内毒素和DNA含量的空气采样滤波器分析

该程序的总体目标是描述如何准确分析在过滤器上采样的提取空气颗粒的内毒素和 DNA 含量。这种方法可以帮助回答室内和室外生物气溶胶研究中的关键问题，例如了解健康原因。演示过滤器采样程序的是我实验室的研究生 Yinon Mazar。

对于大体积采样，请使用由石英纤维制成的过滤器。或者选择最适合研究需求的特定滤光片类型以及滤光片截断值大小。首先将用于有机和生物化合物采样的过滤器单独包裹在铝箔中，对其进行预烘烤。

然后在 450 摄氏度的实验室炉中烘烤至少 5 小时。这将破坏任何预先存在的有机残留物。将烘烤好的过滤器储存在 20 摄氏度，直到它们用于采样。

接下来，清洁和消毒大容量进样器，如随附文本方案中描述的进样器。然后，将预烘烤的过滤器放入过滤器盒中，并按照制造商的说明运行采样器以收集适当的样品。在二级生物安全柜中，使用直径为 1.12 厘米的干净软木钻孔器切割 22 块干净的预烘烤圆形过滤材料。

使用这些碎片制备一系列内毒素加标过滤器，用作对照。接下来，使用直径为 1.12 厘米的干净软木钻孔器切割含有收集样品的过滤器，并将每个样品放入其自己的无热原的两毫利管中。此外，将干燥的内毒素加标过滤器转移到单独的无热原的两毫分管中。

向每管中加入 1 毫升无热原的水。并使用实验室摇床在室温下摇动 60 分钟。接下来，将样品管放入微量离心机中以 375 倍 G 离心 10 分钟。

然后，将含有内毒素的上清液转移到新的无热原的 2 毫升试管中。准备一个无热原的 96 孔平底微孔板，带盖子用于内毒素测试。首先布置示例位置。

接下来，打开酶标仪并对其进行编程，使其在 37 摄氏度下发生动力学反应，每 5 分钟摇动一次。随后在 405 纳米处进行测量。重复摇晃 5 分钟，读数板 18 次。

将 50 μL 之前用于加标过滤器的标准内毒素溶液放入 A1 至 A10 和 B1 至 B10 行，将样品加载到 acate 中。将空白放入 A11、A12、B11 和 B12 中。接下来，将旋转加标滤膜提取物中的上清液及其空白加入 C 行和 D 行，然后根据需要将实验样品和空白中的上清液添加到剩余的孔中。

要激活测试，请向每个孔中快速添加 50 μL 鲎试剂细胞糖化溶液。轻轻水平摇晃板。在将其提升到读板器并开始实验运行之前。

完成后，从读板器中取出板。使用标准曲线确定每个样品中的内毒素水平，并计算从样品过滤器中提取内毒素的效率。首先，按照随附文本方案中的说明制备 DNA 加标过滤器。

对于每个过滤样品，将酸洗玻璃珠制备到 0.5 毫升无菌管中，其中 0.1 克直径为 425 至 600 微米的微珠和 0.3 克直径小于或等于 106 微米的微珠。接下来，使用直径为 1.12 厘米的消毒软木钻孔器从每个过滤样品上随机选择的位置切下三个圆形块。将过滤样品放入单独的螺口 2 ml 试管中。

然后，将玻璃珠混合物与 DNA 提取试剂盒随附的 60 μL 细胞裂解缓冲液一起添加到每个试管中。关闭试管并将样品放入珠子打浆器中。使用微珠打浆器机械破碎过滤后的细胞 1 分钟，然后将样品放在冰上再冷却一分钟。

重复此循环五次。继续遵循试剂盒供应商的方案并从裂解的细胞中提取 DNA。洗脱后，通过提取柱再次重新加载洗脱的样品，以提高 DNA 产量。

提前打开定量 PCR 仪器，让它有时间预热。在新的程序文件中，插入仪器作软件中定量 PCR 运行的详细信息。接下来，使用表面 DNA 去污剂对工作表面进行消毒，并且仅使用无菌试管、吸头和试剂。

此外，在工作台旁边放一桶冰，然后将 tac polemoraris 混合物放入桶中。如随附文本方案的表 4 所述制备定量 PCR 反应混合物。并将反应混合物避光储存在冰上直至使用。

接下来，将干净的微孔板放入微孔板支架中，以防止其接触工作表面并保持其清洁。在定量 PCR 微孔板的孔内加入 1 微升标准 DNA、样品 DNA 或无核酸酶的水，一式三份。然后，向每个反应孔中加入 9 μL 主反应混合物。

完成后，用光学胶膜盖住板，并在所有侧面密封。在装有板桶的离心机中以 1000 倍 G 的速度将板旋转 1 分钟，然后将其放入热循环仪中。最后，激活并运行制备好的定量 PCR 程序。

在内毒素提取过程中，过滤器样品在离心机上旋转，以从过滤器中提取内毒素。不同的离心速度导致不同的萃取效率。尤其是在较高的内毒素浓度下。

应针对所选的特定过滤器和执行的方案进行提取效率的初步测试。与采样石英过滤器相比，加标清洁过滤器可获得更高的提取效率，并且这两种效率都低于通过直接检测标准溶液获得的效率。一旦掌握，如果作得当，内毒素分析可以在三个半小时内完成。

按照此程序，可以执行其他方法，如 DNA 测序，以回答有关生物体在大气中运输的其他问题。观看本视频后，您应该对如何从空气样品过滤器中高效提取内毒素和 DNA 并进行准确分析有很好的了解。