤缓冲液（含0.02% Tween 20的0.002 M咪唑缓冲盐溶液）。在后续每一步之间，均用洗涤缓冲液洗涤酶标板3次（参见方案5.2–5.5）。</li>
	<li>用包被缓冲液将肌肉上清液（参见方案1.1–1.4）按1:25比例稀释。每孔加入100 µl稀释后的上清液，于4 °C包被过夜，随后在室温下用封闭缓冲液（含1% BSA的PBS）封闭1小时。</li>
	<li>用稀释缓冲液将纯化的单克隆抗体（mAb）按1:2,000比例稀释，每孔加入100 µl稀释后的抗体，于室温孵育1小时。</li>
	<li>加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（按1:200比例用稀释缓冲液稀释），继续孵育。</li>
	<li>每孔加入过氧化物酶底物溶液100 µl，孵育10–15分钟。</li>
	<li>当观察到显色反应时，每孔加入100 µl过氧化物酶终止液以终止酶反应。</li>
	<li>使用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的光密度值。</li>
</ol>
6. 胶体金标记单克隆抗体的制备
注意：胶体金溶液及混合液的颜色应始终保持红色。若观察到黑色沉淀，需调节pH值、单克隆抗体浓度或离心速度。步骤6.1和6.2为优化步骤。
<ol>
	<li>将纯化的检测用单克隆抗体（50 µg/ml，3 µl）加入 100 µl 胶体金溶液中，溶液 pH 值范围为 5–9。保持溶液红色持续两小时的最低 pH 值即为最适 pH。注意：本研究中使用 0.1 M 碳酸钾将胶体金（40 nm）溶液调节至 pH 8.0（最适 pH）。</li>
	<li>在 pH 8.0 条件下，向 100 µl 胶体金溶液中加入不同体积的纯化检测用单克隆抗体（500 µg/ml，1–20 µl）。注意：本研究中的最适浓度为 6 µg/ml（无黑色沉淀）。</li>
	<li>根据上述结果，将 60 µg 纯化的检测用单克隆抗体逐滴加入 10 ml 胶体金溶液中，室温下轻轻乳化混合物 10 分钟。然后向混合物中加入 2 ml 含 5% BSA 的 PBS 溶液（pH 7.4），室温下轻轻乳化 15 分钟，以降低背景干扰。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 10,000 × g 离心 30 分钟。</li>
	<li>小心移除未结合抗体的上清液，将所得沉淀物重悬于 4 ml 含 1% BSA 和 0.1% Tween 20 的 PBST 溶液中，并重复离心与重悬数次。</li>
	<li>将最终的沉淀物重悬于 1 ml PBST 溶液中，4 °C 保存备用。</li>
</ol>
7. 免疫试纸条的构建
注意： 图1 显示免疫试纸条的设计。在低湿度的实验室环境条件下制备并组装试纸条（&#60; 20% 相对湿度）以延长储存寿命（&#62; 1年）。垫材和膜的尺寸分别为：结合垫300 mm × 10 mm，吸收垫300 mm × 24 mm，样品垫300 mm × 24 mm，NC膜300 mm × 25 mm，纸板300 mm × 80 mm。
<ol>
	<li>用移液器将步骤6.6中的胶体金标记单克隆抗体溶液加入，充分浸润结合垫，然后在37 °C下干燥1小时，再进行组装。</li>
	<li>使用移液器或免疫条带打印机，在硝酸纤维素膜（NC膜）的检测区包被特异性抗原捕获单克隆抗体（500 µg/ml），在质控区包被兔抗鼠IgG抗体（500 µg/ml）以检测单克隆抗体；两个区域之间应保持一定距离（&#62;5 mm），避免相互干扰。</li>
	<li>用双面胶将结合垫、吸收垫和NC膜粘贴到粘贴板上。 
	注意：结合垫和吸收垫应分别与NC膜两端重叠约2 mm。不恰当的试纸条组装会导致检测不完全。</li>
	<li>将样品垫覆盖在结合垫上（重叠约2 mm），并粘贴固定于粘贴板上。</li>
	<li>使用切纸器将组装好的材料切割成6 mm宽的试纸条，装入含干燥剂的铝箔袋中密封，于4 °C保存备用。</li>
</ol>
8. 交叉反应性测试
<ol>
	<li>使用竹签或研磨棒，在1.5 ml离心管中将0.03 g原始肌肉样品与1 ml PBS（含0.1% BSA）匀浆。</li>
	<li>握住试纸条远离检测区域的一端，将样品垫部分浸入样本中，持续5-10分钟，然后直接观察结果。
	<ol>
		<li>可选：收集 500 µl 上清液，转移至新的离心管中。 
		注意：如果将膜条直接浸入上清液时信号不明显，则建议执行此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每种肌肉样品均设三个重复进行检测。 
	注意：此处我们检测了金枪鱼、鸡、海豹、15种鲸类动物以及5种陆生哺乳动物。</li>
	<li>五名独立检查员各自重复步骤 8.3 五次， 即，总共使用575条试纸条。</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

使用与载体蛋白偶联的合成肽作为免疫原，其效果显著优于相应的天然蛋白。对于基于夹心法的技术，由于单克隆抗体是利用已知相对位置的表位开发的，本研究中的两种单克隆抗体不太可能相互干扰其与目标抗原表位的结合。此外，用合成肽-载体偶联物免疫小鼠所产生的抗体与天然蛋白之间的反应性，可能强于由天然蛋白免疫所产生的抗体与天然蛋白之间的反应性19。因此，建议在免疫程序中使用合成肽偶联物，以有效产生合适的抗肽单克隆抗体。
蛋白质的结构主要涉及多肽链中氨基酸的序列。每个氨基酸都有其侧链，从而赋予特定的性质，而氨基酸序列的微小改变会导致结构变化。由于长度为10-20个氨基酸的肽段非常适合用于抗体的制备，因此在C末端区域合成了较长的肽段（免疫原），以确保核心抗原区域能够被有效识别。因此，可以有效区分不同动物肌红蛋白（Mbs）中导致表位结构差异的氨基酸残基。例如，图3A 显示了所述肽段设计使得CGF5H9与鲸类动物强烈反应，但与海豹无反应。另一个例子是CGF5H9对鸡和狗具有不同的亲和力，尽管鸡在核心抗原位点2的序列与狗完全相同。这表明外部区域的序列差异...

历史上，鲸豚类动物的肉在全球许多地区曾被食用，且至今仍存在此类消费行为1。由于鲸豚类处于食物链较高营养级，其肉类中已知含有较高水平的汞及其他毒素2。因此，食用鲸豚类肉类不仅可能对孕妇等高风险人群造成健康问题，也可能影响一般人群3。此外，在鲸豚类肉类的加工和储存过程中，还可能受到人畜共患或潜在人畜共患病原体的污染4。即使是经验丰富的专业人员，也难以仅凭外观准确识别鲸豚类肉类。因此，需要一种可靠的科学鉴定方法，以区分鲸豚类肉类与其他肉类，从而有助于限制鲸豚类肉类的消费。
目前物种鉴定的方法包括分子技术和免疫学方法。分子技术（如聚合酶链式反应（PCR）和DNA测序）不仅可以用于鉴定生肉5和腐败样本6，还可用于鉴定加工食品，如熟香肠和饲料7,8。免疫学方法（如酶联免疫吸附测定（ELISA））通常应用于食品生产中，以检测猪肉9、牛肉10和鲶鱼11等肉类成分。基于PCR的DNA分析可用于鲸豚类肉类的鉴定12，并已在日本、韩国、菲律宾、中国台湾、中国香港、俄罗斯、挪威和美国帮助遏制了鲸豚类肉类的非法国际贸易1。这些方法有效且可靠，但通常需要数小时甚至数天才能完成，且操作步骤繁琐。鲸豚类肉类的鉴定通常依赖于分子技术，目前尚无可用的免疫学方法。对于监管机构而言，开发一种可靠且快速、可用于现场鉴定鲸豚类肉类的技术具有重要意义。
免疫层析试纸条作为一种检测工具，具有通过简单操作流程快速获得结果的优势，适用于现场使用。免疫层析试纸条与酶联免疫吸附测定（ELISA）的原理非常相似，均包括抗体、抗原和标记物。在免疫层析试纸条的开发中，已使用多种不同的标记物，如胶体金、碳和乳胶。目前，该方法常用于检测抗生素、毒素、细菌和病毒13，但极少用于肉类中蛋白质的鉴定14,15。本文提出一种侧向流动层析酶免疫分析法，用于快速检测鲸类肌红蛋白（Mb）。

<table><tbody><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>AMRESCO</td><td>J373</td><td></td></tr><tr><td>Protein G HP SpinTrap&amp;nbsp;</td><td>GE&amp;nbsp;Healthcare</td><td>28-9031-34</td><td>含有 Protein G Sepharose 的离心柱</td></tr><tr><td>IsoStrip 小鼠单克隆抗体分型试剂盒</td><td>Roche</td><td>11493027001</td><td>分型条带，预先包被针对小鼠 Ig 亚类和轻链特异性的抗体</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3935</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Whatman</td><td>Z613630</td><td></td></tr><tr><td>抗体封闭液&amp;nbsp;</td><td>LTK BioLaboratories</td><td></td><td>用于减少样本中非特异性 IgG 的非特异性结合</td></tr><tr><td>BCIP/NBT 磷酸酶底物&amp;nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-81-00</td><td></td></tr><tr><td>Protein Detector HRP 微孔试剂盒（抗小鼠）</td><td>KPL</td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA 板</td><td>Thermo&amp;nbsp;Fisher Scientific</td><td>EW-01928-08</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan&amp;nbsp;EX ELISA 读板仪&amp;nbsp;</td><td>Thermo&amp;nbsp;Electron&amp;nbsp;Corporation</td><td>51118170</td><td></td></tr><tr><td>胶体金（40 nm）溶液&amp;nbsp;</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td></td><td>40–50 nm 适用于免疫层析条</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Gibco</td><td>15561-020</td><td></td></tr><tr><td>快速检测免疫层析条打印机</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td>AGISMART RP-1000&amp;nbsp;</td><td>仅适用于研发用途的小规模免疫层析条生产</td></tr><tr><td>层析条组件（NC 膜、样品垫（#33 玻璃纤维，S&amp;S）、结合垫（#16S，S&amp;S）和吸收垫（CF6，Whatman））</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂&amp;rsquo;s adjuvant and incomplete Freund&amp;rsquo;s adjuvant&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881, F5506</td><td>用于制备抗原的油包水乳剂</td></tr><tr><td>丙烯酰胺、凝胶缓冲液、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）&amp;nbsp;</td><td>Protech</td><td></td><td>用于 SDS-PAGE 凝胶的制备</td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610436</td><td>SDS-PAGE 凝胶中蛋白质染色</td></tr><tr><td>Laemmli 上样缓冲液和 &amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737, 1610710</td><td>在上样至 SDS-PAGE 凝胶前稀释蛋白质样品</td></tr></tbody></table>

基于胶体金的免疫层析试纸条的研制及其在鲸类肌红蛋白检测中的应用

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

本方案描述了一种基于夹心法的胶体金免疫层析试纸条的研制方法，可用于区分鲸类与海豹及其他动物的肌红蛋白（Mb）。该试纸条可对鲸肉类进行快速、现场筛查，从而遏制其非法贸易与消费。研究开发了两种针对鲸类肌红蛋白具有反应性的单克隆抗体（mAbs）。通过分析多种动物肌红蛋白抗原反应区域的氨基酸序列，设计了两种合成肽（一种通用肽和一种特异性肽），并以此免疫制备单克隆抗体（亚类为IgG1）。通过间接ELISA、Western blot和点印迹法筛选杂交瘤，获得目标mAbs。其中，CGF5H9特异性结合兔、犬、猪、牛、山羊及鲸类的肌红蛋白，但对鸡、金枪鱼和海豹的肌红蛋白亲和力极弱或无亲和力；CSF1H13可强效结合海豹和鲸类的肌红蛋白，但对其他动物无亲和力。本研究使用了来自四个科（须鲸科、海豚科、鼠海豚科和小抹香鲸科）的鲸类样本，结果表明，这两种单克隆抗体对不同鲸类的肌红蛋白均具有广泛的结合能力。将这两种抗体应用于夹心型胶体金免疫层析试纸条：识别多种物种的CGF5H9标记胶体金作为检测抗体，而包被于检测区的CSF1H13用于检测鲸类和海豹肌红蛋白的存在。对金枪鱼、鸡、海豹、五种陆生哺乳动物以及15种鲸类的肌肉样本进行了三重复检测。所有鲸类样本均呈阳性结果，其余样本均呈阴性结果。

单克隆抗体特性
我们开发了两种IgG1单克隆抗体（CGF5H9和CSF1H13），分别针对鲸类肌红蛋白（cetacean Mb）的两种合成肽段（MKASEDLKKHGNTVLC和AIIHVLHSRHPAEFGC），并利用这些抗体构建了一种夹心型胶体金免疫层析试纸条，用于快速检测鲸类肌红蛋白。图2显示，CGF5H9在约17 kDa的预测分子量处检测到鲸类及其他哺乳动物，呈现单一染色条带。小须鲸（Balaenoptera acutorostrata）的条带强度相较于其他鲸类较弱。金枪鱼、鸡和海豹未出现条带，而猪在约50 kDa处出现条带。尽管猪和金枪鱼存在多个非特异性条带，但CSF1H13具有高度特异性，仅在约17 kDa的预测分子量处与鲸类和海豹反应产生条带。小须鲸仅在1:10稀释度下显示强信号（数据未显示），在1:25稀释度下无信号。图2显示点印迹实验结果相同。
<p class="jove_content" fo:keep-toge...

本方案描述了两种IgG类单克隆抗体（mAbs）的制备，这些抗体对鲸目动物的肌红蛋白具有强反应性。这些单克隆抗体被应用于基于夹心法的胶体金免疫层析试纸条，以区分鲸目动物与海豹及其他动物的肌红蛋白。

本方案描述了一种基于夹心法的胶体金免疫层析试纸条的研制方法，该试纸条可用于……

本胶体金免疫层析试纸条的总体目标是区分鲸豚类动物与海豹及其他动物的肌红蛋白。该方法可对鲸豚肉类进行快速、现场筛查，从而遏制其非法贸易与消费。该技术的主要优势在于，将0.3克肌肉组织匀浆后，可在5至10分钟内直接观察到结果，具有出色的特异性和灵敏度。因此，该方法可实现对鲸豚类肉类的现场快速检测，也可应用于其他肉类，如马肉或猪肉。为设计用于制备针对鲸豚类肌红蛋白的单克隆抗体的合成肽，需分析多种动物肌红蛋白抗原反应区域的氨基酸序列。首先从 GenBank 获取金枪鱼、鸡、鸵鸟、家养哺乳动物、海豹以及 18 种鲸类动物的肌红蛋白氨基酸序列。接着使用适当的软件对这些序列进行比对。通过在启动栏中选择“比对编辑/构建比对”来启动比对分析工具。选择“创建新比对”，然后点击“确定”。此时将弹出一个对话框，询问您是要构建 DNA 还是蛋白质序列比对。请点击标有“蛋白质”的按钮，选择“数据”→“打开”→“从文件中检索序列”，并选择序列文件。接着选择“编辑”→“全选”菜单命令，以选中数据集中每条序列的所有位点，用于创建多序列比对。从主菜单中选择“比对”→“使用 ClustalW 进行比对”。选择 BLOSUM 作为蛋白质权重矩阵，然后单击“确定”按钮。第三步是分析序列比对结果。重点关注五个抗原反应位点，并找出在鲸类中保守的片段。星号表示序列比对中的共识，代表该位置具有单一且完全保守的残基。在鲸类中发现了两个保守片段。随后合成候选序列片段，并用于制备单克隆抗体。首先确定胶体金溶液的最佳pH值，即能够使单克隆抗体与胶体金溶液混合物在两小时内保持红色的最低pH值。将0.15微克纯化的检测用单克隆抗体分别加入100微升pH值从5到9的胶体金溶液中。本实验中测试了 pH 6 和 pH 8 两种条件。通过该优化步骤确定 pH 8 为最佳 pH 值。接下来，在 pH 8 条件下，向 100 µL 胶体金溶液中加入不同量的纯化检测用单克隆抗体，以确定单克隆抗体的最佳浓度。最佳浓度在此项研究中为每毫升6微克，可使混合液保持红色，且无黑色沉淀产生。根据优化步骤的结果，将60微克纯化的检测用单克隆抗体逐滴加入10 mL胶体金溶液中。室温下轻轻乳化混合液10分钟。向混合物中加入2毫升含5% BSA的PBS溶液，室温下轻轻乳化15分钟，以减少背景干扰。在4°C条件下，以10,000 × g离心30分钟。离心后，小心移除含有未结合抗体的上清液，并将所得沉淀物重悬于4 mL含1% BSA和0.1% Tween-20的PBS-T中。重复离心和重悬步骤一至两次。将最终沉淀物悬浮于1 mL PBS-T中，4°C保存备用。此处展示免疫条带设计示意图。纸板、垫片和硝酸纤维素膜的尺寸详见实验方案文本。为延长储存寿命，免疫试纸条应在低湿度的实验室环境中制备和组装。使用微量移液器将胶体金标记的单克隆抗体溶液加入结合垫中，使其充分浸润，然后在 37 摄氏度下干燥一小时，再进行后续组装。待结合垫干燥后，使用双面胶带先将硝酸纤维素膜贴到纸板上。使用免疫试纸条打印机，将特异性抗原捕获单克隆抗体和快速抗小鼠IgG分别点在硝酸纤维素膜的检测区和对照区。两个区域之间的距离应保持在5毫米以上。然后将结合垫贴在硝酸纤维素膜的一侧，将吸收垫贴在另一侧，两侧的垫片相互重叠约两毫米。将样本垫覆盖在结合垫上，重叠两毫米，并将其贴在纸板上。使用切纸器裁出宽度为六毫米的条带。将试纸条与干燥剂一同装入铝箔袋中，4摄氏度保存备用。为进行交叉反应性测试，向0.03克生肌肉组织中加入1 mL含0.1% BSA的PBS，使用竹棒或研磨棒将样品匀浆化。握住免疫试纸条远离检测区的一端，将样品垫部分浸入样本中，持续5到10分钟。直接观察结果。每种肌肉样本均需进行三次重复检测。当两种单克隆抗体均检测到鲸类肌红蛋白时，T检测线会显示阳性信号。由于非鲸类动物的肌红蛋白只能被这两种单克隆抗体中的一种检测到，因此在检测其他动物的肌肉样本时，检测线显示阴性结果。C质控线应始终显示阳性结果，因为快速抗小鼠IgG可结合胶体金标记的检测抗体。对照线结果失败表明试纸条上的材料质量较差。利用杂交瘤上清液进行的西部血液分析显示，CGF5H9 单克隆抗体在约 17kDa 的预测分子量处检测到鲸类及其他哺乳动物，呈现单一染色条带。小须鲸的条带相较于其他鲸类的条带较弱。金枪鱼、海豹和鸡的样品中无条带，而猪在约50 kDa处可见条带。点样血液分析获得相同结果。尽管使用 CSF1H13 单克隆抗体进行的西方印迹血液分析在猪和金枪鱼样本中显示出多个非特异性条带，但 CSF1H13 具有高度特异性，因为它仅与鲸目动物发生反应。而海豹在预期分子量约为 17kDa 处出现一条条带。点状血液分析可获得相同的结果。使用纯化的CGF5H9对不同物种的肌肉提取物进行间接ELISA检测，结果显示牛、山羊、狗、兔子和鲸类呈阳性信号，猪呈弱阳性信号，而金枪鱼、鸡和海豹呈阴性信号。CSF1H13对鲸类和海豹具有高亲和力。这两种单克隆抗体均可与来自不同科的四种鲸类物种强烈反应，表明它们对多种鲸类物种具有广泛的反应性。免疫胶体金试纸条的特异性通过这些代表性结果展示。使用非鲸类肌肉样本时，仅在控制线处出现一条条带；而使用鲸类肌肉样本时，测试线和控制线处均出现信号条带。一旦掌握，若操作得当，标记抗体的制备及试纸条的构建可在四小时内完成。进行该实验时，务必注意仔细设计肽段，并采用多种方法筛选合适的单克隆抗体。使用高质量的胶体金制备标记抗体。按照这些步骤，还可进行其他方法，如基于 PCR 的 DNA 分析，以回答更多问题，例如鲸类物种及其来源地。CSF1H13 单克隆抗体具有强效性，且仅对海洋哺乳动物具有亲和力，可用于多种 ELISA 检测格式，为研究海洋哺乳动物肌红蛋白的生物学、生理学和化学特性提供了多种机会。观看本视频后，您应能够充分了解如何开发特异性单克隆抗体，并将其应用于快速检测试纸条。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

对肌红蛋白鲸类检测基于金免疫层析胶体试纸条的研制

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