Name: 计算机断层扫描和成骨血管生成耦合光学成像评估头盖骨自体移植和移植物的整合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: 了解多模态成像技术如何用于监测颅骨自体移植和移植物的整合过程。该方法通过高分辨率三维成像评估骨再生与血管新生的耦合关系，为再生医学研究提供重要技术支持。

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作者感谢美国国家牙科与颅面研究所（资助号：DE019902）和以色列科学基金会（资助号：382/13）提供的经费支持。

本方案遵循以色列耶路撒冷希伯来大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）（申请编号：MD-12-13524-4，该机构为AAALAC认证设施）以及Cedars-Sinai医学中心IACUC（申请编号：3770）的指导原则。动物实验严格遵守美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针。
1. 异体骨移植物的制备
<ol>
	<li>采用标准的 CO2 吸入法或腹腔注射 50 μl 戊巴比妥钠（65 mg/ml；100 mg/kg）处死 7 至 8 周龄的 Balb/C 小鼠，或任何与受体不同的品系。确认心跳停止后，实施颈椎脱位。或者，也可从保存于 –20 °C 并在取材前解冻的尸体中获取同种异体移植物。</li>
	<li>使用毛发剪刀逆毛发生长方向剃除颅骨区域的毛发。用 70% 异丙醇对尸体头部进行消毒。使用 11 号手术刀切开头皮皮肤，并去除骨膜。</li>
	<li>使用牙科钻和内径为 4.5 mm 的环钻，切取一块圆形颅骨骨片。将骨片转移至含有无菌生理盐水的 100 mm 塑料培养皿中。此时可观察到骨片上附着的血液和软组织（图 1A）。以该方法从 22 只供体获取骨片。</li>
	<li>每次用弯头镊子夹持一块骨片，使用棉签彻底擦拭，清除所有脑组织、软组织和血液（图 1B）。用精细剪刀小心剪除仍附着在移植物上的骨碎片，使移植物呈现完整的圆形轮廓。</li>
	<li>将每块移植物先浸入含有 70% 乙醇的 15 ml 离心管中一次，再依次浸入两个装有磷酸盐缓冲液的 15 ml 离心管中各一次，以洗去残留乙醇。</li>
	<li>将同种异体移植物置于 –80 °C 冰箱中的冻存管内冷冻至少 1 周。此时应确保移植物呈透明状（图 1C）。</li>
</ol>
2. 颅骨缺损手术
<ol>
	<li>对于受体，使用在骨钙素启动子控制下表达荧光素酶的转基因小鼠6。</li>
	<li>使用玻璃珠加热器对手术器械尖端灭菌30秒。将器械转移至含有70%异丙醇的容器中以维持无菌状态。使用无菌手套。</li>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮和美托咪啶混合物（分别为75 mg/kg和1 mg/kg）对7至8周龄的雌性小鼠进行麻醉。轻捏动物肢体以确认其已深度麻醉。在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。</li>
	<li>使用毛发剪沿毛发生长的反方向剃除颅骨区域的毛发。涂抹脱毛膏以去除残留毛发，并在不超过2分钟后使用干纱布擦拭，随后用生理盐水浸湿的纱布擦拭。应注意避免脱毛膏进入眼睛。作为额外的眼部保护措施，可在脱毛前涂抹兽用眼膏。必须彻底清除所有脱毛膏残留，以避免因化学试剂过度暴露而可能引起的刺激。使用5%氯己定对头皮进行消毒（图1D）。</li>
	<li>皮下注射5 mg/kg卡洛芬，溶于200 µl生理盐水中。涂抹兽用眼膏以防止眼睛干燥，并始终将动物置于加热垫上。将动物置于手术显微镜下定位。</li>
	<li>使用精细剪刀和镊子在头皮皮肤上做一个1厘米长的椭圆形切口（图1E）。用弯头镊子夹住骨膜，并用精细剪刀将其剪除。</li>
	<li>使用牙科钻和外径5毫米的环钻，在人字缝前方2毫米处钻取颅骨缺损（图1F和G）。为避免穿透硬脑膜，钻入骨厚度的四分之三，然后使用刮匙分离骨片。</li>
	<li>如需植入自体移植物，取出骨片并在含有10 ml无菌生理盐水的10 mm塑料培养皿中清洗以去除碎屑。不要去除软组织。如需植入同种异体移植物，应提前解冻并恢复至室温，然后进行清洗。</li>
	<li>使用弯头镊子将骨移植物放置于缺损处，确保其不接触缺损边缘（图1H）。使用纤维蛋白凝胶（5 µl浓度为46 mg/ml的纤维蛋白原与5 µl浓度为25 U/ml的凝血酶混合）将移植物粘附于宿主骨上。</li>
	<li>使用4-0薇乔缝线缝合皮肤（图1I）。对手术切口涂抹聚维酮碘。应注意防止毛发污染缝线。标记小鼠耳朵，并注射0.25 mg/kg安替sedan以逆转美托咪啶的麻醉作用。</li>
	<li>如果动物在10分钟内仍未苏醒，确保其位于加热垫上。注射200 µl无菌生理盐水，必要时可追加注射0.1 mg/kg安替sedan。在动物完全恢复之前，不得将其放回与其他动物共处的环境中。</li>
	<li>术后将动物单独饲养一周，以防止其撕开缝线。术后数天内在培养皿中放置用水浸泡过的鼠粮并置于笼底。术后连续三天每天皮下注射200 µl用无菌生理盐水稀释的1 mg/ml卡洛芬溶液，以缓解术后疼痛。</li>
</ol>
<img alt="组织移植过程；应用AG水凝胶的手术图像；血管整合。" src="/files/ftp_upload/53459/53459fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 颅骨同种异体移植物制备与颅骨缺损手术。 从颅骨区域分离出骨片段（A）。清除软组织、骨髓和血液（B），移植物依次用70%乙醇冲洗，再用磷酸盐缓冲液洗涤两次（C，AG = 同种异体移植物）。对受体小鼠进行手术准备，剃除颅骨区域的毛发并消毒皮肤（D）。在头皮上做一椭圆形切口，并去除骨膜（E）。接着使用直径为5 mm的环钻钻出颅骨缺损（F）。用勺形刮匙将骨片段剥离，保留上矢状窦完整（G）。然后将同种异体移植物置入缺损处，并用纤维蛋白凝胶固定（H）。最后缝合皮肤（I）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53459/53459fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 血管树表征的微计算机断层扫描
<ol>
	<li>配制肝素化生理盐水。称取2,000 U肝素钠，置于50 ml塑料管中，加入20 ml生理盐水，充分震荡混匀。用20 ml鲁尔锁式注射器抽取15 ml预温的肝素化生理盐水，并连接23 G头皮静脉输液套管。将注射器固定于注射泵上，设定泵速为1 ml/min，泵注10 ml。</li>
	<li>使用腹腔注射使小鼠镇静 50µl 苯巴比妥（65 mg/ml；100 mg/kg）。轻捏动物的肢体以确认其已深度镇静。将小鼠仰卧固定于覆盖有吸水衬垫的固定板上图2A将固定好的小鼠置于通风橱中，以防止人员接触有害气体。</li>
	<li>使用精细剪刀和镊子从腹部向颈部剪开皮肤图2B）。沿腹壁切至剑突处（图 2C）。沿肋骨的侧面剪开肋骨笼，避免损伤肺和心脏，并确保心脏完全暴露。使用止血钳牵开胸骨（图 2D).</li>
	<li>将蝶形针插入左心室3 mm（图2E）。使用3秒胶将针固定于心脏和胸壁图2F).</li>
	<li>立即启动泵。一分钟后，解剖下腔静脉以减轻血管压力（图2G将板子倾斜，使液体远离头部流动。成功的灌注将导致肝脏和血管变得透明。</li>
	<li>肝素化生理盐水灌注完成后，灌注10 ml 4%甲醛。避免气泡进入血管系统，避免接触甲醛蒸气。成功的甲醛灌注将导致尾部变硬。用10 ml肝素化生理盐水冲洗甲醛。</li>
	<li>根据制造商说明制备造影剂。通常需要混合化合物、稀释剂和固化剂。使用血清移液管在15 ml塑料管中混合溶液。</li>
	<li>以1 ml/min的速度用对比剂混合物灌注动物。观察冠状动脉, 肠和肝的血管，并确保灌注2-3 ml后变为黄色，表明灌注成功（图2H）。灌注完成后，剪断蝴蝶针的管路，单独取下尸体，并用卫生纸包裹，以防止溶液渗漏至颅骨区域。静置以待聚合。 4 °C 过夜</li>
	<li>解剖颅骨穹窿区域（图 2I）；首先使用手术刀尽可能向侧方切开皮肤，避免损伤目标颅骨区域。找到骨移植部位后，使用精细剪刀在距离移植部位10 mm处剪除颅骨。</li>
	<li>使用微型CT扫描仪扫描分离的颅骨骨样本 μCT 扫描仪；将视野设为 20.5 mm，X 射线能量设为 55 kVp，强度设为 145 μA，使用每1,000次投影 360° 积分时间为 200 毫秒。调节 μCT 参数7 用于成像其他骨缺损模型。</li>
	<li>观察由系统生成的二维重建切片 μCT 软件。确保正确扫描目标区域，然后定位颅骨缺损部位。评估灌注质量。在成功识别血管后（图 2J），继续使用6%三氯乙酸（TCA）溶于双蒸水（DDW）的溶液对样品进行脱钙处理。</li>
	<li>使用第3.10节中指定的参数重新扫描样本。在重建的二维切片中定位人字缝。定义一个高2 mm、直径8 mm的圆柱形感兴趣体积（VOI），使其与人字缝相切——此即为缺损的解剖位置。</li>
	<li>使用全局阈值法将骨组织与软组织分割；将下限阈值设为130，并应用约束性三维高斯滤波器（σ = 2.0，支持域 = 2）以部分抑制图像体积中的噪声。生成三维重建图像，并确保感兴趣体积（VOI）定位准确图 2K).</li>
	<li>使用 IPL 软件和“dt_object_param”函数生成厚度图（图 2L). 
	注意：该函数描述了每条血管直径对应的血管容积。</li>
</ol>
<img alt="小鼠解剖步骤、肾上腺位置、组织学分析、解剖学研究示意图。" src="/files/ftp_upload/53459/53459fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 通过心脏途径使用放射性造影剂进行灌注。 将小鼠固定在固定板上（A），沿腹部至颈部切开皮肤（B）。沿中线切开腹壁至剑突（C），并横向剪开肋骨（D）。将蝶形针插入左心室，避免插入颜色明显较深的右心室（E，白色虚线指示右心室），并将针固定于心脏和胸壁（F）。将肝素化生理盐水（2–3 ml）泵入心脏，同时解剖下腔静脉（G，白色箭头指示下腔静脉）。灌注并冲洗4%甲醛；随后灌注黄色染色的放射性造影剂。成功灌注的标志是血管内血液被清除，颜色变为黄色（H）。聚合完成后，分离颅骨区域（I，AG = 异体移植物），并使用µCT扫描仪成像以确认灌注效果（J，感兴趣区域以橙色标记）。样本经脱钙处理后重新扫描（K），随后生成彩色厚度图（L）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53459/53459fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 骨矿化和血液灌注的荧光成像
<ol>
	<li>将探针重悬至浓度为 2 nmol/100 µl PBS 加入 1.5 ml 离心管中（使用双膦酸盐偶联的荧光探针监测骨矿化，使用血液中的荧光试剂测量血液灌注）。轻轻吹打数次，确保探针充分均匀溶解。</li>
	<li>在指定成像时间前24小时采集零时点图像；使用诱导室通过吸入2 L/min的100%医用级氧气并补充3%异氟烷麻醉3只小鼠。确认小鼠进入适当麻醉状态后，将异氟烷浓度降至1.5%–2%。</li>
	<li>涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥，并确保热垫始终处于开启状态。轻捏动物肢体以确认其处于深度麻醉状态。在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。</li>
	<li>使用毛发剪刀逆着毛发生长方向剃除颅骨区域的毛发。使用脱毛膏去除残留的毛发碎片，任何残留毛发都会干扰光学成像。使用精细剪刀和镊子拆除缝线。</li>
	<li>将三只动物放置于预热至 37 °C 每次成像时，将曝光时间设为自动，视野设为 C，并调整滤光片。 例如， 对于最大激发波长为680 nm的双膦酸盐偶联荧光探针，使用675 nm的激发滤光片和Cy5.5的发射滤光片。类似地，当使用最大激发波长为750 nm的血液携带型荧光试剂时，应采用710 nm的激发滤光片和780 nm的发射滤光片。</li>
	<li>通过按下“Acquire”按钮，在Living Image软件中对小鼠进行成像。确保颅骨区域完全可见（图3B如需完整指南，请咨询 Lim 等 20098.</li>
	<li>让小鼠在吸入100%氧气的条件下苏醒。</li>
	<li>通过尾静脉注射2 nmol荧光探针。在指定的成像时段，按照上述方法进行成像。</li>
</ol>
5. 骨再生的显微计算机断层扫描
<ol>
	<li>为定量分析骨形成，通过吸入3%异氟烷对小鼠进行麻醉，操作如步骤4.2–4.3所示。将小鼠转移至μCT扫描仪载物台，并将其放入扫描仪中。</li>
	<li>将μCT扫描仪的X射线管电压设为55 kVp，电流设为145 µA，采用中等分辨率。使用20.5 mm的视野进行一次预扫描（单次X射线扫描），并定义感兴趣区域，范围从小鼠眼睛延伸至颅骨后部。进行CT扫描，扫描角度为360°，采集1,000次投影，积分时间为200毫秒。</li>
	<li>使用20 µm的标称空间分辨率重建二维切片。利用μCT软件9将缺损边缘对齐至标准化位置。</li>
	<li>与步骤3.20类似，定义一个圆柱形的感兴趣体积，并应用约束性三维高斯滤波器（σ = 0.8，支持域 = 1），以部分抑制体积内的噪声。采用全局阈值法将骨组织与软组织分割开来。</li>
	<li>测定感兴趣体积内矿化骨组织的体积。</li>
</ol>
6. 干细胞募集与分化的生物发光成像
<ol>
	<li>按照第 4.2-4.4 节所示准备小鼠进行成像，并通过吸入 100% 氧气使小鼠苏醒。</li>
	<li>通过腹腔注射向每只小鼠给予 126 mg/kg 的甲虫荧光素酶底物（beetle luciferin），然后将动物放回诱导室。2 分钟后，使用 3% 异氟烷对动物进行麻醉。将小鼠置于 IVIS 加热载物台上。</li>
	<li>通过 Living Image 软件将曝光时间设置为“自动”，视野设置为 C。在给予荧光素酶底物后 5 分钟对小鼠进行成像。按照步骤 4.6 所示方法，使用“生物发光”模式对动物进行成像。由于不同小鼠之间的转基因表达存在差异，需定义感兴趣区域。将颅骨信号相对于尾部信号进行归一化处理。</li>
</ol>

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<li>Moutsatsos, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenously+regulated+stem+cell-mediated+gene+therapy+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration.</a> Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).</li>
<li>Deckers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+stimulate+angiogenesis+through+osteoblast-derived+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor.</a> A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).</li>
<li>Cornejo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+adipose+tissue-derived+osteogenic+and+endothelial+cells+on+bone+allograft+osteogenesis+and+vascularization+in+critical-sized+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects.</a> Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处所述的多模态成像方法旨在实现对颅骨移植背景下血管生成-成骨作用轴的精细研究。采用一种微计算机断层扫描（µCT）方案对新生血管化进行成像，可精确地以高分辨率三维形式展示为整个颅骨缺损区域供血的血管网络。µCT 数据可方便地使用 IPL 等高级软件工具进行分析。例如，图中所示的厚度分析 图3C 结果显示，颅骨自体移植与异体移植的主要差异在于直径为0.1至0.08 mm的血管，这些血管特征性地属于微动脉10该结果与在长骨模型中进行的研究一致11需要注意的是，由于造影剂的黏稠度，直径为0.02 mm的最细小血管无法被完全灌注。该方法的主要缺点在于需要对动物实施安乐死，因此无法进行纵向成像。目前有多种可用于此目的的造影剂可供选择。 体内 血管µCT成像；然而，它们的放射不透性不如致密的聚合探针，且图像分辨率也未达到后者所提供的水平 离体 此处所示方法12µCT 的分辨率有限，因此不适合用于研究毛细血管等结构。除此之外，在熟练操作者的辅助下，该方法可提供一种可重复的技术，用于详细研究骨组织中的血管系统。...

由于创伤、肿瘤切除、减压性开颅术和先天性缺陷导致的颅面部骨缺损极少能自行愈合，存在明确而尚未满足的临床需求。自体骨移植和同种异体骨移植被广泛用于治疗这些情况1。
人们普遍认为，成骨过程与血管生成密切相关2,3。因此，对骨再生治疗策略的完整研究应包括对整个缺损区域新生血管网络的全面分析。目前已有多种方法可用于研究模型中的血管化情况。血管网络可通过组织学分析进行观察，但由于组织学依赖于组织切片，所得图像很可能发生形变。为解决这一问题，可采用活体显微成像技术对完整的血管结构进行成像4；然而，该方法仅限于单平面成像。通过对经对比剂灌注动物获取的样本进行µCT扫描，可实现对滋养再生区域的血管网络进行三维成像5。该方法能够高度精细地展示器官整体的血管系统，并对血管分布进行细致分析。此外，µCT还能区分不同直径的血管，从而识别不同类型血管的特征。
我们假设，与植入同种异体移植物相比，植入颅骨自体移植物将诱导更强的新生血管形成，而这种增强的血管生成继而导致骨形成增加。为验证这一假设，我们采用了多种技术：通过基于µCT的分析研究新生血管网络的形成模式；利用血池荧光探针测量血液灌注；通过针对羟基磷灰石探针的荧光成像（FLI）及µCT分析评估骨组织矿化；最后，在转基因小鼠中监测干细胞的募集与分化，这些小鼠的骨钙素阳性细胞表达荧光素酶，可通过生物发光成像（BLI）进行检测。

<table><tbody><tr><td>C57BL/C&amp;nbsp; 小鼠</td><td>Harlan 实验室</td><td>57</td><td></td></tr><tr><td>FVB/n 小鼠</td><td>Harlan 实验室</td><td>862</td><td></td></tr><tr><td>苯巴比妥</td><td>West waro</td><td>NDC 0641-0477-25</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物毛发剪</td><td>Wahl Animal</td><td>8786-451A</td><td></td></tr><tr><td>11号手术刀</td><td>Miltex</td><td>27111504</td><td></td></tr><tr><td>牙科微型马达</td><td>Marathon III</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mm 骨钻</td><td>精细科学工具</td><td>18004-50</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KetaVed（氯胺酮）</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06</td><td></td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Zoetis</td><td>NADA 141-267</td><td></td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>Norbrook</td><td>02000/4229</td><td></td></tr><tr><td>眼膏</td><td>Puralube</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>手术双目显微镜</td><td>Kent Scientific</td><td>KSCXTS-1121</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀&amp;nbsp;</td><td>精细科学工具</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>精细科学工具</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>匙形刮勺</td><td>精细科学工具</td><td>10090-13</td><td></td></tr><tr><td>Tisseel 纤维蛋白凝胶试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Baxter</td><td>718971</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>精细科学工具</td><td>12060-01</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0 缝合线</td><td>Ethicon</td><td>J392H</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td>Zoetis</td><td>NADA#141033</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 鲁尔锁注射器&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>23G 头皮静脉穿刺套件（蝶形针）</td><td>BD</td><td>367342</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>精细科学工具</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>3秒速干胶&amp;nbsp;</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物解剖板</td><td>Leica</td><td>38DI02313</td><td></td></tr><tr><td>Microfil MV-122</td><td>Flow-Tech</td><td>MV-122</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#956;CT40 扫描仪</td><td>Scanco</td><td>&amp;#956;CT40</td><td></td></tr><tr><td>6% 三氯乙酸（TCA）</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Osteosense 680</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>Angiosense 750</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10011</td><td></td></tr><tr><td>医用级 100% 氧气</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（氟烷）</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 动力学成像系统</td><td>Xenogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲虫荧光素</td><td>Promega</td><td>E160A</td><td></td></tr></tbody></table>

利用计算机断层扫描和光学成像技术研究颅骨自体移植与异体移植中成骨-血管生成偶联以评估骨整合

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

决定骨移植手术成功与否的一个关键参数是移植物周围区域的血管化。我们假设，自体骨移植的植入可通过促进大量新生血管形成，从而诱导更强的骨再生。为了研究移植物对缺损部位新生血管形成的影响，我们建立了一种微型计算机断层扫描（µCT）方法，用于表征新生血管，该方法包括通过系统灌注使动物体内灌注一种可聚合的对比剂。该技术能够对整个器官进行详细的血管结构分析。此外，通过荧光成像（FLI）检测血液中荧光示踪剂的分布来评估血流灌注情况。骨形成则通过使用靶向羟基磷灰石的荧光探针进行FLI检测以及µCT分析进行定量。干细胞募集情况通过生物发光成像（BLI）在转基因小鼠中进行监测，这些小鼠在骨钙素启动子调控下表达荧光素酶。本文中，我们描述并演示了同种异体移植物的制备、颅骨缺损手术操作、用于新生血管研究和骨形成分析的µCT扫描方案（包括 体内 造影剂灌注）以及数据分析方案。
三维高分辨率血管分析显示，植入自体移植物的动物血管生成显著增加，尤其在小动脉形成方面更为明显。因此，术后第7天，自体移植物组的血液灌注量显著高于对照组。th 术后第1天。我们观察到接受自体骨移植的动物骨矿化效果更佳，并检测到更高的骨形成水平。自体骨移植可诱导局部干细胞向移植物与宿主骨缝合处募集，这些细胞在第7天至第th 和 10th 术后第。这一发现表明，增强的骨形成可能归因于自体移植所特有的血管化供血增加。所述方法可作为研究骨再生的理想工具，尤其适用于紧密关联的骨形成与新生血管化过程的研究。

通过血管新生评估 µCT 体积分析法及使用荧光血液示踪剂进行荧光成像（FLI）以定量血流灌注。术后7天， µCT 扫描结果显示，接受自体移植的小鼠中小至中等直径血管的体积显著高于接受来自C57BL/6的同种异体移植小鼠图3A）。有趣的是，在自体移植组中，新形成的血管网络似乎延伸至整个缺损区域，而在同种异体移植组中，血管似乎仅从缺损区域的外缘向内渗透，且延伸范围有限。荧光灌注成像（FLI）支持了这一观察结果，显示自体移植处理动物的血流灌注显著更高（图3B）。到第14天th 在移植后当天，同种异体移植组的血管网络已延伸至移植物周围区域，但在我们检测的大多数血管直径范围内，其血管体积显著低于自体移植组（图3C）。注意：当比较直径为0.08至0.1 mm的血管时，血管体积的差异最为显著。术后28天，血管体积恢复至基线水平（图3D).
术后7天，使用羟基磷灰石靶向探针进行FLI检测，结果显示自体移植组的骨矿化程度显著更高（<strong...

自体和同种异体骨移植是治疗严重颅面骨缺损的公认方法。然而，移植物成分对血管新生、细胞分化与骨形成之间相互作用的影响尚不明确。本文介绍一种多模态成像方案，旨在阐明移植物邻近区域血管生成与成骨作用之间的相互依赖关系。

决定骨移植手术成功与否的一个主要参数是移植物周围区域的血管化。我们假设……

本实验的总体目标是通过多模态成像方法，监测颅骨移植物在骨再生和新生血管形成方面的整合情况。该方法有助于回答再生医学领域中的关键问题，例如成骨与血管生成之间的偶联关系。该技术的主要优势在于能够高分辨率地三维确定血管网络结构，并可对完整器官进行研究。演示本实验操作的是我实验室的博士研究生 Doron Vic，在对 7 至 8 周龄的 Bab sea 小鼠实施安乐死后进行。根据文字方案，使用毛发修剪器逆着毛发生长方向剃除颅骨区域的毛发。用70%异丙醇擦拭尸体头部以进行消毒。然后使用11号手术刀切开头皮，并使用牙科钻和内径为4.5毫米的齿状钻头去除骨膜。分离一块圆形的颅骨骨片。将骨片转移至含有无菌生理盐水的100毫米塑料培养皿中。此时，使用弯头镊子观察附着在骨片上的血液和软组织。每次取一个骨碎片，用棉签彻底擦拭，去除任何脑组织、软组织和血液。使用精细剪刀轻轻剪除仍附着在移植物上的骨碎片，使移植物呈现完美的圆形。将每个移植物先浸入含有70%乙醇的15毫升离心管中一次，再浸入含有PBS的15毫升离心管中两次，以洗去乙醇。将同种异体移植物放入冷冻管中，在-80摄氏度冰箱中冷冻至少一周。在使用表达荧光素酶的受体转基因小鼠时，需确保移植物在骨钙素启动子调控下呈透明状。使用注射用麻醉剂对一只7至8周龄的雌性小鼠进行麻醉，并确认其进入镇静状态后，将毛发剪刀逆着毛发生长方向使用，剃除颅骨区域的毛发。涂抹脱毛剂以去除残留的毛发，并在最多不超过两分钟内用干纱布擦去脱毛剂。然后使用浸有生理盐水的纱布擦拭该区域。通过皮下注射5%氯己定对头皮进行消毒。将每千克5毫克的卡洛芬溶于200 µL生理盐水中后注射。涂抹眼药膏以防止角膜干燥，并始终将动物置于加热垫上。然后将动物置于手术显微镜下。接着，使用精细剪刀和镊子，用镊子夹起头皮皮肤，剪出一个长约1厘米的椭圆形切口。握住骨膜，使用精细剪刀配合牙科钻和外径为5毫米的精修钻头，在人字缝前方2毫米处钻取颅骨缺损，以避免穿透硬脑膜。钻入骨厚度的四分之三深度，然后使用刮匙分离骨碎片。该实验方案中的一个关键步骤是准确确定缺损的位置。损伤矢状缝将导致大出血。因此，应小心避免破坏下方的硬度计和上矢状窦。以植入自体移植物。使用10毫升无菌生理盐水在10毫米塑料培养皿中冲洗骨碎片。去除血块但保留软组织，提前将同种异体移植物解冻，并将样本恢复至室温。然后用弯头镊子冲洗骨碎片。将骨移植物置于缺损处，确保其不接触缺损边缘。随后使用纤维蛋白凝胶将移植物黏附于宿主骨上。用4-0薇乔缝线缝合皮肤，并在手术切口处涂抹聚维酮碘。标记小鼠耳朵，并注射0.25毫克/千克的抗镇静剂。以逆转美托的麻醉作用。根据文本方案进行术后护理。通过称取2000单位的肝素钠并转移至50毫升离心管中来制备肝素化生理盐水。向管中加入20毫升无菌生理盐水并摇匀。用15毫升预温的肝素化生理盐水充分填充一支20毫升螺口注射器，并将该注射器连接至23号头皮静脉输液套管。将注射器连接至注射泵，并将泵设置为以每分钟1毫升的速度输注10毫升。根据文本方案对小鼠进行麻醉后，通过脚趾夹捏法确认其镇静状态，并将小鼠仰卧位固定于覆盖有吸水衬垫的固定板上。接下来，从腹部向颈部切开皮肤。沿腹壁切开至剑突处。然后沿肋骨的侧面切开肋骨笼，确保完全暴露心脏，同时保持心脏和肺部完好无损。使用止血钳牵开胸骨。将蝶形针插入左心室 3 毫米处。然后使用三秒胶将针固定于心脏和胸壁。将蝶形针插入左心室是一项精细的操作。应避免插入右心室或过深地插入左心室，以免穿透心脏后壁。接下来，立即启动泵。一分钟后，解剖下腔静脉以降低血管压力。将板子倾斜，使液体从头部方向流走。成功的灌注将导致肝脏和血管变得透明。现在灌注10毫升4%甲醛。避免气泡进入血管系统。当灌注完成，尾部出现僵硬时，使用 10 毫升肝素化生理盐水冲洗出甲醛。按照制造商说明书准备放射显影对比剂。将化合物稀释剂与固化剂在塑料管中混合，以每分钟1毫升的速率向动物灌注造影剂。灌注完成后，冠状动脉、肠系膜动脉和肝动脉应变为黄色。将导管剪至蝴蝶针长度，并用纸包裹尸体，以防止溶液泄漏至颅骨区域。将动物置于 4 摄氏度环境中过夜，以便次日进行聚合。为解剖颅骨区域，使用手术刀尽可能向侧方切开皮肤，避免损伤感兴趣的颅骨区域。定位骨移植部位后，使用精细剪刀在距离移植部位 10 毫米处剪除颅骨。使用微型CT扫描仪。将视野设置为20.5毫米，X射线能量为55 kVp，强度为145微安，每360度采集1000个投影，积分时间为200毫秒。对分离的颅盖骨样本进行扫描。观察由显微CT软件生成的二维重建切片。确保正确扫描感兴趣区域，然后定位颅骨缺损。如果灌注的血管易于识别，则使用6%三氯乙酸溶于双蒸水中的溶液。为了脱钙样本，使用刚刚描述的相同参数重新扫描样本。在重建的二维切片中定位人字缝。定义一个高两毫米、直径八毫米的圆柱形感兴趣体积（VOI），使其与人字缝相切。这是缺损的解剖部位。接下来将骨组织与软组织进行分割。将下限阈值设为130，并应用约束性3D高斯滤波器，以部分抑制容积中的噪声。生成三维重建图像。使用IPL软件和DT对象确保VOI准确定位。通过Peram功能生成厚度图。该功能描述了每根血管直径对应的血管体积，并通过成像和微型计算机断层扫描进行检测。根据此处所示的文字方案，术后七天，CT 扫描显示，接受自体移植的小鼠中，滋养整个移植物区域的小至中等直径血管体积显著更高，而接受同种异体移植的小鼠中，血管似乎仅从外部渗透。此外，荧光成像显示，接受自体移植处理的动物其血液灌注显著更高。术后第14天，异体移植物中的血管网络已延伸至整个移植物区域。然而，其血管体积显著低于自体移植物组。当比较直径为0.08至0.1毫米的血管时，这一差异最为明显；如图所示，术后28天，血管体积在术后7天恢复至基线水平。自体移植组通过使用靶向羟基磷灰石的探针进行荧光成像，显示出显著更高的骨矿化程度。在该组中，骨组织在整个移植物周围形成，而在同种异体移植组中，骨组织仅在术后56天时于缺损边缘形成，表现为环状结构。接受自体移植的动物其骨体积显著更高，移植物厚度也显著更大。一旦掌握该手术技术，整个操作可在约25分钟内完成。在本实验流程之后，可使用其他探针进行荧光成像，以回答更多科学问题，例如破骨细胞活性及免疫反应的参与情况。观看本视频后，您应充分了解如何对骨再生过程中的基础血管生成进行成像。

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