活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

该成像方法的总体目标是在脊椎动物活体中研究亚细胞器。该方法有助于回答神经细胞生物学领域中的关键问题，例如线粒体或中心体在活体环境中的动态行为。该技术的主要优势在于整个实验可在完整的脊椎动物体内进行，无需任何外科手术操作。

该方法不仅能够揭示生理条件下亚细胞水平的动态过程，还可应用于阿尔茨海默病等疾病模型的研究。根据文本方案，通过显微注射获得瞬时表达的胚胎，或获取稳定转基因品系的胚胎后，在第一天结束时，筛选出死亡或未受精的卵。使用塑料转移移液管，将存活的胚胎转移至含有1× PTU的Danienau溶液中，以防止色素形成，并将胚胎维持在含有1× PTU的Danienau溶液中，直至进行转基因表达的筛选。

在成像实验当天，使用荧光体视显微镜对麻醉后的胚胎进行筛选，检测转基因表达情况。随后将选定的胚胎转移至另一个培养皿中，培养皿内含有添加了1× PTU和1×三卡因的Danieu's缓冲液。待胚胎完全麻醉后，用移液器轻轻吸取少量胚胎至含有1× PTU和1×三卡因的低熔点琼脂糖中，转移时应尽量减少液体带入，以避免稀释琼脂糖。

将胚胎连同少量琼脂糖转移至玻璃底培养皿中。随后，需相对较快地使用镊子根据待成像结构的需要，将胚胎调整至合适的方位。例如，若要成像视网膜或 Rohon-Beard 神经元，则需将胚胎侧向平放，确保其方位正确。

精确的定位将确保最佳的成像质量，并优化采集速度。在让琼脂糖凝固至少15分钟后，加入含有1× PTU和1×三卡因的Danieu's缓冲液，以浸没胚胎。进行宽场显微镜观察时，先将固定好的样品皿置于显微镜载物台上的加热腔室中，在28.5摄氏度下平衡，然后选择感兴趣的区域，打开显微镜软件。

在照明设置下，单击配置设置以定义与目标波长匹配的正确滤光片组。在相机设置下，输入获取合适图像所需的曝光时间。然后，选择一个长工作距离的浸水锥形物镜，放大倍数范围为40倍至100倍，应选用数值孔径最高且经过色差校正的物镜。

单击“Live”以选择视野。对于R-B神经元，对从细胞体发出的主轴突或外周分支中的线粒体运输进行成像。随后，在ImageJ菜单中单击矩形选择按钮，并定义一个感兴趣区域（ROI）。

然后在 MicroManager 窗口中点击 ROI。选择成像区域后，点击“停止并保存”以记录 YFP 通道中的神经元形态。要成像线粒体运输，请点击多维采集。

然后，在名为“多维采集”的窗口中，选择时间点的数量以及时间点之间的间隔。在“多维采集”窗口中，点击“通道”，添加并定义成像所用的波长以及曝光时间。点击“保存图像”，以自动将文件保存至目录路径中指定的文件夹。

现在，单击右上角的“Acquire”以开始延时成像。对于共聚焦显微镜，在将封片的胚胎置于共聚焦显微镜载物台的加热腔室中（温度设为28.5摄氏度）后，打开显微镜软件，单击“Trans Lamp”或“Epi Lamp”。然后，通过显微镜的目镜，分别使用透射光或荧光光来识别目标区域。

在采集设置窗口中，确认用于成像的物镜与可用物镜下拉菜单中显示的物镜相匹配。然后，在图像采集控制窗口中，单击染料列表按钮并选择适当的荧光染料。或者，单击光路和染料按钮以手动设置参数。

在采集设置窗口中，调整扫描图像的缩放倍数和尺寸纵横比，以获得能够最佳分辨成像结构所需的像素大小。将像素大小设置为物镜理论分辨率的约一半，从而满足奈奎斯特采样标准。要确定所采集图像的像素大小，请在图像采集控制窗口中点击 I 按钮。

接下来，将扫描速度设置为尽可能最快。然后，在图像采集控制窗口中，点击卡尔曼线平均（Kalman line averaging），并将其设置为2或3的倍数，以减少噪声。为了选择用于成像光谱重叠的荧光染料的逐帧扫描模式，请依次点击“Sequential”和“Line”。

然后，调节相关激光谱线的输出功率。在调整每个通道的探测器设置时，持续扫描所选区域，可点击“XY 重复”或“聚焦×2”或“聚焦×4”。接着，调节每个通道的高压（HV）、增益（Gain）和偏移（Offset），以获得灰度值动态范围最大的图像。

现在，按 Control 加 H 键，通过查找表显示所获取的图像，该查找表将欠饱和像素标记为蓝色，过饱和像素标记为红色，应避免出现这两种情况。重新评估相关激光谱线的输出功率及探测器设置。在采集设置中，要定义待成像体积的上下边界，首先单击上限处的“End Set”按钮，然后将焦距调至下限并按下“Start Set”。

为了检查物镜的Z轴分辨率，在图像采集控制中，单击 I 符号。然后选择一个步长，该步长为当前物镜Z分辨率的一半。在TimeScan子窗口中，输入采集Z层扫描的频率以及图像采集的次数，以设置适合待成像亚细胞结构动态变化的时间序列。

单击“深度”和“时间”按钮，确认将采集Z层扫描和时间序列图像。最后，单击“XY Zt”按钮开始采集延时图像。图像采集完成后，在软件界面上单击“序列完成”。

并将图像以 OIB 格式保存，以记录图像及相关元数据。该图显示了利用宽场和共聚焦显微镜观察到的位于胚胎表面的细胞器和 R-B 神经元。此处，通过宽场显微镜进行延时成像，用于追踪 R-B 神经元外周分支中单个线粒体的运动。

共聚焦成像速度明显较慢，可能导致对特定亚细胞事件动态过程的低估。通过宽场显微镜获取的视网膜细胞图像对比度较差，因为来自较大组织体积的荧光信号会掩盖焦平面内的细节。在此，共聚焦显微镜的光学切片能力显著提高了图像对比度。

插图展示了内核层某一区域的细节，显示了细胞膜和线粒体的标记。在特定感觉神经元的Gau-4驱动子驱动下，通过注射UAS-mito-CFP和UAS MAY-FP所产生的嵌合表达，可以对单个细胞进行数天的追踪观察，如本图中受精后两天和三天的R-B感觉神经元所示。除了线粒体外，其他亚细胞器（如中心体）也可进行荧光标记。

在此示例中，单个连续结构上的两个UAS表达盒驱动了中心体靶向的YFP和膜靶向的青色荧光蛋白在视网膜细胞中的表达。插图显示了一个处于M期的细胞。整个实验过程需要数天时间，包括杂交、收卵、显微注射，最后在受精后三至四天进行成像。

在显微镜上进行实际成像实验可能需要数分钟至一整天的时间。按照本方案，可对微管或过氧化物酶体等其他细胞器进行标记和成像，以研究其在体内的动态行为。请注意，PTU具有致癌性，在执行本方案时务必采取预防措施，例如佩戴手套。