计算机断层扫描和成骨血管生成耦合光学成像评估头盖骨自体移植和移植物的整合

该程序的总体目标是使用多模式成像方法监测颅骨移植物在骨再生和新生血管形成方面的整合。这种方法可以帮助回答再生医学领域的关键问题，例如成骨血管生成耦合。这项技术的主要优点是它提供了维管三的高清 3D 测定，并且它允许研究演示该程序的完整器官将是我实验室的博士生 Doron Vic，在对 7 到 8 周大的 Bab 海鼠实施安乐死后。

根据文本协议，使用理发器逆着头发生长的方向剃掉颅骨区域。将 70% 异丙醇涂抹在胴体上，头部消毒。然后使用 11 号手术刀切开头皮皮肤，并使用牙钻和 4.5 毫米内径的尖齿去除骨膜。

分离颅骨的圆形碎片。将骨头碎片转移到装有无菌盐水的 100 毫米塑料皿中。此时，用弯曲的镊子观察血液和软组织附着在骨碎片上。

一次握住一块骨头碎片，并使用棉签涂抹器彻底擦拭。切除任何脑组织、软组织和血液。用细剪刀轻轻剪掉仍然附着在移植物上的任何骨片，使移植物具有完美的圆形。

将每个移植物浸入含有 70% 乙醇的 15 毫升试管中一次，浸入含有 PBS 的 15 毫升试管中两次，以洗去乙醇。冷冻后，将同种异体移植物在冷冻管中的零下 80 摄氏度冰箱中冷冻至少一周。确保在骨钙素启动子的控制下与表达荧光素酶的受体转基因小鼠一起工作时，同种异体移植物看起来是透明的。

使用注射麻醉剂麻醉 7 至 8 周龄的雌性小鼠并验证镇静后。逆着毛发生长的方向使用理发器剃掉颅骨区域。使用脱毛剂去除任何毛皮残留物，并在不超过两分钟后用干纱布擦掉。

然后用蘸有盐水的纱布擦拭该区域。通过皮下注射 5% 洗必泰对头皮进行消毒。每公斤卡洛芬注射 5 毫克，稀释在 200 微升生理盐水中。

涂抹眼膏以防止干燥，并始终将动物放在导热垫上。然后将动物放在作中的双筒望远镜下。接下来，使用细剪刀和镊子，用镊子在头皮皮肤上划出一厘米长的椭圆形切口。

握住骨膜，用细剪刀用牙钻将其剪掉，并在 lambdoid 缝合线前两毫米处用 5 毫米外径的 tr 细钻将颅骨缺损切开，以避免穿透硬脑膜。在骨头中钻出四分之三的路，然后用抹刀分离骨头碎片。该协议中的一个关键步骤是终止缺陷位置。

唇缝受伤会导致大量出血。因此，应注意不要破坏下面的硬度计和上矢状面。植入自体移植物。

在 10 毫米塑料板中使用 10 毫升无菌生理盐水清洗骨碎片。在不去除软组织的情况下去除血凝块，以植入同种异体移植物解冻，并将样品正常化至室温。然后用弯曲的镊子清洗骨头碎片。

将骨移植物放入缺损处，使其不会接触缺损边缘。然后使用纤维蛋白凝胶，将移植物粘在宿主骨骼上。用四根 oh Vijol 缝合线缝合皮肤，并在手术切口上涂抹聚维酮碘。

标记小鼠耳朵，每公斤注射 0.25 毫克反轿车。逆转 mebioto 的麻醉作用。根据文本方案进行术后护理。

称取 2000 单位肝素钠并转移到 50 毫升试管中，制备肝素化盐水。向试管中加入 20 毫升无菌生理盐水并摇匀。将 20 毫升加热的肝素盐水填充到 15 毫升诱饵锁注射器中，然后将注射器连接到 23 号头皮静脉组。

将注射器贴在注射泵上，并将泵设置为 10 毫升，每分钟 1 毫升。根据文本协议麻醉鼠标后，用脚趾捏住确认镇静并固定鼠标。它背靠用吸收性表面衬垫包裹的固定板。

接下来，从腹部到颈部切开皮肤。切开腹壁直至剑突。然后沿其侧面切开胸腔，确保心脏完全暴露并且心脏和肺没有受损。

使用止血钳回缩胸骨。将蝶针插入左心室 3 毫米。然后用 3 秒胶水将针头粘在心脏和胸壁上。将蝶针插入左心室是一个微妙的过程。

尽量避免插入右心室或太深地插入左心室，因为它会穿透心脏后壁。接下来，立即启动泵。一分钟后，解剖下静脉 cva 以减轻脉管系统压力。

倾斜板，使液体从头部流出。成功的灌注将导致肝脏和血管的清除。现在灌注了 10 毫升 4% 甲醛。

避免气泡渗透到脉管系统中。当灌注完全时（以尾部变硬为标志），使用 10 毫升肝素化盐水冲洗掉甲醛。根据制造商的说明准备不透射线造影剂。

通过在塑料管中混合化合物稀释剂和固化剂，以每分钟 1 毫升的速度用造影剂灌注动物。灌注完成后，冠状动脉、肠动脉和肝动脉应变为黄色。将管子剪到蝶针上，用纸包裹胴体，以防止溶液泄漏到颅骨区域。

将动物置于 4 摄氏度下过夜，以便第二天聚合。要解剖颅骨区域，请使用手术刀尽可能横向切割皮肤，以免损坏感兴趣的颅骨区域。找到骨移植物，然后用细剪刀在距离移植物 10 毫米的地方剪下颅骨。

使用显微 CT 扫描仪。将视场设置为 20.5 毫米，将 X 射线能量设置为 55 KVP，强度设置为 145 微安，每 360 度 1000 次投影，积分时间为 200 毫秒。扫描分离的颅骨样本。

观察由 micro CT 软件生成的 2D 重建切片。确保正确扫描感兴趣区域，然后找到颅骨缺损。如果灌注的血管很容易识别，请使用用双蒸水稀释的 6% 三氯乙酸。

要对样品进行脱钙，请使用与刚才描述的相同的参数重新扫描样品。在重建的 2D 切片中找到 lambdoid 缝合线。定义一个高 2 毫米、直径为 8 毫米、与缝合线相切的圆柱形感兴趣体积或 VOI。

这是缺损的解剖部位。接下来，将骨骼与软组织分割开来。将阈值下限设置为 130 并应用受约束的 3D 高斯过滤器，以部分抑制体积中的杂色。

生成 3D 重建。确保使用 IPL 软件和 DT 对象正确定位 VOI。Peram 函数生成厚度图。

此功能描述了每个血管直径的血管体积，用于成像和显微计算机断层扫描。根据文本方案，如此处所示，手术后 7 天，CT 扫描显示，与接受同种异体移植物的小鼠相比，接受签名的小鼠中小直径和中等直径血管的体积明显增加，这些血管滋养了整个移植物区域，血管似乎从外部穿透。此外，荧光成像显示 Autograph 处理动物的血液灌注显着升高。

到第 14 天，同种异体移植物中的维管树到达附近的所有移植物。然而，与 Autographt 组相比，血管体积明显较低。当比较直径为 0.08 至 0.1 毫米的血管时，这种差异最为明显，如图所示，手术后 28 天，脉管体积在手术后 7 天恢复到基线。

自体移植组表现出显着更大的骨矿化，如使用羟基磷灰石定向探针的荧光成像所见。该组在整个移植物附近形成骨骼，而在同种异体移植物组中仅在缺损边缘形成，如手术后 56 天以环状为标志，与同种异体移植物相比，接受签名的动物的骨体积明显更高，移植物厚度显着更大一旦掌握，这种手术技术可以在大约 25 分钟内完成。在此程序之后，可以使用其他问题进行荧光成像，以回答其他问题，例如破骨细胞活性和免疫反应的参与。

看完这个视频后，你应该对如何在潜在的血管生成中对骨再生进行成像有一个很好的了解。