在活斑马鱼胚胎成像的亚细胞结构
2016年4月2日
对体内细胞器和其他亚细胞结构的动态行为进行成像可以阐明它们在生理和疾病条件下的功能。在这里，我们提出了对两个细胞器（中心体和线粒体）进行基因标记的方法，并使用宽场和共聚焦显微镜对它们在活斑马鱼胚胎中的动态进行成像。
这种成像方法的总体目标是在体内研究脊椎动物中的亚细胞器。这种方法可以帮助回答神经元细胞生物学领域的关键问题，例如线粒体的动力学或体内环境中的中心体。该技术的主要优点是整个实验可以在完整的脊椎动物中进行，而无需任何外科手术。
这种方法不仅可以深入了解生理条件下的亚细胞动力学，还可以应用于论文模型的研究，例如阿尔茨海默病。在通过显微注射产生瞬时表达的胚胎或从稳定的转基因品系获得胚胎后，根据文本方案，在第一天结束时，筛选死蛋或未受精的卵子。使用塑料移液管，将活胚胎转移到含有 1x PTU 的 Danieau 溶液中以防止色素形成，并将胚胎维持在含有 1x PTU 的 Danieau 溶液中，直到筛选转基因表达。
在成像实验当天，使用荧光解剖显微镜筛选麻醉胚胎的转基因表达。然后将选定的胚胎转移到含有 1x PTU 和 1x 三卡因的 Danieau 缓冲液的单独培养皿中。麻醉胚胎后，轻轻地将少量移液到含有 1x PTU 和 1x 三卡因的低熔点琼脂糖中，转移尽可能少的液体以避免稀释琼脂糖。
将含有少量琼脂糖的胚胎转移到玻璃底培养皿中。然后，工作相对较快，根据要成像的结构，使用镊子将胚胎定位在所需的方向。胚胎必须正确定向，例如，平放在一侧以便对视网膜或 Rohon-Beard 神经元进行成像。
精确的方向将确保最佳成像质量并优化采集速度。让琼脂糖凝固至少 15 分钟后，加入含有 1x PTU 和 1x 三卡因的 Danieau 缓冲液以覆盖胚胎。要进行宽视场显微镜，请在 28.5 摄氏度的加热室中平衡一盘已安装的鱼后，在宽视场显微镜的载物台上，然后选择感兴趣的区域，然后打开显微镜软件。
在 Illumination 下，单击 Configuration settings 为目标波长定义正确的滤光片集。在 Camera settings （相机设置） 下，输入获取合适图像所需的曝光时间。然后，选择放大倍率从 40 倍到 100 倍不等的长工作距离水浸锥物镜，该物镜具有最高的数值孔径并经过色差校正。
单击 Live 以选择视野。在 R-B 神经元的情况下，对茎轴突处的线粒体运输进行成像，从细胞体或外周乔木中发出。然后，在 ImageJ 菜单中，单击矩形选择按钮并定义感兴趣区域或 ROI。
然后单击微管理器窗口中的 ROI。选择用于成像的 ROI 后，单击 Stop and Save 以记录 YFP 通道中的神经元形态。要对线粒体运输进行成像，请单击 Multi-D Acquisition。
然后，在名为 Multi-dimensional Acquisition 的窗口中，选择时间点的数量和时间点之间的间隔。在 Multi-dimensional Acquisition 窗口中，单击 Channels，然后添加并定义成像波长和曝光时间。单击 Save images 以自动将文件保存在目录路由中概述的特定文件夹中。
现在，单击右上角的 Acquire 开始延时成像。对于共聚焦显微镜，将安装的胚胎放入共聚焦台上 28.5 摄氏度的加热室后，打开显微镜软件并单击 Trans Lamp 或 Epi Lamp。然后，通过显微镜的目镜，分别使用透射光或荧光来识别感兴趣的区域。
在 Acquisition setting（采集设置）窗口中，验证选择用于成像的物镜是否与可用物镜下拉菜单中显示的物镜匹配。然后，在 Image Acquisition Control 窗口中，单击染料列表按钮并选择合适的荧光基团。或者，单击 Light Path and Dyes 按钮手动设置参数。
在 Acquisition Setting （采集设置） 窗口中，调整扫描图像的缩放系数和大小纵横比，以获得最佳解析正在成像的结构所需的像素大小。将像素大小设置为物镜理论分辨率的一半左右，从而遵循奈奎斯特采样标准。要确定采集图像的像素大小，请在 Image Acquisition Control 窗口中单击 I 按钮。
接下来，将扫描速度设置为尽可能快的速度。然后，在图像采集控制窗口中，单击卡尔曼线平均并设置为 2 或 3 倍以减少噪声。要选择顺序扫描模式以对具有重叠光谱的荧光团进行成像，请单击 Sequential 和 Line。
然后，调整相关激光线的功率输出。要在调整每个通道的检测器设置的同时连续扫描所选区域，请单击 XY 重复或聚焦 x2 或聚焦 x4。然后，调整每个通道的 HV、Gain 和 Offset，以获取具有最高灰度值动态范围的图像。
现在，按 Ctrl 加 H 键，通过查找表可视化采集的图像，该查找表可识别蓝色中的不饱和像素和红色中过饱和的像素，这两种情况都应该避免。重新评估相关激光线的功率输出和检测器设置。要定义要成像的体积的上限和下限，请在 Acquisition Setting 中单击上限处的 End Set 按钮，然后聚焦到下限并按 Start Set。
要检查物镜的 Z 分辨率，请在 Image Acquisition Control 中单击 I 符号。然后选择一个步长，该步长是给定物镜 Z 分辨率的一半。在 TimeScan 子窗口中，输入采集 Z 堆栈的频率以及采集图像的次数，以设置适合待成像的亚细胞结构动力学的时间序列。
单击 Depth 和 Time 按钮以确认将获取 Z 堆栈和时间序列。最后，单击 XY Zt 按钮开始获取延时图像。图像采集后，在软件界面上，单击 Series Done。
并以 OIB 格式保存图像以记录图像和相关元数据。该图使用宽视野和共聚焦显微镜显示了位于胚胎表面的细胞器和 R-B 神经元。在这里，宽视场显微镜上的延时成像用于跟踪 R-B 神经元外周心轴中单个线粒体的运动。
共聚焦成像明显较慢，并可能导致低估特定亚细胞事件的动力学。通过宽视场显微镜获取的视网膜细胞图像对比度较差，因为来自大量组织的荧光信号会掩盖焦平面中的细节。在这里，共聚焦显微镜的光学切片能力显著提高了对比度。
插图显示了内核层区域的细节，并标记了细胞膜和线粒体。在感觉神经元的特异性 Gau-4 驱动器的驱动下，注射 UAS-mito-CFP 和 UAS MAY-FP 的马赛克表达允许在几天内跟踪单个细胞，如受精后 2 天和 3 天的 RB 感觉神经元所示。除了线粒体外，其他亚细胞器（如中心体）也可以进行荧光标记。
在这个例子中，单个连续构建体上的两个 UAS 盒驱动视网膜细胞中中心体靶向 YFP 和膜靶向天蓝的表达。插图显示了 M 期的单元格。整个过程需要几天时间，从交配、取卵、注射，最后在受精后三到四天进行成像。
显微镜上的实际成像实验可能需要几分钟到一整天。按照此程序，可以标记和成像其他细胞器，如微管或过氧化物酶体，以了解它们的体内动力学。不要忘记 PTU 具有致癌性，在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套。
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概述
本文介绍了一种在活体斑马鱼胚胎中成像亚细胞器官，特别是中心体和线粒体的方法。该技术允许研究人员研究体内器官动态，提供生理和疾病状况的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- 理解器官动态对于洞察细胞功能至关重要。
- 在体内研究这些动态比传统方法具有优势。
- 斑马鱼胚胎作为脊椎动物研究的模型。
- 这种方法可应用于各种疾病模型，包括阿尔茨海默病。
研究目的
- 研究活体中线粒体和中心体的动态。
- 提供研究亚细胞结构的无创方法。
- 增强对生理条件下器官行为的理解。
使用的方法
- 中心体和线粒体的遗传标记。
- 广场和共聚焦显微镜用于成像。
- 微注射以产生暂时表达的胚胎。
- 使用Danieau's溶液与PTU以维持胚胎活力。
主要结果
- 成功在活体斑马鱼胚胎中成像器官动态。
- 提供了线粒体和中心体在体内行为的见解。
- 在研究疾病模型中的潜在应用。
- 展示了亚细胞成像的无创方法。
结论
- 该方法为研究器官动态提供了有价值的工具。
- 它为神经元细胞生物学和疾病机制研究开辟了途径。
- 该技术可适应各种实验环境。
常见问题
Executive Industry Relevance
Imaging subcellular organelles in living vertebrate embryos enables direct observation of dynamic cellular processes relevant to target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The zebrafish model provides an intact, optically accessible system for studying organelle behavior under physiological conditions, supporting predictive confidence in pathway modulation. This approach reduces reliance on invasive mammalian models and accelerates hypothesis testing in neuronal cell biology and disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing mitochondrial and centrosome dynamics in vivo.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct observation of organelle behavior in neuronal contexts.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking subcellular dynamics to cellular phenotypes in a vertebrate system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively imageable subcellular readouts for assay standardization.
- Operational Value: Enables reproducible preparation of labeled embryos for consistent imaging workflows.
- Scalability: Facilitates platform reuse across multiple organelle targets using shared genetic and imaging infrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage organelle imaging to preclinical validation in disease models such as Alzheimer’s.
- Mechanistic De-risking: Clarifies subcellular contributions to disease-related cellular dysfunction.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing dynamic organelle responses to genetic or pharmacological perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing subcellular resolution data that informs target validation and lead identification stages, particularly in neuroscience-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct visualization of organelle dynamics in living neurons.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized embryonic systems with fluorescently labeled organelles for compound screening applications.
- Analytics: Enables quantitative measurement of mitochondrial transport and centrosome positioning as functional readouts.
- Translational Research: Provides continuity to preclinical studies by modeling subcellular dynamics in vertebrate disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform adaptable to multiple organelles and cell types via the Gal4-UAS system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in subcellular function.
- Operational Value: Standardizes embryo preparation and imaging protocols for reproducible subcellular dynamics assessment.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through non-invasive vertebrate imaging.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by linking organelle behavior to phenotypic outcomes in disease contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection, and transgenic line generation.
- Dependent on fluorescence microscopy systems with appropriate objectives and environmental control chambers.
- Necessitates standardization of embryo staging, anesthesia, and mounting procedures across teams.
- Involves adaptation considerations for different subcellular targets and cell-type-specific promoters.
- Includes practical limitations such as phototoxicity and pigment interference mitigated by PTU use and low-light imaging practices.
