Name: 在活斑马鱼胚胎成像的亚细胞结构 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学习在活体斑马鱼胚胎中成像亚细胞结构的方法，利用宽场和共聚焦显微镜观察线粒体和中心体动态。该技术无需手术即可研究神经元细胞生物学和疾病模型。

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P.E. 受德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）研究培训组1373和慕尼黑工业大学研究生院（TUM-GS）资助。G.P. 受慕尼黑工业大学研究生院（TUM-GS）资助。L.T. 受欧洲分子生物学组织（EMBO）奖学金（EMBO ALTF 108-2013）资助。D.P. 在斑马鱼方面的研究受德国研究基金会（DFG）通过“神经退行性疾病的分子机制”特别研究领域（SFB 596）、整合蛋白质科学中心（慕尼黑）以及欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）资助，项目编号为200611（MEMOSAD）。他目前是纽约干细胞基金会-德鲁肯米勒研究员，此前曾获得德国利奥波第那科学院（Leopoldina）的奖学金支持。L.G. 受德国研究基金会（DFG）通过SFB 870“神经环路的组装与功能”项目A11的经费支持。
我们感谢Kristina Wullimann对斑马鱼养殖设施的维护，感谢Yvonne Hufnagel提供的技术支持，以及感谢Thomas Misgeld对本文手稿的评论。我们感谢R. Köster（布伦瑞克工业大学）提供了M1 Medusa载体（pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP），我们从中克隆出Centrin-YFP；同时感谢S.C. Suzuki和T. Yoshimatsu（华盛顿大学）提供了14xUAS:MA-cerulean表达盒，我们利用该元件构建了报告基因载体以生成CentrinFish。我们进一步感谢S.C. Suzuki和T. Yoshimatsu（华盛顿大学）提供了Otx2:Gal4转基因品系，感谢A. Sagasti（加州大学洛杉矶分校）提供了Sensory:Gal4-VP16构建体，以及感谢M. Nonet（圣路易斯华盛顿大学）提供了pCold Heart Tol2载体。我们谨此感谢Bettina Schmid、Alexander Hruscha和Christian Haass（德国神经退行性疾病中心慕尼黑分部—DZNE）为MitoFish的开发所做出的贡献。

作者无任何利益冲突需要披露。

在此，我们展示了Gal4-UAS表达系统在斑马鱼胚胎体内对特定细胞类型的线粒体、中心体以及细胞膜进行荧光标记的多功能性。in vivo 许多用于标记其他细胞器或亚细胞结构的荧光融合蛋白已在已发表的文献中报道，可从相应实验室、商业来源或非营利性质粒库（例如 Addgene）获得。设计新的荧光融合蛋白时，需考虑多个参数，包括选择何种荧光蛋白（FP），以及将FP融合至目标蛋白的氨基末端还是羧基末端。关于荧光融合蛋白构建的更深入讨论，读者可参考该主题的详细综述文章49-51。
我们强调了三种利用UAS驱动的转基因实现融合蛋白共表达的策略。使用多个独立的UAS报告基因构建体，可以在无需额外克隆的情况下组合不同的现有报告基因构建体，且报告基因的表达水平也可独立调节。然而，当在单个构建体中使用多个UAS表达盒或双向UAS表达盒时，可实现更高水平的共表达。由于荧光蛋白（FPs）被用作标签，因此验证共表达相对容易。需要注意的是，其他多顺反子表达方法也存在，包括使用内部核糖体进入位点（IRES）。40 和病毒2A肽<sup...

体内成像可在最接近生理状态的环境中直接观察细胞行为。斑马鱼胚胎具有透明性、发育迅速且为体外发育，加之拥有丰富的遗传工具可用于荧光标记，这些优势共同推动了体内显微镜技术在揭示关键发育过程动态机制中的广泛应用。例如，利用斑马鱼开展的神经系统发育成像研究极大地拓展了我们对神经前体细胞行为及其子代细胞命运的认识，包括这些细胞随后的迁移、分化以及神经环路整合过程1-8。
现在可以开始研究这些细胞行为背后的亚细胞动态机制。事实上，斑马鱼已被用作研究工具 体内 细胞生物学。现在可以对线粒体进行可视化观察9-11中心体2,8,12-14，高尔基体15微管4 和肌动蛋白16 细胞骨架，内体17 顶膜复合体的组分1,18，以及其他斑马鱼胚胎中的亚细胞结构 体内到目前为止，关于这些细胞器功能的大部分认识都来源于对培养细胞中其行为的研究。然而 体外 研究已为细胞生物学提供了巨大洞见，但培养条件下的细胞并不能完全代表生物体内细胞的复杂性 体内 因此不能必然反映细胞器亚结构的功能与动态变化 体内斑马鱼胚胎提供了一种可行的 体内 研究亚细胞动态的替代方法。
作为脊椎动物，斑马鱼拥有许多与哺乳动物物种同源的器官系统（例如，神经视网膜）。此外，斑马鱼胚胎正越来越多地被用于模拟人类疾病19,20，包括与中心体功能相关（例如，小头畸形21 和 Leber 先天性黑蒙22）以及线粒体功能相关（例如，帕金森病23、tau 蛋白病10,24 和 Barth 综合征25）的疾病。在体 对这些情况下的细胞和亚细胞水平进行成像，将有助于更深入地理解这些病理状态背后的细胞生物学机制。
本文所述方法的总体目标是提供一份全面指南，用于利用斑马鱼胚胎研究细胞器及其他亚细胞结构 体内 光学显微镜。可视化和追踪亚细胞结构所涉及的完整工作流程 体内 进行了描述——从基因标记方法，到构建瞬时表达和稳定型转基因鱼，最后利用宽场显微镜和共聚焦显微镜进行成像。尽管上述各项技术已被众多斑马鱼实验室广泛应用，但本文所述方案经过优化和简化，特别适用于研究亚细胞结构的动态变化。本文所描述工作的两个具体方面值得特别指出：第一，采用Gal4-UAS表达系统在多种构型中实现对特定细胞类型中细胞器的遗传标记；第二，对宽场显微镜与共聚焦显微镜在亚细胞结构成像中的应用进行直接比较 体内.
目前，在斑马鱼中对细胞器及其他亚细胞结构进行遗传标记的策略，主要利用带帽的mRNA1,4,8，或使用启动子元件直接驱动融合蛋白表达的DNA载体9,14,15。体外转录的带帽RNA可实现快速而广泛的表达，但缺乏组织特异性。此外，随着带帽RNA被稀释或降解，其表达水平随时间逐渐下降。因此，基于RNA的载体在发育后期阶段（通常不超过受精后3天）研究细胞器动态变化的应用受到限制。
通过使用DNA构建体，可以克服这些局限性，其中表达的空间和时间控制由特定的启动子元件决定。当基于DNA的构建体应用于Gal4-UAS系统时，可显著提高外源基因的表达水平26,27。在此双组分表达系统中，细胞类型特异性的启动子元件驱动转录激活因子Gal4的表达，而报告基因则被克隆在Gal4结合的上游激活序列（UAS）下游。通过将UAS报告基因与适当的Gal4驱动系相结合，可将表达限制在特定的细胞类型中，从而避免每次需要特定表达模式时都必须将报告基因克隆到不同启动子下游的繁琐步骤。此外，多个UAS报告基因的表达可由单个Gal4激活因子驱动。因此，Gal4-UAS系统为亚细胞标记提供了一种多功能且灵活的遗传学方法。
宽场显微镜和共聚焦显微镜是大多数实验室的核心设备。宽场系统通常采用弧光灯作为光源，并在光路末端配备高灵敏度相机来检测发射光。这种成像方式通常仅适用于较薄的样品，因为在较厚样品中，来自非焦平面的离焦光会干扰和掩盖焦平面内的清晰信息。共聚焦显微镜与宽场系统不同，其设计旨在优先获取来自焦平面的信号，而抑制非焦平面产生的信号即, &#34;光学切片&#34;)28为了实现光学切片，在发射光路中设置一个针孔，其位置与点光源共轭。采用激光作为光源，信号由光电倍增管（PMT）检测。实际操作中，激光束逐点扫描样品，每个点（像素）处的荧光发射信号由PMT检测。
在此，我们利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中的相同亚细胞结构进行成像，以直接比较这两种显微技术。提供此类比较的根本目的在于为针对特定科学问题选择最合适的显微技术提供指导依据。
利用本文所述方法，我们展示了基于Gal4-UAS系统的线粒体和中心体的遗传标记技术。通过宽场显微镜和共聚焦显微镜对神经系统中不同类型的细胞以及肌细胞中的这些细胞器进行成像，以展示每种成像方式的适用性。本文描述的方法可轻松适用于活体斑马鱼胚胎中其他细胞器和亚细胞结构的研究。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖（2-羟乙基琼脂糖）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018-10G</td><td>低凝胶温度VII型</td></tr><tr><td>加热块</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Thermomixer compact</td></tr><tr><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 硝酸钙水合物，99.996%&amp;nbsp;</td><td>Aldrich</td><td>202967-50g</td><td>制备30倍浓度的Danieau溶液</td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Qimaging</td><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td></td></tr><tr><td>陶瓷涂层杜蒙特#5镊子</td><td>杜蒙特 - 精密科学工具</td><td>11252-50</td><td>#5 镊子</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1000 Fluoview</td><td></td></tr><tr><td>培养皿加热器</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>DH-35</td><td>加热环</td></tr><tr><td>三氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐</td><td>PharmaQ</td><td>Tricaine PharmaQ-25g</td><td>三卡因（麻醉剂）</td></tr><tr><td>荧光解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>GeneClean试剂盒</td><td>MP Biomedicals</td><td>111001200</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td>35 mm 培养皿，14 mm 微孔，No. 0 盖玻片</td></tr><tr><td>玻璃针</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>用于显微注射</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250g</td><td>制备30倍浓度的Danieau溶液</td></tr><tr><td>高真空润滑脂</td><td>道康宁&amp;nbsp;</td><td>DCC000001242 150克</td><td>二氧化硅油脂</td></tr><tr><td>KCl 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7643-5kg</td><td>制备30倍浓度的Danieau溶液</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O &amp;nbsp;&amp;nbsp;七水合硫酸镁 98+% A.C.S 试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230291-500g</td><td>制备30倍浓度的Danieau溶液</td></tr><tr><td>显微注射仪&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FemtoJet</td></tr><tr><td>显微注射尖端</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>0.5-20 μl</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Maerzhaeuser Wetzlar</td><td>MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R</td><td></td></tr><tr><td>微移液管夹持器</td><td>细胞内</td><td>P/N 50-00XX-130-1</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 体外转录试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>转录 PCS-转座酶</td></tr><tr><td>NaCl BioXtra &gt;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1kg</td><td>制备30倍浓度的Danieau溶液</td></tr><tr><td>Nano分光光度计</td><td></td><td></td><td>测量 DNA/RNA 浓度</td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>弗莱明/布朗</td></tr><tr><td>NIR Apo 40x/0.80W&amp;nbsp;</td><td>尼康</td><td></td><td>水浸锥形物镜</td></tr><tr><td>N-苯基硫脲 Ⅰ级，约98%</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>PTU（抑制色素形成）</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sarstedt AG&amp;nbsp;</td><td>821472</td><td>92 x 16mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>塑料模具&amp;nbsp;</td><td>自适应科学工具</td><td>TU-1</td><td>用于显微注射</td></tr><tr><td>有机玻璃盖板（带孔）</td><td>定制</td><td></td><td>Plexiglas 盖板上的孔应比水浸锥形物镜的直径大 3 mm</td></tr><tr><td>茶漏（塑料）</td><td></td><td></td><td>收集斑马鱼卵</td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td>双自动温度控制器</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Sarstedt AG&amp;nbsp;</td><td>86.1171</td><td>3.5 mL 塑料移液管</td></tr><tr><td>UMPlanFI 100x/1.00W</td><td>Olympus</td><td></td><td>水浸锥形物镜</td></tr><tr><td>UMPlanFLN 20x/0.50W&amp;nbsp;</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td>水浸锥形物镜</td></tr><tr><td>宽场显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>PTU（50倍浓缩液）</td><td></td><td></td><td>将76 mg PTU溶解于50 ml蒸馏水中&lt;br/&gt; 室温下剧烈搅拌&amp;nbsp;&lt;br/&gt; -20℃保存 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C，每份1 ml分装&lt;br/&gt; 以1倍工作液浓度使用</td></tr><tr><td>Tricaine（20倍浓缩液）</td><td></td><td></td><td>将200 mg Tricaine溶于48 ml蒸馏水中&lt;br/&gt; 加入 2 ml 1 M Tris 碱（pH 9）&lt;br/&gt; 调节至 pH 7&amp;nbsp;&lt;br/&gt; -20℃保存 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C，每份1 ml分装&lt;br/&gt; 以1倍工作液浓度使用</td></tr><tr><td>Danieau's 溶液（30倍浓缩液）</td><td></td><td></td><td>1,740 mM&amp;nbsp; NaCl&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 21 mM&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; KCl&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 12 mM&amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 18 mM&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Ca(NO₃)₂&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 150 mM&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; HEPES缓冲液&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 蒸馏水加至 1 L&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 4°C 保存 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C&amp;nbsp;&lt;br/&gt; 使用0.3倍工作浓度的溶液</td></tr></tbody></table>

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

体内 成像技术为研究细胞及亚细胞结构在其天然环境中的动态行为提供了前所未有的机会。在哺乳动物等高等脊椎动物中开展此类成像实验通常需要通过外科手术进入目标系统。而斑马鱼胚胎和幼鱼具有良好的光学通透性，可避免此类侵入性操作，实现对完整生物体的成像。事实上，斑马鱼现已成为利用活体成像技术可视化动态细胞行为的成熟模型 体内 显微镜技术在从增殖到迁移和分化的多种发育过程中得到广泛应用。近年来，斑马鱼越来越多地被用于研究亚细胞事件，包括线粒体运输和中心体动态。利用荧光蛋白对这些亚细胞结构进行遗传标记的相对简便性，以及采用光学显微技术对其进行成像，正在将斑马鱼转变为一个 体内 细胞生物学模型。本文描述了构建荧光标记细胞器的遗传载体的方法，以线粒体和中心体作为具体示例。我们采用双组分Gal4-UAS系统，在多种配置中限制基因在特定细胞类型中的表达，并提供了构建瞬时表达和稳定转基因鱼的实验方案。最后，我们给出了选择最适合观察亚细胞动态的光学显微镜方法的指导原则。

此处直接比较并对比了宽场显微镜与共聚焦显微镜在活体斑马鱼胚胎中对线粒体和中心体成像的应用。根据待观察细胞器动态变化的细胞所在位置以及特定亚细胞事件的固有频率，通常选择宽场显微镜或共聚焦显微镜更为合适。我们对位于胚胎表面的RB神经元以及位置更深的视网膜细胞中的细胞器进行了成像。由于RB神经元位置表浅且具有二维几何结构，因此适合采用宽场显微镜和共聚焦显微镜进行成像图 2）。然而，使用共聚焦显微镜获取图像的速度显著较慢，可能导致对特定亚细胞事件动态变化的低估（例如， 线粒体的运动， 图2C,D）。通过宽场显微镜获取的视网膜细胞图像由于来自大体积组织的荧光信号干扰，导致焦平面内的细节对比度较差。而共聚焦显微镜的光学切片能力显著提高了图像对比度（图3).
为了实现细胞器与细胞膜...

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。

活体成像技术以前所未有的方式揭示了细胞及亚细胞结构在其天然环境中的动态行为。进行此类……

该成像方法的总体目标是在脊椎动物活体中研究亚细胞器。该方法有助于回答神经细胞生物学领域中的关键问题，例如在活体环境下线粒体或中心体的动态行为。该技术的主要优势在于整个实验可在完整的脊椎动物体内进行，无需任何外科手术操作。该方法不仅能够揭示生理条件下细胞内动态过程，还可应用于阿尔茨海默病等疾病模型的研究。根据文本方案，通过显微注射获得瞬时表达的胚胎，或获取稳定转基因品系的胚胎后，在第一天结束时，筛选出死亡或未受精的卵。使用塑料移液管将存活的胚胎转移至含有1×PTU的Danieau溶液中，以防止色素形成，并将胚胎维持在含有1×PTU的Danieau溶液中，直至进行转基因表达的筛选。在成像实验当天，使用荧光体视显微镜对麻醉后的胚胎进行筛选，检测转基因表达情况。随后将选定的胚胎转移至另一个含有 Danieau 缓冲液、1x PTU 和 1x 三卡因的培养皿中。待胚胎完全麻醉后，用移液器轻轻吸取少量胚胎至含有 1x PTU 和 1x 三卡因的低熔点琼脂糖中，转移时应尽量减少液体带入，以避免稀释琼脂糖。将胚胎连同少量琼脂糖转移至玻璃底培养皿中。随后，需相对较快地使用镊子根据待成像结构的要求，将胚胎调整至所需的方向。例如，成像视网膜或罗恩-比德神经元时，需将胚胎侧面朝下平放，确保其方向正确。精确的定位将确保最佳成像质量并优化采集速度。在琼脂糖凝固至少15分钟后，加入含有1× PTU和1×三卡因的Danieu's缓冲液以浸没胚胎。进行宽场显微镜观察时，先将固定好的样品皿置于显微镜载物台上的加热腔室中，在28.5 °C条件下平衡，然后选择感兴趣的区域，打开显微镜软件。在照明设置下，单击配置设置以定义与目标波长匹配的正确滤光片组。在相机设置下，输入获取合适图像所需的曝光时间。然后，选择一个长工作距离的浸水锥形物镜，放大倍数范围为40倍至100倍，且具有最高的数值孔径并经过色差校正。单击“Live”以选择视野。对于R-B神经元，对从细胞体发出的主轴突或周围分支中的线粒体运输进行成像。随后，在ImageJ菜单中单击矩形选择按钮，并定义一个感兴趣区域（ROI）。然后在 MicroManager 窗口中点击 ROI。选择成像区域后，点击“停止并保存”，以记录 YFP 通道中的神经元形态。要成像线粒体运输，请点击多维采集（Multi-D Acquisition）。然后，在名为“多维采集”的窗口中，选择时间点的数量以及时间点之间的间隔。在“多维采集”窗口中，点击“通道”，添加并定义成像所用的波长以及曝光时间。点击“保存图像”，以自动将文件保存至目录路径中指定的文件夹。现在，单击右上角的“Acquire”以开始延时成像。对于共聚焦显微镜，在将封片的胚胎置于共聚焦显微镜载物台上的加热腔室中（温度设为28.5摄氏度）后，打开显微镜软件，单击“Trans Lamp”或“Epi Lamp”。然后，通

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发育生物学

在活斑马鱼胚胎成像的亚细胞结构

在本视频中，我们演示了一种利用共聚焦显微镜在单细胞分辨率下对活体斑马鱼胚胎中发育中的脊椎动物大脑进行分析的方法。该方法包括对单细胞斑马鱼胚胎进行显微注射，随后对发育中的大脑进行固定和成像的技术流程。...

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本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。...

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