用于组织工程的温敏型纳米结构表面的制备

本研究采用嵌段共聚物的朗缪尔-许弗方法，其总体目标是通过调控细胞黏附力和附着状态，在不同条件下于温度响应性表面制备细胞片层。该方法有助于解答生物材料领域中的关键问题，例如生物相容性材料、细胞培养表面以及生物分离技术。该技术的主要优势在于能够调控温度响应性表面与细胞之间的相互作用，并可优化细胞片层回收的修饰条件。

尽管该方法可用于研究细胞与表面之间的相互作用，但也同样适用于生物分离和生物膜等其他系统。首先，将苯乙烯、ECT 和 ACVA 溶解于 40 毫升 1,4-二氧六环中。在真空条件下，用液氮冷冻溶液 15 至 20 分钟，以去除反应性物质。

将溶液在室温下缓慢解冻后，重复此冷冻、抽真空、解冻、脱气循环三次。将反应体系置于油浴中，在70摄氏度下聚合15小时，得到作为大分子RAFT试剂的聚苯乙烯。用800毫升乙醚沉淀聚苯乙烯大分子RAFT试剂，并在真空条件下干燥。

接下来，将IPAAm单体、聚苯乙烯大分子RAFT试剂和ACVA溶解于4毫升1,4-二氧六环中。采用与之前相同的冷冻-抽气-解冻脱气循环方法去除溶液中的氧气。脱气完成后，在油浴中于70摄氏度条件下进行聚合反应，持续15小时。

最后，以与聚苯乙烯大分子RAFT试剂相同的方法获得合成的St-IPAAm分子。用过量的丙酮和乙醇清洗玻璃基底，并超声处理五分钟以去除表面污染物。将基底置于65摄氏度的烘箱中干燥30分钟。

然后，在室温下使用氧气等离子体活化基底表面。将基底浸入含有1%六甲基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中，在室温下过夜，以对基底进行硅烷化处理。随后，用甲苯清洗硅烷化后的基底，并将其浸入丙酮中30分钟，以去除未反应的试剂。

将基底在 110 摄氏度下退火两小时，以充分固定表面。最后，使用玻璃刀将硅烷化基底切割成 25 毫米 × 24 毫米，以适配细胞培养皿。将朗格缪尔膜仪放置于柜子中，防止灰尘积聚。

用蒸馏水和乙醇清洗表面张力仪的挡板，以去除污染物。用无绒布擦拭槽体和挡板使其干燥。然后向槽中加入约 110 毫升的蒸馏水，并将挡板置于槽的两侧。

接着，用燃气喷灯加热用于监测表面张力的铂金威尔赫米板，直至板体变红。然后用蒸馏水清洗该板，以去除污染物。将威尔赫米板悬挂在连接于表面压力测量仪器的金属丝上。

根据制造商的方案将表面压力测量仪器归零。通过槽体两侧的屏障压缩槽内空气与水的界面，直至界面面积缩小至约50平方厘米，且无聚合物液滴存在。吸取任何微小污染物，直至表面压力接近0毫牛顿每米。

调整两侧的屏障，并添加蒸馏水以补偿蒸馏水的减少量。接下来，将五毫克合成的 St-IPAAm 分子溶解于五毫升氯仿显影液中。然后，使用微量注射器或微量移液器，将 27 微升溶于氯仿中的 St-IPAAm 缓慢滴加至水槽中。

等待五分钟，使氯仿完全蒸发后，将两侧屏障水平移动，以压缩表面的 St-IPAAm 分子。保持屏障压缩速率为每秒 0.5 毫米，直至达到目标面积 50 平方厘米。在压缩过程中，根据仪器制造商的操作说明，使用连接在表面压力测量仪器上的铂金威尔赫米板测定表面压力 π-A 等温线。

达到目标面积后，保持表面五分钟，使 St-IPAAm 分子松弛。分子在压缩后不会立即达到平衡状态。随后，使用转移装置将 Langmuir 膜转移至疏水化修饰的玻璃基底上，持续五分钟，以牢固吸附薄膜。

将疏水性玻璃基底平行固定在装置上。将装置连接至对准平台并垂直移动。使用转移装置水平抬起基底，并在干燥器中干燥一天。

为制备细胞悬液，将牛颈动脉内皮细胞（BAECs）在含胎牛血清（FBS）和青霉素的DMEM培养基中，于37摄氏度、5%CO2和95%空气条件下，在组织培养级聚苯乙烯培养器皿中培养至30%汇合度。达到汇合度后，在37摄氏度、5%CO2和95%空气条件下，用3毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液处理BAECs 3分钟，随后加入10毫升含10%FBS的DMEM培养基以终止胰蛋白酶-EDTA的消化作用。

将细胞悬液收集到50毫升的锥形离心管中。在120 × g条件下离心5分钟，吸除上清液，并将细胞重悬于10毫升DMEM培养基中。使用一次性血细胞计数板计数后，以每平方厘米10,000个细胞的浓度将回收的细胞接种至St-IPAAm表面。

在37摄氏度、5% CO2和95%空气条件下，使用配备培养箱的显微镜观察表面的细胞。接着，使用洁净台中配备的紫外灯对St-IPAAm表面进行灭菌。在37摄氏度下，利用10倍放大倍率的相差显微镜，记录贴壁BAECs的延时图像，持续约24.5小时。

BAEC 细胞黏附后，在 20 摄氏度下记录 BAECs 从 St-IPAAm 表面脱落的过程，持续约 3.5 小时。在优化了Langmuir膜转移表面的细胞黏附与脱落条件后，首先按照前述方法培养 BAECs 以制备细胞片。在 St-IPAAm 表面上接种密度为每平方厘米 100,000 个细胞。

在37摄氏度、5%CO2条件下孵育三天。在20摄氏度时，汇合的BAECs自发脱落。此处展示了温度响应性Langmuir膜转移表面的制备过程。

将合成的St-IPAAm氯仿溶液轻轻滴加至空气-水界面。利用两个屏障在界面上压缩St-IPAAm分子，直至达到目标面积50平方厘米。在压缩过程中测量表面压力，以检测Langmuir膜是否存在任何缺陷。

压缩后，将经疏水性修饰的盖玻片基底通过定位台水平放置于界面处。将基底水平提起并干燥一天。此步骤完成后，St-IPAAm 表面即可用于细胞培养实验。

此处展示了苯乙烯-异丙基丙烯酰胺（St-IPAAm）表面原子力显微镜地形图像的代表性结果。在两种St-IPAAm表面上均观察到了纳米结构。纳米结构的尺寸和形状强烈依赖于AM以及St-IPAAm的组成。

图中显示了在接枝有 St-IPAAm 480 且分子面积为 40 平方纳米每分子的 Langmuir 膜转移表面上回收得到的细胞片的宏观图像。细胞在 37 摄氏度下于 St-IPAAm 170 和 St-IPAAm 480 表面培养三天后达到汇合状态。当温度从 37 摄氏度降至 20 摄氏度时，细胞片得以快速回收。

观看本视频后，您应充分理解如何制备聚合物、如何设计聚合物的分子组成、如何制备与转移朗缪尔膜、如何控制细胞的黏附与脱附，以及如何回收细胞片层。该技术的发展为生物材料与组织工程领域的研究人员探索细胞与表面之间的相互作用，以及退行性疾病治疗中所用的细胞培养策略，开辟了新的途径。该技术的应用前景还延伸至细胞移植治疗领域，因其具备制备来源于患者多种细胞类型的细胞片层的潜力。