Name: 测量外产酸和分析，以确定糖酵解率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学习使用细胞外通量分析技术精确测量细胞糖酵解速率的方法。该技术通过定量校正总细胞外酸化率，有效区分呼吸作用与糖酵解的质子产生率，为细胞代谢研究提供可靠数据。

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感谢 David A. Ferrick 和 David G. Nicholls 对项目构思和展示的贡献，Renata L.S. Goncalves 和 Akos A. Gerencser 提供了本文未展示的数据并参与了有益的讨论，Barbara Liepe 提供了 XF24 耗材，以及 Andy Neilson 在推导公式 (5) 过程中的建议。

1. 使用细胞外通量仪测量缓冲能力：两种变体方法
注意：此处描述的计算方法和实验方案是使用细胞外通量分析仪开发的。对于其他仪器，必须相应地调整检测体积。
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用浓盐酸（见材料与设备）配制0.1 M的标准盐酸水溶液。 
	注意：在表1中展示了为四个注射端口配制盐酸注射液的示例计算方法：</li>
</ol>
<img alt="连续盐酸注射表格；pH变化、浓度数据；无细胞检测；实验结果。" src="/files/ftp_upload/53464/53464table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 1"> 
表1. 向细胞外通量检测孔中连续加入盐酸。
<ol start="2">
	<li>在待检测的培养基中配制 HCl 标准品的稀释液，方法同前 表1 每个平板上进行的技术重复次数，另加一次以弥补移液误差； 例如，对于进样端口A的四次技术重复，准备一份（1.1 µl x 5) 0.1 M HCl 在（48.9 µl x 5 检测培养基。</li>
	<li>分配 50 µl 将测量探针卡的每个A端口均加入相应样本。对剩余的B、C和D端口重复此操作。</li>
	<li>运行细胞外通量分析10 采用标准校准循环，随后对四个进样口的每一次加样均进行两次循环（每次循环包括2分钟混匀、1分钟等待和5分钟测量）（参见 图2).
	<ol>
		<li>根据软件说明，在仪器软件中设置上述实验程序。将准备好的 cartridge 装入仪器，并根据软件说明进行校准。</li>
		<li>当程序提示时，取出含有校准液的板，将每孔含有检测培养基的板插入仪器中；继续运行程序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用每次添加标准酸前后稳态下获得的8-10个数据点（通常为最后8-10个点）的平均值，计算每次标准酸注入所引起的pH差值（∆pH，累积差值）。</li>
	<li>绘制 ∆pH 对 nmol H 的曲线图+ 包含在 7 µl 测量探针所捕获的体积。线性斜率即为缓冲能力（BP），单位为 mpH/pmol H+.</li>
	<li>作为步骤1.2–1.3的替代方案，可在使用A、B、C端口进行实验后，通过D端口注入HCl，随后按照该检测方法进行∆pH测定。如同 表2在细胞外通量分析板的20个实验孔中（不包括4个背景温度校正孔），每个5点标准曲线的每个数据点均使用四个技术重复样本来生成。</li>
</ol>
<img alt="HCl 注射引起的 pH 变化图；检测孔中的浓度、体积和标准误；动态平衡。" src="/files/ftp_upload/53464/53464table2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 2"> 
表 2. 向细胞外通量检测孔中单次注入 HCl。
2. 使用外部pH计测量缓冲能力
注意：使用外部pH探针测量培养基的缓冲能力时，需在37 °C下校准探针，并在实验过程中将所有试剂保持在此温度。
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用浓盐酸配制0.1 M的标准盐酸水溶液。</li>
	<li>将pH探针、pH标准缓冲液、待测缓冲能力的实验培养基以及0.1 M盐酸置于水浴中，升温至37 °C。</li>
	<li>按照制造商说明在37 °C下校准pH探针。在整个实验过程中，使用加热板或水浴将所有试剂保持在37 °C。</li>
	<li>取10 ml实验培养基加入小烧杯或锥形管中。使用浸入式pH探针持续监测pH值。</li>
	<li>以10–20 µl为一份，逐份向实验培养基中加入0.1 M盐酸。
	<ol>
		<li>每次加入酸后，使用磁力搅拌子或手动轻轻旋转容器，确保充分混匀。</li>
		<li>等待数秒使pH读数稳定，然后记录每次加入后的pH值。</li>
		<li>如表3所示，进行足够次数的加酸操作，以确保斜率计算的准确性，并覆盖实验过程中预期的pH变化范围。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="使用pH计进行缓冲能力分析，∆pH与H⁺纳摩尔数关系图，HCl滴定增量。" src="/files/ftp_upload/53464/53464table3highres.jpg" width="650" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 3"> 
表 3. 使用pH计测定缓冲能力。 数据代表一次典型的实验，共加入六次0.1 M HCl，每次20 µl。
<ol start="6">
	<li>以每 7 µl 加入的 H+ 纳摩尔数为横坐标，∆pH 为纵坐标作图，得到的线性斜率即为缓冲能力（图 1）。</li>
</ol>
<img alt="ΔpH 与 nmol H⁺ 的关系图；线性回归方程 y=0.0479x-0.0083，R²=0.994；数据分析。" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 缓冲能力的测定。盐酸标准曲线的测定方法如表 1、表 2或（此处）表 3所示。线性拟合曲线的斜率代表缓冲能力（在 7 µl 体系中，pH/nmol H+）。每个数据点代表 n = 9 次技术重复的均值 ± 标准误（SEM）。
<ol start="7">
	<li>一旦通过上述方法1或方法2确定了缓冲能力，可通过将ECAR信号（mpH/min）除以缓冲能力（BP）（mpH/pmol H+），并根据每孔的蛋白含量进行归一化，将ECAR信号转换为PPR（pmol H+/min/µg蛋白）： 
	PPRtot（pmol H+/min/μg蛋白）= ECAR（mpH/min）/ BP（mpH/pmol H+，7 μl体系中）/ 每孔蛋白量（μg）     公式6</li>
	<li>或者，可利用方法1或方法2中的相同实验，计算仪器软件用于在数据采集过程中自动计算PPR的缓冲容量（BC）值。 
	注意：仪器用户手册12（第107页）提供了有关计算和使用缓冲容量的详细信息，其中BC定义为： 
	BC（mol/L）= H+摩尔数 /（ΔpH × 缓冲液体积（L））     公式7 
	注意：公式7中定义的缓冲容量可通过上述仪器内或外接pH探针实验测定。缓冲能力与缓冲容量之间可方便地相互转换（见附带的电子表格）： 
	BC = 1 × 10-9 / BP（（mpH/pmol H+，7 µl体系中）/ 7 µl）     公式8 
	注意：若在实验前已知缓冲容量，可在实验设置期间直接将其输入仪器软件中。</li>
	<li>可将本流程及上述计算方法应用于大多数常规缓冲体系，具体如先前发表的研究6所述。 
	注意：表4列出了几种常规培养基的缓冲能力和缓冲容量。</li>
</ol>
<img alt="缓冲能力与缓冲容量表；测定培养基；成分；科研数据分析；pH缓冲液。" src="/files/ftp_upload/53464/53464table4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 4"> 
表4. 所选培养基的缓冲能力与缓冲容量。
3. 使用C2C12成肌细胞进行细胞外通量分析
注意：在步骤 3.4.3 中，C2C12 细胞培养中 CO2 衍生的酸生成量未观察到依赖于碳酸酐酶存在的差异，表明其存在对于 CO2 完全转化为 HCO3- + H+ 并非必需。然而，在省略碳酸酐酶之前，建议在不同的实验体系中对此进行实证测试。
<ol>
	<li>在37 °C、95% 空气/5% CO2 条件下，使用含11.1 mM葡萄糖、2 mM谷氨酰胺、10% v/v胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）培养小鼠C2C12成肌细胞13。</li>
	<li>在检测前24小时，将细胞以每孔20,000个细胞的密度接种于24孔聚苯乙烯细胞外通量检测板（见材料与方法）中，每孔加入100 µl上述培养基，无需额外包被。</li>
	<li>将寡霉素、FCCP、鱼藤素加霉菌素以及HCl（可选）用Krebs-Ringer磷酸盐HEPES（KRPH）检测培养基（含2 mM HEPES、136 mM NaCl、2 mM NaH2PO4、3.7 mM KCl、1 mM MgCl2、1.5 mM CaCl2、0.1% w/v无脂肪酸牛血清白蛋白，pH 7.4，37 °C）稀释至10倍终浓度。</li>
	<li>细胞准备
	<ol>
		<li>在检测前30分钟，通过吸弃培养基轻轻洗涤贴壁细胞三次，每次洗涤后缓慢加入500 µl KRPH培养基。</li>
		<li>第三次洗涤后，将细胞在37 °C空气环境中孵育（不要置于5% CO2环境中，以免改变该无碳酸氢盐培养基的pH）。</li>
		<li>检测开始时，将孔中KRPH更换为500 µl新鲜KRPH培养基，其中含500 U/ml碳酸酐酶及10 mM葡萄糖（或仅含培养基，不添加额外底物）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加载传感器 cartridge
	<ol>
		<li>用移液器将步骤3.3中配制的各10倍化合物溶液各取50 µl，加入细胞外通量传感器cartridge的指定孔位，如下所示（括号内为检测孔中的终浓度）：A孔：2 µg/ml寡霉素，B孔：0.5 µM FCCP，C孔：1 µM鱼藤素、1 µM霉菌素，D孔：HCl（如需进行检测内酸度校准，参见上文及表2）。 
		注意：为实现此处所述的呼吸链完全抑制，1 µM霉菌素可与1 µM抗霉素A互换使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞外通量检测：
	<ol>
		<li>按照文献10所述方法，进行标准的细胞外通量检测以评估呼吸控制。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
注意：针对实验的每个阶段，确定所需的混合时间、等待时间和测量时间，以及每个阶段的循环次数。
注意：数据在 表5 在每次区段中，经过两个检测循环（每个循环包括2分钟混匀、1分钟等待和5分钟测量），并在加入不同量的HCl（通过Port D加入，用于缓冲能力校准，如 表2).
<img alt="详细说明用于代谢活性检测的化合物注射及时间安排的Seahorse检测表格。" src="/files/ftp_upload/53464/53464table5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 5"> 
表5. 胞外通量检测配置。
4. 测定终点乳酸浓度
注意：为了在其他不同系统中验证此处所述的间接检测方法，可在传统的96孔板中直接测定细胞外通量实验结束时的终点乳酸浓度，具体方法是测量乳酸脱氢酶催化下NAD+ → NADH还原反应的初始速率（持续2分钟），该方法在我们先前的出版物中有详细描述6。在代表性结果所展示的数据中，含葡萄糖检测孔的终点乳酸浓度约为40 μM。
<ol>
	<li>配制2倍浓度的肼介质：1 M Tris、20 mM EDTA、400 mM 肼，pH 9.8（22 °C条件下）。在开始检测前立即加入NAD+至终浓度4 mM，并加入乳酸脱氢酶（LDH）至终浓度40 U/ml。最终检测介质组成（1倍浓度）：500 mM Tris、10 mM EDTA、200 mM 肼、2 mM NAD+、20 U/ml LDH。</li>
	<li>在完成细胞外通量检测后，立即从细胞外通量检测板的每个孔中移取100 μl检测介质，转移至不透明（黑色）96孔板的相应孔中。</li>
	<li>向每个样品孔中加入100 µl 2倍浓度的肼介质。</li>
	<li>立即将该板放入微孔板读数仪中，开始在激发波长340 nm、发射波长460 nm条件下监测NADH荧光信号。</li>
	<li>记录约2分钟内的初始反应速率。</li>
	<li>进行类似实验，通过绘制添加乳酸浓度在0至50 μM范围内对应的初始反应速率与乳酸浓度的标准曲线。</li>
	<li>利用标准曲线计算每个实验孔中的乳酸浓度。</li>
</ol>
5. 测定蛋白质含量
<ol>
	<li>从检测板的每个孔中移除残留的检测培养基。</li>
	<li>用 250 µl 不含 BSA 的 KRPH 溶液洗涤各孔三次，注意尽量减少细胞从孔底表面脱落。</li>
	<li>向检测板的每个孔中加入 25 µl RIPA 裂解液（150 mM NaCl，50 mM Tris，1 mM EGTA，1 mM EDTA，1% v/v Triton X-100，0.5% w/v 脱氧胆酸钠，0.1% v/v SDS，pH 7.4，22 °C）。</li>
	<li>将板置于冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>在板式摇床上以 1,200 rpm 振荡 5 分钟。</li>
	<li>采用标准方法测定蛋白浓度，例如 BCA 法，并确保裂解缓冲液的组成与所用检测方法兼容。图 2 实验中的蛋白含量约为 4 µg/孔。</li>
</ol>

<ol><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Anal. Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Meth. Enzymol. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+oxygen+kinetics+of+cellular+respiration+and+linear+oxygen+dependence+of+antimycin+A+inhibited+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption.</a> Mol. Biol. Rep. 29 (1-2), 83-87 (2002).</li>
<li>Helmlinger, G., Sckell, A., Dellian, M., Forbes, N. S., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+production+in+glycolysis-impaired+tumors+provides+new+insights+into+tumor+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism.</a> Clin. Cancer Res. 8 (4), 1284-1291 (2002).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. G., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1847, 171-181 (2015).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am. J. Physiol. 292 (1), C125-C136 (2006).</li>
<li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioenerg.+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> J. Bioenerg. Biomembr. 44 (4), 421-437 (2012).</li>
<li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Meth. Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li>
<li>Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp. (46), 2511(2010).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS ONE. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Seahorse Biosciences. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22F24+Extracellular+Flux+Analyzer+and+Prep+Station+Installation+and+Operation+Manual%22">F24 Extracellular Flux Analyzer and Prep Station Installation and Operation Manual</a>. 1.7, (2010).</li>
<li>Blau, H., Chiu, C., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+activation+of+human+nuclear+genes+in+human+heterocaryons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic activation of human nuclear genes in human heterocaryons.</a> Cell. 32, 1171-1180 (1983).</li>
</ol>

Shona Mookerjee 博士声明其不存在任何竞争性经济利益。Martin Brand 博士曾为 Seahorse Biosciences 提供咨询，该公司生产本文所用的仪器和试剂。

细胞外酸化是衡量细胞代谢速率的一个易于检测的指标。为了准确确定细胞糖酵解速率（以乳酸生成为定义），关键在于了解检测培养基的缓冲能力，并将氧消耗和酸化的细胞外通量测量值转换为质子生成速率。通过进行这一计算，可以扣除三羧酸循环中释放的 CO2 所引起的酸化，从而得到由乳酸生成引起的酸化。
本文提供的多种测量缓冲能力的方法各有优缺点。使用pH探针进行外部测量具有高度的准确性和可重复性，但可能无法反映检测板中所含荧光染料、检测过程中添加的化合物或细胞本身引入的微小pH检测差异。板内pH测量可解决这些问题，但也同时引入了不同程度的实验噪声。
对ECAR进行CO2校正后，首次实现了糖酵解速率的明确且定量的计算，并揭示了实验过程中呼吸作用和糖酵解对总ECAR贡献的变化。利用公式5以及OCR、ECAR和缓冲能力的测量值，可通过所提供的简单电子表格（表6）计算糖酵解速率。如有需要，可通过事后乳酸测定来验证该速率6。在磷酸戊糖途径高度活跃的细胞中，使用通路抑制剂（如6-氨基烟酰胺）可能有助于分离出糖酵解速率。通过所测得的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR），分别计算CO2-和乳酸来源的H+的贡献，是利用细胞外通量数据对代谢活性进行有力且定量分析的宝贵工具。
通过采用本文所述的实验流程，包括针对缓冲能力测定的各种改进方法，并针对所研究的细胞类型及所需数据对细胞外通量实验进行优化，可在多种实验条件下定量测定完整细胞的糖酵解速率。该方法仅适用于能够在聚苯乙烯表面贴壁培养生长的细胞，或可被固定于该表面的细胞或细胞器。当培养细胞具有较高均一性并达到汇合状态时，结果最为可靠；但在不同条件下仍可能获得有意义的数据。计算过程需要对细胞代谢特性有一定了解，因为不同底物完全氧化时的最大 H+/O2 比值范围为 0.65 至 1.0，而部分氧化时该比值更高6。然而，若已知细胞能够氧化葡萄糖，则可采用 1.0 作为该比值的假设值。
尽管该方法适用于所有代谢特征的表征，但在那些通过在呼吸代谢与糖酵解代谢之间转换以维持细胞ATP供应作为关键表型的系统中，该方法可能尤为有用，包括干细胞和肿瘤来源的癌细胞的表征。理解这些及其他情况下代谢调控的改变，将有助于对这些细胞类型进行更精细、更准确的实验设计与分析。

本方法的总体目标是利用细胞外通量分析准确测量细胞的糖酵解速率。在许多实验中，通过细胞外酸化定量测定糖酵解速率是期望达到的终点。然而，细胞外总酸化速率由两个组分构成：呼吸性酸化，以CO2形式存在（其水合生成H2CO3，随后解离为HCO3- + H+）；以及糖酵解性酸化，以乳酸- + H+形式存在。
直到最近，在本研究所使用的XF24分析仪这一检测平台上，CO2对总细胞外酸化的贡献被认为可以忽略不计7。然而，在多种其他系统中已明确表明，CO2可能是细胞外酸化的主要来源之一4-5。多篇文献承认了这一贡献，但并未尝试对CO2衍生的酸进行直接定量3,8,9。我们近期已通过定量方法证明，在该系统中CO2的产生是细胞外酸化的重要来源6。此外，尽管存在多种由葡萄糖分解代谢生成CO2的代谢途径，但主要贡献来自于三羧酸循环中线粒体脱氢酶所催化的反应，其他所有途径产生的CO2量均处于实验误差范围内6。
如果不校正 CO2 的产生，细胞外酸化率则不能明确指示糖酵解速率，因而无法用于定量分析。我们先前发表的研究指出，在某些通常被认为主要依赖糖酵解的细胞中，呼吸作用产生的 CO2 甚至构成了总酸化信号的主要部分6。此外，在常见的代谢谱分析实验过程中，呼吸作用产生的 CO2 对总酸化的贡献在不同阶段差异显著，这表明若要准确比较实验不同阶段的糖酵解速率，必须对 CO2 进行校正。
为了利用细胞外酸化速率来测定细胞的糖酵解速率，需要将pH变化转换为产生的总H+变化量，并减去三羧酸循环过程中释放的CO2所引起的细胞外酸化。本文介绍了一种直接测定细胞外质子生成速率（基于细胞外pH变化及测定培养基经校准的缓冲能力）和CO2生成量（基于细胞外O2浓度的变化）的方法，并演示如何利用这些测量值计算糖酵解速率。
该方法通过利用细胞外酸化测量值来准确计算由乳酸生成所定义的糖酵解速率，从而增强了细胞外酸化测量的实用性。如果不对呼吸性CO2进行校正（或不直接测量乳酸），则无法确定总酸化速率是否以及在多大程度上反映了糖酵解速率，这将导致将总细胞外酸化率直接作为乳酸生成量来解读实验结果时产生混淆。
计算
根据成肌细胞实验6，在实验误差范围内，CO2 和乳酸是细胞外酸产生的唯二贡献因素。因此，总的细胞外酸化速率（PPR，质子产生速率）可定义为：
PPRtot = PPRresp + PPRglyc &#160; &#160; 公式 1&#160;
其中，tot = 总量；resp = 呼吸作用；glyc = 糖酵解。因此，糖酵解型 PPR 为：
PPRglyc = PPRtot - PPRresp &#160; &#160; 公式 2
此处，
PPRtot = ECARtot/BP &#160; &#160; 公式 3
其中 ECAR = 细胞外酸化率（mpH/min），BP = 缓冲能力（mpH/pmol H+ 在 7 µl 中），而
PPRresp = (10pH-pK1/(1+10pH-pK1))(最大 H+/O2)(OCRtot – OCRrot/myx) &#160; &#160; 公式 4
其中，K1 = CO2 水合及其解离为 HCO3- + H+ 的总平衡常数；max H+/O2 = 特定代谢转化（如葡萄糖完全氧化6）所产生的 CO2 相关酸化程度；OCR = 耗氧速率（pmol O2/min）；OCRrot/myx = 非线粒体耗氧速率。
方程4通过减去任何非线粒体氧消耗率（OCR）（定义为对线粒体呼吸抑制剂鱼藤酮和粘噻唑敏感的OCR）来分离线粒体OCR，并考虑了每种底物在消耗每摩尔O2时所能产生的最大H+数量（最大H+/O2）（见参考文献6），以及在实验温度和pH条件下，生成H+的CO2所占比例（10pH-pK1/(1+10pH-pK1)）。对于葡萄糖的完全氧化，线粒体氧消耗率（OCR）恰好等于CO2的生成速率。在细胞外通量测定的封闭反应体系中，呼吸作用产生的CO2会滞留在测定介质中。大部分滞留的CO2会水合生成H2CO3，随后解离为HCO3- + H+。一小部分以溶解但未水合的形式存在，另一小部分则已水合但未解离，其比例由实验温度（37 °C）和pH（约7.4）下CO2水合及解离为HCO3- + H+的总平衡常数热力学决定。
因此，通过从 PPRtot 中减去 PPRresp 来计算 PPRg 的完整公式为：
PPRglyc = ECARtot/BP – (10pH-pK1/(1+10pH-pK1))(max H+/O2)(OCRtot – OCRrot/myx)     公式 5
通过这种方式，可从简单的测量（氧气消耗、细胞外酸化、缓冲能力）以及导入或计算其他所需参数（H+/02，P/O 和平衡常数 K1) 6本实验在使用细胞外通量分析仪（如 Seahorse XF24）的标准技术基础上进行了拓展 10,11；适用于其他细胞外通量检测格式（例如，XFe96 或 XFp），下方所有体积均应相应调整。
可通过在细胞外通量分析平台中直接构建标准曲线，或使用校准的pH探针单独构建标准曲线来测定检测体系的缓冲能力。本文提供了三种测定细胞外通量检测体系缓冲能力的方法：一种是使用细胞外通量分析仪的所有注射孔并配合无细胞的样品孔，另一种是仅使用含细胞样品孔的最后一个注射孔（第1节），第三种是使用外部pH测量方法（第2节）。示例数据的完整计算过程见所附电子表格。
为了利用细胞外通量仪的pH检测功能来测量缓冲能力，最稳妥的方法是使用不含细胞的孔板，以尽量减少信号波动。然而，在执行该测量时，含细胞孔板与不含细胞孔板之间的结果在误差范围内并无统计学差异（数据未显示）。注意：步骤1.7中所述的变异具有一个优势，即能够反映所添加化合物或细胞存在所可能引起的缓冲能力变化；但其缺点是信号噪声较大。然而，如上所述，在本实验所述条件下，表1所示的无细胞设计与表2中的实验后设计在计算所得的缓冲能力之间未发现显著差异。
此外，在较小的 ΔpH 范围内（&#60;0.4 个单位；实验上最好限制在 0.2 个单位以内），通过绘制 Δ mpH/pmol H+ 所得的线性斜率可充分近似 ΔpH 与 [H+] 之间的对数关系。因此，该标准曲线的斜率代表了在 7 µl 体积中待测实验介质的缓冲能力，单位为 pH/nmol H+，或 mpH/pmol H+（7 µl）。对于在测量时间内 pH 变化超过 0.2 个单位的样品，我们建议提高培养基的缓冲能力或降低细胞密度。也可缩短测量时间，但这可能会缩短稳态酸化速率，并在速率计算中引入误差。

<table><tbody><tr><td>Pherastar FS</td><td>BMG</td><td>n/a</td><td>微孔板读板仪</td></tr><tr><td>Seahorse XF-24</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>n/a</td><td>细胞外通量分析仪</td></tr><tr><td>Seahorse XF 检测板</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>V7-PS</td><td>耗材</td></tr><tr><td>XF 校准液</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td>溶液</td></tr><tr><td>HCl 标准品</td><td>Sigma</td><td>38280</td><td>化学品</td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>化学品</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>化学品</td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>化学品</td></tr><tr><td>黏噻唑菌素</td><td>Sigma</td><td>T5580</td><td>化学品</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>碳酸酐酶</td><td>Sigma</td><td>C2624</td><td>化学品</td></tr><tr><td>96 孔检测板</td><td>Corning</td><td>CLS3991</td><td>耗材</td></tr><tr><td>NAD&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma</td><td>N7004</td><td>化学品</td></tr><tr><td>LDH</td><td>Sigma</td><td>L1254</td><td>化学品</td></tr></tbody></table>

测量与分析细胞外酸产生以确定糖酵解速率

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

细胞外氧气消耗和酸生成的测量是监测呼吸速率和糖酵解速率的一种简单而有效的方法1。线粒体（呼吸作用）和非线粒体（其他氧化还原反应）过程均会消耗氧气，但可通过化学抑制线粒体呼吸作用来轻松区分这两类反应。然而，尽管线粒体耗氧量是呼吸速率明确且直接的测量指标2，细胞外酸生成与糖酵解速率之间的关系却不具有同等的明确性3-6。细胞产生的细胞外酸来源于无氧糖酵解生成的乳酸以及呼吸过程中三羧酸循环产生的CO2。对于糖酵解而言，葡萄糖转化为乳酸- + H+，并将其产物释放到检测培养基中，是糖酵解性酸化的来源；而对于呼吸作用，CO2被释放后水合形成H2CO3，并解离为HCO3- + H+，是呼吸性酸化的来源。糖酵解性和呼吸性酸化的比例取决于实验条件，包括细胞类型和所提供的底物，其范围可从几乎100%的糖酵解性酸化到几乎100%的呼吸性酸化6。本文以C2C12成肌细胞为模型，展示在培养的完整细胞中，确定呼吸和糖酵解对总细胞外酸化贡献所需的数据采集与计算方法。

图2展示了典型实验的原始数据。计算中使用了氧耗率（OCR）和pH值逐点记录中最后10个测量点（阴影垂直条所示）。最初人们担心每个检测周期的平均值（中间时间点测量值）无法提供足够分辨率以准确计算速率，特别是因为加样端口添加试剂后与达到稳态酸化速率之间似乎存在轻微延迟；但后续结果表明这种担忧并不成立，因为该因素似乎对计算误差的影响不显著（未显示）。另外，如果在实验设置过程中输入了正确的缓冲能力值，则可通过仪器软件中显示的PPR输出，或在仪器数据采集读数中选择PC兼容格式作为数据输出设置之一，直接读取PPR值。
<img alt="经寡霉素和FCCP处理后，线粒体呼吸和pH图，随时间变化的氧气消耗量。" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 氧气（O2）和质子（H+）的代表性胞外通量曲线。对应表5中示例实验的氧消耗率（OCR）和pH值变化曲线，实验开始时含有10 mM葡萄糖。端口D使用不同浓度的HCl进行缓冲能力校准（在这些平均曲线中未显示）。数据来自先前发表的研究6。每个数据点代表n = 8个生物学重复的均值±标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
代表性结果的数据分析
使用表6所示并作为附件提供的电子表格，可将各个孔的数据值输入标有黄色标题的列中。右侧的全部六列均由这些输入值自动计算得出。表6中的示例展示了如何利用在添加寡霉素前、有或无外源葡萄糖条件下的各孔ECAR和OCR数据，计算PPRresp和PPRglyc。通常将每个生物学样本的技术重复孔数据取平均值，以获得最后四列输出的单个数值，然后对不同生物学样本的数据进行平均，并在BP中适当地传递误差统计信息，以处理这四个数值。
<img alt="糖酵解速率计算图表；使用Excel公式分析呼吸和酸化参数。" src="/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 6"> 
表 6. 呼吸和糖酵解性酸化的计算。 黄色标题的列为需输入的计算值（例如，BP、max H+/O2）或数据采集值（例如，ECARtot、OCR）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg" target="_blank">请点击此处查看此表格的放大版本。</a> | <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464_Table_6.xlsx">请点击此处下载此表格的Excel电子表格版本。</a>
糖酵解和呼吸作用对校正后 PPR 的贡献
图3展示了根据表6计算得到的糖酵解和呼吸性酸化本底速率、加入寡霉素后（A孔）的速率以及加入FCCP后（B孔）的速率的图形化输出结果。这些数据清楚地表明，呼吸性和糖酵解性酸化的比例如何随着底物的选择（葡萄糖 vs. 未添加的对照（ctl））以及线粒体状态（本底功能 vs. 药物干预后的功能）而发生变化。
<img alt="PPR 柱状图；葡萄糖、油酸、FCCP 数据；蛋白质背景下的呼吸分析。" src="/files/ftp_upload/53464/53464fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 来自糖酵解和呼吸作用的质子产生速率（PPR）。使用公式 5 计算的 C2C12 细胞在添加葡萄糖（左侧三个柱）或未添加葡萄糖（右侧三个柱）条件下，来自呼吸作用（空心部分）和糖酵解（实心部分）的 PPR。数据来自6。所有数据均为 n = 8 个生物学重复的均值 ± 标准误（SEM）。

糖酵解是多种生物系统中一个关键的代谢标志。通过测量细胞外H+通量来监测糖酵解是常见的方法，但需要进行校正才能实现定量和明确的结果。本文演示如何采集并校正细胞外通量数据，以区分细胞外酸化的呼吸源性和糖酵解源性贡献。

细胞外测量氧气消耗和酸产生的方法是一种简单而强大的监测呼吸和糖酵解速率的方式¹。两者……

本实验的总体目标是利用细胞外通量分析技术准确测量细胞的糖酵解速率。该方法有助于解决细胞外通量分析领域中的某些模糊问题，特别是利用总细胞外酸化率来确定糖酵解速率的问题。该技术的主要优势在于，能够对总细胞外酸化率进行定量校正，从而分别获得呼吸作用和糖酵解过程中的质子生成速率。第二，使用细胞外通量仪测量缓冲能力时，首先将稀释后的酸液各50微升分别加入测量探针微孔板的A、B、C和D四个加样孔中。接着，编程细胞外通量仪运行一次细胞外通量检测，程序包括一个标准校准循环，随后对四个加样孔中的每一个进行两次加样循环。然后将准备好的微孔板装入仪器，并根据软件提示对仪器进行校准。当程序提示时，取出含有对照组的培养板，换入含有检测培养基的培养板。随后继续运行程序，使用每次加样前后稳态下获得的8至10个数据点的平均值进行计算。以计算每次注入标准酸所引起的pH累积变化量。以测量探针捕获的七微升体积中所含质子的摩尔浓度（M）为横坐标，pH 的变化值为纵坐标作图。线性斜率即为以毫 pH 单位表示的缓冲能力。作为替代方案，可分别在 A、B 和 C 加样口加入测定培养基，然后按照表格所示，向 D 加样口加入适当浓度的盐酸。然后使用四个技术重复样本来测定pH值，以在细胞外通量分析板的20个实验孔中生成五点标准曲线的每个数据点。为了使用外部pH计测定缓冲能力，将pH标准分析培养基和0.1摩尔盐酸在水浴中加热至37摄氏度，同时将pH探针在校准缓冲液中也预热至37摄氏度。根据制造商的说明在37摄氏度下校准探针，并将10毫升分析培养基分装至一个小容器中。将 pH 探针浸入培养基中以进行持续监测。然后每次向检测培养基中加入 10 至 20 微升 0.1 摩尔盐酸，并搅拌培养基。每次加入酸后，等待 pH 值稳定数秒，然后记录 pH 测量值，如表中所示。进行足够次数的添加操作，以确保准确计算斜率，并覆盖实验前30分钟内预期的pH范围。用移液器轻轻抽吸培养基，对相应贴壁细胞群体清洗三次，第三次清洗后，向每个孔缓慢加入500 µL KRPH缓冲液。将细胞在37 °C、空气条件下孵育30分钟，以启动实验。向每个孔中加入 500 微升新鲜 KRPH 培养基，其中含有每毫升 500 单位的碳酸酐酶，根据需要加入或不加入葡萄糖。将每种实验化合物各取 50 微升，按适当浓度加入细胞外通量传感器板的加样孔中，并运行标准的细胞外通量检测，以测定本图中的呼吸控制比。此处计算所用的数据来自典型实验结果，采用氧消耗速率和 pH 值连续记录中的最后 10 个测量时间点。通过分别计算细胞外酸化率和氧消耗率，得出呼吸作用质子产生速率和糖酵解质子产生速率，以确定加药前的本底状态。添加寡霉素后，图中显示了呼吸性和糖酵解性酸化的本底速率。根据表格计算得出的添加寡霉素后的速率以及添加FCCP后的速率在图中清晰展示，明确反映了呼吸性和糖酵解性酸化比例随底物变化而发生的变化。进行此操作时，重要的是要记住将酸化过程保持在与计划实验相同的温度下，通常按照本方案在37摄氏度下进行。其他检测方法（如乳酸测定）可用于验证计算得到的糖酵解速率。观看本视频后，您应能够充分理解如何收集和校正细胞外通量数据，以通过内部或外部酸校准来区分呼吸性和糖酵解性细胞外酸化。请注意，使用线粒体毒剂可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴手套，并在化学通风橱内称量干燥试剂。

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科研

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生物学

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