对肌红蛋白鲸类检测基于金免疫层析胶体试纸条的研制
2016年7月13日
该方案描述了两种对鲸类动物肌红蛋白具有强烈反应的 IgG 类单克隆抗体 （mAb） 的开发。这些 mAb 应用于基于夹心格式的胶体金免疫层析试纸上，以区分鲸类动物与海豹和其他动物的 Mb。
这种胶体金免疫层析试纸的总体目标是区分鲸类动物的肌红蛋白与海豹和其他动物的肌红蛋白。这种方法可对鲸豚肉进行快速和现场筛查，从而限制其非法贸易和食用。该技术的主要优点是，在均质化 03 克肌肉后 5 到 10 分钟内可以直接观察到成功的结果，具有出色的特异性和敏感性。
所以这种方法可以提供现场鲸类动物肉的快速检测。它也可以应用于其他肉类，如马肉或猪肉。为了设计合成肽来培养对鲸类动物肌红蛋白具有反应性的单克隆抗体，分析了来自各种动物的肌红蛋白抗原反应区的氨基酸序列。
首先从 GenBank 中检索金枪鱼、鸡、鸵鸟、家养哺乳动物、海豹和 18 种鲸类动物的肌红蛋白氨基酸序列。接下来，使用适当的软件对齐序列。通过在启动栏上选择 Align Edit/Build Alignment 来启动 Alignment Explorer。
选择 Create New Alignment，然后单击 OK。将出现一个对话框，询问您是否正在构建 DNA 或蛋白质序列比对？单击标记为 Protein 的按钮，选择 Data Open Retrieve sequences from File，然后选择序列文件。选择 Edit Select All 菜单命令，为数据集中的每个序列选择所有站点，以创建多序列比对。
从主菜单中选择 Alignment Align by ClustalW。选择 BLOSUM 作为蛋白质重量矩阵，然后单击 OK 按钮。第三步是分析序列比对。
专注于 5 个抗原反应位点，发现该片段在鲸类动物中是保守的。星号表示比对中的共识，并表示具有单个完全保守残基的位置。在鲸类动物中发现了两个保守的片段。
然后合成候选序列片段并用于产生单克隆抗体。通过确定胶体金溶液的最佳 pH 值来开始此过程，胶体金溶液定义为使单克隆抗体和胶体金溶液混合物保持红色两小时的最低 pH 值。将 0.15 μg 纯化的检测单克隆抗体添加到 100 μL pH 值为 5 至 9 的胶体金溶液中。
为了进行本演示，我们测试了 pH 值 6 和 pH 值 8。在这个优化步骤中，pH 值 8 被认为是最佳 pH 值。接下来，通过在 pH 值为 8 的 100 μL 胶体金溶液中加入不同量的纯化检测单克隆抗体来确定单克隆抗体的最佳浓度。
最佳浓度为每毫升 6 微克，将使混合物的颜色保持红色，没有黑色沉淀。根据优化步骤的结果，将 60 μg 纯化的检测单克隆抗体滴加到 10 mL 胶体金溶液中。在室温下轻轻乳化混合物 10 分钟。
向混合物中加入 2 毫升 5% BSA 的 PBS 溶液，并在室温下轻轻乳化 15 分钟，以减少背景干扰。将混合物在 4 摄氏度下以 10， 000 倍 g 离心 30 分钟。离心后，小心地去除带有未偶联抗体的上清液，并将所得沉淀悬浮在含有 1%BSA 和 0.1%Tween-20 的 4mL PBS-T 中。
重复离心和悬浮一次或两次。将最终沉淀物悬浮在 1 mL PBS-T 中，并在 4 摄氏度下储存直至使用。免疫试纸设计图如下所示。
纸板、垫和硝酸纤维素膜的尺寸列在方案文本中。为了延长储存寿命，免疫条应在低湿度实验室环境条件下制备和组装。使用微量移液器将胶体金标记的单克隆抗体溶液添加到偶联垫中使其饱和，然后在 37 摄氏度下干燥垫 1 小时，然后再组装。
偶联垫干燥后，先用双面胶带将硝酸纤维素膜粘贴到纸板上。使用免疫条打印机，将特异性抗原捕获单克隆抗体和快速抗小鼠 IGG 分别分布在硝酸纤维素膜上的测试区和对照区。在两个区域之间保持大于 5 毫米的距离。
然后将共轭垫粘贴在硝酸纤维素膜的一侧，将吸收垫粘贴在另一侧，使每侧的垫重叠约 2 毫米。将样品垫放在共轭垫上两毫米，然后将其粘贴到纸板上。使用切纸机创建 6 毫米宽的条带。
将条带装在装有干燥剂的铝箔袋中，并在 4 摄氏度下储存直至使用。为了制备用于交叉反应性测试的样品，将 1mL 含有 0.1%BSA 的 PBS 添加到 0.03 克原始肌肉中。并使用竹签或研磨棒使样品均质化。
握住免疫条与测试区域相对的一端，将样品垫部分浸入样品中 5 到 10 分钟。直接观察结果。一式三份测试各种肌肉样本。
T 检测线旨在当两种单克隆抗体都检测到鲸类肌红蛋白时显示阳性信号。因为来自非鲸类动物的肌红蛋白只能通过这两种单克隆抗体中的一种来检测，所以当测试来自其他动物的肌肉样本时，测试线显示阴性结果。C 对照细胞系应始终显示阳性结果，因为快速抗小鼠 IGG 与胶体金标记检测抗体结合。
控制线中的失败结果表示带材上的材料质量差。使用杂交瘤上清液的蛋白质血液分析表明，CGF5H9 单克隆抗体将鲸类和其他哺乳动物检测为单个染色条带，预测分子量约为 17 kDa。普通小须鲸的带状比其他鲸类动物的带
状体显得相对较暗。金枪鱼、海豹和鸡肉没有条带。而在猪中观察到约 50kDa 的条带。通过点血分析可获得相同的结果。
尽管使用 CSF1H13 单克隆抗体的蛋白质血液分析显示猪和金枪鱼存在多个非特异性条带，但CSF1H13具有高度特异性，因为它仅与鲸类动物反应。并且密封的条带预测分子量约为 17 kDa。通过点血分析可获得相同的结果。
使用纯化的 CGF5H9 对不同物种的肌肉提取物进行间接 ELISA 的结果显示，牛、山羊、狗、兔和鲸类动物的阳性信号为阳性，猪的阳性信号较弱，金枪鱼、鸡和海豹的阳性信号较弱。CSF1H13 对鲸类和海豹表现出高亲和力。两种单克隆抗体都可以与来自不同科的所有四种鲸类动物发生强烈反应，表明它们对不同鲸类物种具有广泛的反应性。
这些代表性结果显示了免疫胶体金条的特异性。使用非鲸类肌肉样本导致控制线处只有一个条带。然而，当使用鲸类肌肉样本时，信号带同时存在于测试线和对照线。
一旦掌握，如果作得当，标记抗体的制备和条带的构建可以在 4 小时内完成。尝试此程序时，请务必记住仔细设计肽。使用多种方法筛选合适的单克隆抗体。
并使用高质量的胶体金制备标记抗体。遵循这些程序后，可以执行其他方法，例如基于 PCR 的 DNA 分析，以回答其他问题，例如鲸类物种及其来源。CSF1H13 单克隆抗体很强，仅对海洋哺乳动物表现出亲和力，可用于各种形式的 ELISA，这为研究海洋哺乳动物肌红蛋白的生物学、生理和化学方面提供了许多其他机会。
观看此视频后，您应该对如何开发特异性单克隆抗体并随后将它们应用于快速试纸有很好的了解。
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概述
该协议概述了一种胶体金免疫层析试纸检测条，旨在区分鲸目动物肌球蛋白与海豹及其他动物的肌球蛋白。该方法允许快速现场筛查鲸目动物肉类，有助于防止非法贸易。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 保护生物学
- 食品安全
背景
- 鲸目动物常常因其肉类而被非法猎捕。
- 肌球蛋白是用于识别不同类型肉类的关键蛋白。
- 快速检测方法对保护工作至关重要。
- 单克隆抗体可以在检测鲸目动物肌球蛋白方面提供特异性。
研究目的
- 开发与鲸目动物肌球蛋白特异性反应的单克隆抗体。
- 创建一种适用于现场的快速检测方法。
- 协助执行野生动物保护法。
使用的方法
- 开发IgG类单克隆抗体。
- 将抗体应用于胶体金免疫层析试纸上。
- 分析各种动物肌球蛋白的氨基酸序列。
- 测试检测鲸目动物肉类的特异性和敏感性。
主要结果
- 试纸可在5到10分钟内提供结果。
- 对鲸目动物肌球蛋白检测具有高特异性和高敏感性。
- 该方法也可适用于其他肉类。
- 成功区分了海豹和其他动物的肌球蛋白。
结论
- 开发的检测方法适用于快速现场检测鲸目动物肉类。
- 该方法可以帮助打击鲸目动物产品的非法贸易。
- 进一步的应用可能延伸到其他类型的肉类。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, field-deployable detection of cetacean myoglobin, supporting conservation and food safety initiatives by providing a specific biomarker for species identification. The sandwich-format immunochromatographic strip delivers results in 5–10 minutes with high specificity, reducing reliance on laboratory-based assays. It addresses the need for portable, reproducible tools in wildlife protection and illicit trade monitoring.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cetacean-specific myoglobin epitopes through monoclonal antibody screening.
- Operational Value: Supports functional target validation by distinguishing cetacean from seal and other mammalian myoglobins.
- Predictive Value: Provides a biomarker tool for assessing biological specificity in early-stage target de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized biological reagents (monoclonal antibodies) suitable for immunoassay format development.
- Reproducibility: Demonstrates consistent signal output across triplicate testing of diverse cetacean species.
- Quantitative Output: Enables visual readout correlated with antigen presence, supporting semi-quantitative screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Cetacean myoglobin serves as a disease-relevant biomarker for illegal wildlife product detection.
- Translational Continuity: Bridges antibody discovery to field-applicable diagnostic format for conservation enforcement.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on species-specific biomarker detection in complex matrices.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-validation continuum, supporting early biomarker verification and assay prototyping for conservation and food safety applications.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing regarding species-specific protein epitopes through peptide design and antibody screening.
- Screening: Produces standardized immunoreagents applicable to lateral flow and ELISA formats.
- Analytics: Delivers visual, binary readout enabling rapid comparison of sample conditions.
- Translational Research: Connects monoclonal antibody development to practical detection tool for wildlife monitoring.
- Enterprise Reuse: Antibody pairs and strip format can be adapted for other meat species or biomarker targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking through epitope-specific antibody pairing and sandwich assay design.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and room-temperature stability of test strips.
- Strategic Value: Supports rapid go/no-go decisions in field settings, reducing time and cost of species verification.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of conservation enforcement actions based on biomarker confirmation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in monoclonal antibody development, epitope mapping, and immunoassay design.
- Depends on colloidal gold conjugation infrastructure and nitrocellulose membrane printing capabilities.
- Necessitates cross-team standardization for antibody production, strip assembly, and storage conditions.
- Adaptation to other model systems requires re-evaluation of antibody specificity and peptide conservation.
- Practical limitations include dependence on sample homogenization and potential matrix effects in complex tissues.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Peptide Design and Synthesis for Raising Monoclonal Antibodies
3:06
Preparation of Colloidal Gold-labeled Monoclonal Antibody
5:13
Construction of Immune Strip
6:53
Cross-reactivity Test
8:07
Results: Cetacean Myoglobin Is Specifically Detected by the Immune Colloidal Gold Test Strips
10:16
Conclusion
