Name: 益生菌酵母的转型及其胃肠道粘膜免疫组织恢复继小鼠口服灌胃 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: 了解如何通过紫外线诱变构建营养缺陷型益生菌酵母突变株，并利用电穿孔技术实现异源蛋白表达。该方法无需抗生素筛选，通过小鼠口服灌胃验证酵母对派尔集合淋巴结的粘附能力，为口服疫苗及胃肠道治疗递送研究提供重要技术支持。

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作者感谢儿童免疫学与疫苗中心以及美国国立卫生研究院新创新者奖（1DP2AI112242-01）对Tracey J. Lamb的资助。作者还感谢Natalya P. Degtyareva慷慨提供rad1 S. cerevisiae。

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作者无任何利益冲突需要披露。

综上所述，本文所述的实验方案详细描述了开发和测试营养缺陷型益生酵母菌株以向肠道递送异源治疗性蛋白所必需的关键步骤。对重组益生酵母进行此类操作与测试需要特定的技术和资源，而并非所有实验室目前都熟悉这些技术与资源。尽管已有大量先前研究报道了上述针对多种酵母和小鼠品系的实验方法，但据作者所知，这些方法尚未以详细且统一的形式系统呈现。此外，本论文特别强调对现有标准化实验流程进行优化，以适用于益生酵母的遗传操作——这类酵母菌株的特征表征程度通常低于常用的实验室酵母菌株。无论是用于诱变（第一部分）还是转化（第二部分）的多个实验步骤，均需针对这些二倍体益生酵母分离株的特性进行优化。本文还讨论了动物操作（第三部分）以及小肠派伊尔集合淋巴结免疫组织解剖（第四部分）过程中可能遇到的潜在问题。
由于许多工业和临床相关的酵母菌株无法立即适用于大规模遗传操作，因此首先需要构建营养缺陷型突变株等菌株，使其能够在无需昂贵抗生素的情况下进行培养和筛选。紫外线（UV）诱变是一种可快速非特异性突变营养缺陷基因的方法7,41。可轻松绘制生存曲线（图1和<stron...

益生菌微生物是一种颇具前景的、可高效且经济地将异源蛋白递送至胃肠道的潜在手段。这类微生物能够耐受胃肠道的通过环境，但不会在其内定植1，从而实现可控剂量给药，并限制机体对所表达药物的暴露。此外，这些微生物易于进行遗传改造，可大规模生产异源蛋白，使其成为合成递送颗粒的一种经济替代方案。然而，此类方法的开发——正如近期利用益生酵母Saccharomyces boulardii的营养缺陷型菌株所展示的那样2——需要掌握通常不在同一研究中结合使用的多种实验技术，涵盖从酵母与分子生物学到动物操作技术及免疫学方法等多个领域。因此，尽管本文所述各项具体操作本身并非新颖的实验方案，但本论文的目标是系统性地介绍以小鼠胃肠道为靶点、评估益生酵母作为药物递送载体时所需的关键实验技术。本文提供了一套核心实验流程，包括：1）构建易于遗传操作的酵母营养缺陷型突变菌株；2）转化酵母以表达异源蛋白；3）通过口服灌胃将重组酵母递送至小鼠肠道；以及4）从小鼠肠道中回收具有活性的重组益生酵母，并检测其异源蛋白的表达水平。
首先，尽管目前存在多种用于酵母菌种操作的正向和负向筛选方法，但使用营养缺陷型标记等负向筛选方法能够显著提高酵母转化和筛选的效率与便捷性。相比之下，利用抗生素进行转化子的正向筛选会大幅增加酵母操作的成本。此外，在含抗生素的固体培养基上筛选酵母时，相较于在缺乏必需营养成分的合成限定固体培养基上筛选营养缺陷型酵母，未转化的背景菌落生长可能更为明显（未发表观察结果）。营养缺陷型酵母是指缺乏合成必需氨基酸或尿嘧啶关键酶的菌株。这类酵母只有在补充了缺失的代谢物或代谢基因时才能生长，因此当将其接种于缺乏该必需代谢物的合成限定培养基上时，便可实现负向筛选。事实上，许多常用的Saccharomyces cerevisiae实验室菌株本身就是营养缺陷型突变株3。然而，工业、临床及益生菌用途的酵母菌株通常为原养型，能够自行合成所有必需营养物质。为了更高效地对这类酵母进行遗传操作，可选择性地靶向营养缺陷型基因，从而构建出无需使用抗生素即可筛选的菌株。对营养缺陷型标记基因的特异性靶向可通过基于同源重组的PCR介导基因敲除实现，或近年来更为常用的CRISPR/Cas9靶向技术4-6。另一种方法是采用紫外线（UV）诱变，该方法可快速产生营养缺陷型突变株，即使对于难以通过多个质粒进行转化的酵母菌株也同样适用7。尽管PCR靶向和CRISPR/Cas9技术已在其他文献中被广泛描述，本文第一部分提供了一项详细的实验方案，介绍利用UV诱变法构建营养缺陷型菌株的技术流程，从而实现对酵母转化子的负向筛选，而非依赖抗生素的正向筛选。
将此类营养缺陷型菌株用于口服递送异源蛋白的下一个必要步骤，是通过质粒DNA对酵母进行转化。自1978年首次成功报道对Saccharomyces cerevisiae酵母原生质体进行转化以来8，已有大量改进方法被建立，以提高酵母物种遗传修饰的效率和操作便利性。1985年首次描述了利用电穿孔法成功将DNA导入S. cerevisiae9，此后通过添加1 M山梨醇进行孵育以提供渗透保护，进一步优化了该方法10。此外，电穿孔效率已被证明依赖于酵母物种与菌株、细胞数量与生长阶段、电穿孔体积、电场强度以及特定缓冲液11。醋酸锂（LiOAc）转化法最初由Ito et al.12描述，是目前最常用的转化方案之一，因其无需特殊设备。进一步研究表明，当细胞在对数中期收集，并在聚乙二醇（PEG）和DNA存在条件下于42 °C进行热激时，LiOAc酵母转化效率显著提高12。用PEG孵育完整酵母细胞对于实现高效转化至关重要，可能通过促进DNA与细胞膜的结合以及其他对膜的作用来实现13。锂离子本身也可增加完整细胞的通透性14。尽管大多数实验室使用的S. cerevisiae菌株均可通过LiOAc法轻松转化3，但其他酵母物种可能更适合采用替代方案进行转化。Pichia pastoris即为一例，其通过电穿孔法转化的效率明显高于LiOAc法13。因此，在尝试对尚未表征的酵母菌株进行遗传修饰时，至关重要的是测试多种转化方法，并优化孵育时间与试剂浓度。本文因此描述了LiOAc转化法和电穿孔法两种技术，用于转化营养缺陷型突变体及野生型S. boulardii。感兴趣的读者可参考近期综述，以获取有关酵母转化技术发展历程、替代方案及潜在作用机制的详细讨论13,15。为便于后续检测，使用编码易于检测蛋白的质粒对酵母进行转化，对于确保异源蛋白的正确表达与功能也至关重要。可根据治疗研究的最终目的以及可用于免疫印迹、ELISA等检测技术的抗体，选择多种不同的目标蛋白。这些检测技术的实验方案已在其他文献中详尽描述16,17，可通过与标准曲线比较，测定转化酵母中异源蛋白的表达水平。为便于演示并展示酵母生物学中一种极为常用蛋白的成功表达，本文采用编码绿色荧光蛋白（GFP）的质粒进行转化，从而可在后续通过荧光显微镜进行检测。
在表达异源蛋白的益生菌制剂的制备过程中，同样重要的是对这些微生物在胃肠道组织内的正确施用与检测，如本文第三和第四部分所述。通过口服灌胃法施用重组酵母，可将精确控制数量的酵母直接递送至胃内，而C57BL/6小鼠天然不具备呕吐能力18。然而，不当的动物操作和灌胃操作可能导致食管损伤与穿孔、胃穿孔、气管给药以及吸入性肺炎19,20。操作技术不佳和经验不足还可能增加小鼠免疫反应和实验结果的变异性，这已被归因于口服灌胃过程中动物所承受的应激21,22。因此，熟练掌握正确的操作技术不仅可减轻动物不适，还可提高实验结果的精确性。本文描述并演示了用于递送可控剂量重组酵母的动物操作与口服灌胃技术。
最后，必须通过检测淋巴组织中是否存在酵母及异源蛋白，以确认重组酵母的成功递送。胃肠道免疫组织中最容易且可重复检测酵母存在的部位是派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches）。派伊尔集合淋巴结是位于小肠的次级淋巴器官，是诱导黏膜免疫应答的关键部位23。肠腔中的抗原通过上皮中的微褶（M）细胞以跨细胞方式转运，并释放至派伊尔集合淋巴结内，从而使包埋其中的抗原呈递细胞暴露于肠腔内容物。尽管杯状细胞也可介导颗粒物穿过肠上皮的摄取，但研究表明其仅能摄取直径小于0.02 µm的颗粒24。CD103+树突状细胞（DC）延伸出的跨上皮树突也可从肠腔摄取小颗粒25；然而，目前尚无报道表明CD103+ DC能够摄取大于细菌的颗粒。因此，平均直径为3–6 µm的完整益生酵母最可能由M细胞摄取并转运至派伊尔集合淋巴结。本文描述了一种用于采集和筛选具有活性的重组酵母的派伊尔集合淋巴结的实验方案，该方法也可简便地适用于益生细菌摄取情况的评估。
总之，评估重组益生酵母向肠道递送治疗性蛋白的能力，需要掌握涵盖分子生物学、动物操作和免疫学等多个领域的实验技术。本文介绍了以下实验方案：1）构建和筛选营养缺陷型酵母菌株的方法，该菌株可在无需抗生素的情况下实现有效的负向筛选；2）转化酵母并实现异源蛋白表达的替代性实验方案；3）规范的动物操作技术和经口灌胃法，用于将重组酵母递送至胃内；4）派伊尔集合淋巴结（Peyer's patch）的分离方法，以及对存活重组酵母和功能性异源蛋白的检测方案。综合这些方法，可实现一种能够向胃肠道递送异源治疗性蛋白的益生酵母菌株的构建与功能验证。

<table><tbody><tr><td>SmartSpec 3000 分光光度计</td><td>BioRad</td><td>170-2501</td><td>用于测定酵母培养物细胞浓度和 OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; 的分光光度计示例</td></tr><tr><td>New Brunswick 滚轴式培养瓶</td><td>Eppendorf</td><td>M1053-4004</td><td>用于酵母培养孵育的滚轴式培养瓶示例</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 2400</td><td>Stratagene</td><td>400075-03</td><td>Stratalinker 示例</td></tr><tr><td>Stuart 菌落计数器 SC6PLUS</td><td>11983044</td><td>Fisher Scientific</td><td>带放大功能的平板支架，当笔尖施加压力时可记录菌落数量</td></tr><tr><td>Scienceware 菌落计数器&amp;nbsp;</td><td>F378620002</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>手持式菌落计数笔</td></tr><tr><td>复制平板接种装置</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-1</td><td>复制平板接种架和接种垫示例&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>丝绒布方块</td><td>Fisherbrand</td><td>09-718-2</td><td></td></tr><tr><td>L 形无菌细胞涂布棒&amp;nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14665230</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精来源单链脱氧核糖核酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656-1ML</td><td>酵母 LiOAc 转化中用作载体 DNA 的示例</td></tr><tr><td>灌胃针头</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK&amp;nbsp;002</td><td>适用于 15–20 g 小鼠的推荐针头为 22 号（1.25 mm 球头）、1 英寸长、直型可重复使用灌胃针。对于体重超过 20&amp;nbsp;g 的小鼠，可使用 20 号或更大规格的直型或弯型灌胃针</td></tr><tr><td>1 ml 无菌滑动式一次性结核菌素注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>钝头镊子，例如 Electron Microscopy Sciences 7&quot;（178 mm）带锯齿尖端、宽握把镊子</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77937-28</td><td>解剖所需钝头镊子的示例&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>直型和弯型解剖剪刀</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72966-02 和 72966-03</td><td>解剖所需剪刀的示例</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠经口灌胃益生酵母的转化及其从胃肠道免疫组织中的回收

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

开发重组口服疗法可更直接地靶向黏膜免疫系统，增强对抗胃肠道疾病的能力。尤其将益生酵母改造用于此策略具有多项优势。这些菌株不仅能够合成多种复杂的异源蛋白，还能在通过肠道的过程中存活并保护这些蛋白。然而，该策略需要掌握多种通常不常联合使用的实验室技术。此外，尽管常用实验室菌株的酵母转化单个实验方案已有充分表征，但本文重点在于替代性方法，并强调针对特征尚不明确的益生酵母菌株优化转化条件的重要性。详述这些方法将有助于推动关于如何最佳测试益生酵母作为口服药物递送载体的讨论，并促进这一新型胃肠道治疗策略的发展。

在紫外线照射后生成存活曲线，需要接种稀释的酵母细胞，以确保形成可区分的单个菌落形成单位（CFU）。如上所述收集的每个500 µl样品中约含有5 × 106个细胞；然而，每块平板上若菌落数超过100个，则难以准确分辨。因此，将未稀释样品以及经紫外线照射后的细胞进行连续1:10梯度稀释后接种，可确保在每个紫外线剂量下均能准确计数CFU，如图1所示。将CFU计数值乘以稀释倍数后，再除以每个500 µl样品中最初被照射的细胞总数，即可计算出每个剂量下的存活百分比。图2展示了二倍体野生型S. boulardii细胞在0 µJ、5,000 µJ、10,000 µJ、15,000 µJ、20,000 µJ、22,500 µJ、25,000 µJ、35,000 µJ和50,000 µJ照射剂量下能够存活的百分比。这些数据形成了一条清晰的曲线，可用于确定对应50%存活率的照射剂量。
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本文介绍了一套统一的方法，可用于开发、转化、施用和检测益生酵母Saccharomyces boulardii的异源蛋白表达。

重组口服疗法的开发将有助于更直接地靶向黏膜免疫系统，并增强对抗……的能力

这些实验步骤的总体目标是开发一种益生酵母菌株，该菌株易于转化并能在小鼠胃肠道中表达和递送异源蛋白。这些技术的主要优势在于能够快速构建嗜氧型益生酵母菌株。随后可对这些突变酵母进行遗传操作，而无需依赖抗生素筛选。对小鼠进行口服灌胃并收获派伊尔集合淋巴结，还可验证突变酵母对胃肠道免疫组织的黏附性。这些方法将有助于解答口服疫苗领域的关键问题，并推动利用益生菌递送胃肠道治疗药物的相关实验。在制备 YPD 培养基并使酵母过夜培养至饱和后，用塑料比色皿将细胞以1比10的比例稀释于水中。然后，使用分光光度计测定过夜培养物的光密度。用20毫升无菌蒸馏水将细胞稀释至浓度为每毫升10的7次方个细胞。接着，将稀释后的细胞倒入无菌塑料培养皿中，移去皿盖后，将培养皿放入紫外交联仪中。接下来，对细胞溶液施加逐步递增的紫外线照射剂量，每次递增后取500 µL等分试样，以建立杀灭曲线，并确定用于筛选的最佳存活率百分比。使用无菌水对细胞进行10倍系列稀释。然后，将各稀释度的细胞在最大转速下离心1分钟，形成沉淀。吸去上清液，将细胞重悬于100 µL无菌水中，该无菌水适用于酵母细胞涂布。然后，用移液器将重悬细胞的全部体积转移至含有YPD固体培养基的平板上，并使用无菌涂布棒将细胞均匀涂布于每个平板表面。绘制存活曲线，并根据文本方案确定用于筛选的紫外线照射剂量。在将酵母暴露于选定用于筛选的紫外照射剂量后，离心收集全部照射细胞的沉淀，并用 100 微升无菌水重悬沉淀。根据正文方案，将细胞涂布于含有 5-FOA 的最低培养基上，以筛选出尿嘧啶营养缺陷型的突变克隆。通过无菌牙签尖端挑取 5-FOA 平板上的单个菌落部分，分别在 YPD、5-FOA 和缺乏尿嘧啶的培养基上进行划线传代培养，以验证 URA3 缺失表型。将培养皿包好，倒置后于30摄氏度培养2至4天。通过观察菌落在YPD和5-FOA培养基上的生长情况，但不在缺乏尿嘧啶的培养基上生长，来确认其嗜氧表型。在确认辐照酵母的URA3缺陷型状态后，接种单个突变菌落至10毫升YPD培养基中，于30摄氏度温箱内培养过夜，以制备醋酸锂转化所需的感受态细胞滤膜。次日，使用 50 毫升新鲜温热的 YPD 培养基将过夜培养物稀释至 OD600 为 0.16 至 0.2，然后将细胞置于设定为 200 RPM 的旋转摇床上孵育，直至培养物达到约每毫升一乘以十的七次方个细胞，通常需要约四小时。按照方案用水和醋酸锂洗涤细胞后，将 50 微升重悬的细胞加入含有质粒和载体 DNA 的转化混合物中。随后，加入 300 微升 PEG、TE 和醋酸锂溶液，并涡旋混匀。将样品置于30摄氏度的旋转平台摇床中，以200转/分钟振荡孵育30分钟。随后按照文中的实验方案继续进行转化操作。根据文中的实验方案制备酵母培养物后，使用血细胞计数板测定细胞浓度，并调整至每毫升10^9个细胞。以 2500 × g 离心力离心 3 分钟，使细胞沉淀。然后弃去上清液，加入适量无菌水重悬细胞，并轻轻吹打混匀。将合适规格的灌胃针安装到 1 毫升无菌注射器上，吸取酵母样品并排除所有气泡。用无菌水填充另一支注射器，用于灌胃对照小鼠。用非优势手抓起需灌胃的小鼠，以食指和拇指紧紧抓住颈部周围的皮肤，将尾巴夹于小指下方。确保固定牢固，防止小鼠头部移动。接下来，将灌胃针沿小鼠口腔顶部和咽喉后部轻轻插入食道，注意保持针头位于中线偏左位置。等待小鼠吞咽针头的膨大部分。如果感到阻力或小鼠出现喘息，应轻轻拔出针头，重新尝试寻找食道。待小鼠吞咽饲胃针的 bulb 部位后，轻柔推动注射器活塞，将酵母直接注入小鼠胃中。随后轻柔地将饲胃针从小鼠胃和食道中取出，并将小鼠放回笼中。检查小鼠呼吸和活动是否正常，以确认灌胃操作已正确完成。按照文本方案处死小鼠后，将其置于腹部完全暴露的位置，并用70%乙醇喷洒腹部区域。使用剪刀横向剪开毛发和皮肤。然后用手轻轻撑开切口，进一步暴露腹膜，即覆盖腹腔器官的薄层浆膜。轻柔提起腹膜，做一横向切口以暴露肠管。接着，使用钝头镊子小心地将小肠从肠系膜动脉、脂肪及其他组织中分离出来。从小鼠腹部左上象限的胃部开始，沿小肠向盲肠（大肠起始处的较大袋状肠组织）暴露小肠。接着，通过在小肠壁上寻找约一至两毫米、呈大致圆形的不透明组织斑块来分离派伊尔结。然后，使用弯头解剖剪剪除派伊尔结的顶部圆顶状结构，并留出边缘，以确保不收集周围任何组织。将分离的派伊尔集合淋巴结转移至完全 IMDM 培养基中。随后，将含有悬浮派伊尔集合淋巴结的溶液倒入一个 40 微米的细胞滤器中。用完全 IMDM 洗涤派伊尔集合淋巴结后，使用一支 1 毫升注射器的推杆轻轻研磨组织以分散细胞，并将细胞收集至一个 50 毫升离心管中。在1800 RPM下离心7分钟，沉淀过滤后的细胞。然后根据正文方案接种并分析细胞。该图显示了经辐照的S. Boulardii细胞系列稀释后的一次接种结果。连续稀释可确保在每个紫外剂量下对菌落形成单位（CFU）进行计数。从这些酵母平板的图像可以看出，突变菌落在YPD和5-FOA平板上一致生长，但在缺乏尿嘧啶的平板上不生长，表明其具有尿嘧啶营养缺陷型表型。该图展示了分别采用乙酸锂法和电穿孔法时，野生型 S. Boulardii 与 S. Cerevisiae 的转化效率比较。尽管乙酸锂转化法对酿酒酵母（S. cerevisiae）非常有效，但布拉氏酵母（S. boulardii）的转化效率通过电穿孔法可显著提高。在这些明场和荧光图像中，携带编码GFP的URA3质粒的酿酒酵母实现了异源蛋白的功能性表达。本图展示了动物解剖后从小肠派尔集合淋巴结中检测到的可存活CF的一个示例。每只小鼠回收的CF使用量通常少于10。现在您应该已充分了解如何利用紫外线诱变技术构建能产生氧耐受性突变株的益生酵母菌株。我们还介绍了如何检测这些酵母表达外源蛋白的能力及其在小鼠小肠派伊尔集合淋巴结上的黏附能力。通过这些步骤后，可采用其他方法（如ELISA和荧光显微镜）来评估表达的异源蛋白的正确折叠及其功能。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

益生菌酵母的转型及其胃肠道粘膜免疫组织恢复继小鼠口服灌胃

本视频演示了在结肠炎的白细胞介素-10缺陷小鼠中进行粪便微生物移植的操作过程。肠道内定植的粪便微生物会释放次级代谢产物，诱导抗炎性细胞因子的释放，从而减轻结肠炎症。...

评估粪菌移植在白细胞介素-10缺陷小鼠中的作用

本视频展示了将转化的酵母细胞经口给予小鼠模型的操作过程。通过灌胃技术将转化的酵母细胞经口送入小鼠胃部。随后，这些细胞迁移至小肠，由微皱褶细胞吞噬，并被转运至派尔集合淋巴结，从而进入肠道免疫系统。...

口服递送改造酵母细胞至小鼠肠道免疫系统

本文提供了小鼠口服抗生素给药、粪便样本采集、DNA 提取以及通过 qPCR...

口服抗生素处理后小鼠肠道微生物群的定量聚合酶链式反应分析

本研究详细阐述了向新生小鼠灌胃精确剂量益生菌的操作过程。实验方案经过优化，包括但不限于益生菌给药、给药方法以及肠道内细菌的定量分析。...

使用灌胃法在新生小鼠中进行益生菌研究

我们介绍一种用于生成双人源化BLT小鼠的新方法，该小鼠具有功能性的人类免疫系统以及稳定植入的人类类似肠道微生物组。本方案无需无菌小鼠或已知菌群动物设施即可实施。...

一种具有稳定人源化肠道微生物组和人类免疫系统的人源化BLT小鼠双模型

本实验方案的目的是在哺乳动物胃肠道中观察白色念珠菌（Candida...

使用荧光原位杂交技术在小鼠胃肠道中可视化 Candida albicans

炎症性肠病（IBD）的发病机制涉及遗传易感性、黏膜免疫和肠道微生态环境之间的相互作用。在本研究中，我们将粪菌移植应用于IL-10缺陷小鼠，并探讨其对结肠炎症和心脏功能的影响。...

白细胞介素10缺陷小鼠模型中粪菌移植的治疗效果评估

本文介绍了一种建立抗生素诱导的伪无菌右旋糖酐硫酸钠诱导结肠炎小鼠模型的实验方案，用于研究肠道微生物群在调控Bacillus...

探究缓解效应 Bacillus cereus 通过肠道微生物群调节治疗结肠炎

噬菌体（phages）是一类感染细菌的病毒，是肠道微生物组的重要组成部分。尽管这些共生微生物影响着细菌的适应性和种群动态，但其对肠道稳态及疾病的影响机制仍知之甚少。本实验方案采用小鼠模型研究分离的T4噬菌体，该方法可适用于其他噬菌体-细菌组合的研究。...

T4 噬菌体与小鼠肠道内E. coli的相互作用：研究宿主-噬菌体体内动态关系的典型模型

本方案描述了在维持无菌条件下，将无菌小鼠转移并饲养于实验用单笼隔离器（隔离笼）中的最佳操作规范。同时讨论了向无菌小鼠进行粪便移植的方法，以及从这些肠道“人源化”小鼠中收集可存活细菌以用于后续应用的技术。...

用于将人粪便移植到无菌小鼠的生物排外IsoPositive笼实验的准备与维护

了解如何通过紫外线诱变构建营养缺陷型益生菌酵母突变株，并利用电穿孔技术实现异源蛋白表达。该方法无需抗生素筛选，通过小鼠口服灌胃验证酵母对派尔集合淋巴结的粘附能力，为口服疫苗及胃肠道治疗递送研究提供重要技术支持。

小鼠经口灌胃益生酵母的转化及其从胃肠道免疫组织中的回收

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