温敏纳米结构表面的组织工程准备
March 1st, 2016
由热响应嵌段共聚物组成的纳米级海岛表面通过 Langmuir-Schaefer 方法制造，用于控制自发细胞粘附和分离。表面的制备以及细胞在表面上的粘附和分离都被可视化。
这种使用嵌段共聚物的 Langmuir-Schaefer 方法的总体目标是通过控制细胞粘附和附着的强度，在温度响应表面的各种条件下制造细胞片。这种方法可以帮助回答生物材料领域的关键问题，例如生物相容性材料、细胞培养表面和生物分离。该技术的主要优点是可以控制温度响应表面和细胞之间的相互作用，并且可以优化细胞片恢复的修饰条件。
虽然这种方法可以深入了解细胞和表面之间的相互作用，但它也可以应用于其他系统，例如生物分离和生物膜。首先，将苯乙烯、ECT 和 ACVA 溶解在 40 毫升 1,4-二恶烷中。在真空下将液氮溶液冷冻 15 至 20 分钟，以去除活性物质。
在室温下逐渐解冻溶液后，重复此冷冻、泵送、解冻、脱气循环 3 次。通过在 70 摄氏度下在油浴中聚合 15 小时，获得聚苯乙烯作为宏观 RAFT 剂。用 800 毫升乙醚沉淀聚苯乙烯 macro-RAFT 试剂，并在真空中干燥。
接下来，将 IPAAm 单体、聚苯乙烯 macro-RAFT 试剂和 ACVA 溶解在 4 毫升 1,4-二恶烷中。像以前一样，使用冷冻、泵送、解冻脱气循环去除溶液中的氧气。脱气后，在 70 摄氏度的油浴中进行聚合 15 小时。
最后，以与聚苯乙烯 macro-RAFT 试剂相同的方式获得合成的 St-IPAAm 分子。用过量的丙酮和乙醇清洗玻璃基板，并超声处理 5 分钟以去除表面污染物。将基材放入 65 摄氏度的烘箱中干燥 30 分钟。
然后，使用氧等离子体在室温下活化基材表面。在室温下将底物浸入含有 1% 六三甲氧基硅烷的甲苯中过夜，以使底物酰基化。然后，在甲苯中洗涤酰基化底物，并在丙酮中浸泡 30 分钟，以去除未反应的试剂。
在 110 摄氏度下对基材进行 2 小时退火，以彻底固定表面。最后，用玻璃切割机将苯乙烯化底物切割成 25 毫米 x 24 毫米，以适合细胞培养皿。将 Langmuir 胶片仪器放在柜子中，以防止灰尘积聚。
用蒸馏水和乙醇清洗屏障中的 Langmuir 槽以去除污染物。用不起毛的毛巾擦拭擦干槽和障碍物。然后用大约 110 毫升蒸馏水填充槽，并在槽的两侧设置屏障。
接下来，用燃气燃烧器加热铂 Wilhelmy 板以监测表面张力，直到板变红。然后用蒸馏水清洗板以去除污染物。将 Wilhelmy 板悬挂在连接到表面压力测量仪的电线上。
根据制造商的协议将表面压力测量仪归零。通过槽两侧的障碍物压缩槽上的空气、水界面，直到界面达到约 50 平方厘米，没有任何聚合物滴。吸出任何小污染物，直到表面压力接近零毫牛顿/米。
重新定位两侧的屏障，并加入蒸馏水以补偿蒸馏水的减少。接下来，将 5 毫克合成的 St-IPAAm 分子溶解在 5 毫升氯仿显影液中。然后，使用微量注射器或微量移液管将 27 微升溶解在氯仿中的 St-IPAAm 轻轻滴到槽上。
等待 5 分钟让氯仿完全蒸发后，水平移动两个屏障以压缩表面的 St-IPAAm 分子。将屏障的压缩速率保持在每秒 0.5 毫米，直到达到 50 平方厘米的目标区域。根据制造商的协议，在压缩过程中，使用连接到表面压力测量仪器的铂 Wilhelmy 板测量表面压力 Pi-A 等温线。
达到目标区域大小后，保持表面 5 分钟，让 St-IPAAm 分子松弛。分子在压缩后不会立即达到平衡。然后，使用转印装置将 Langmuir 薄膜转移到疏水改性玻璃基板上 5 分钟，以牢固地吸收薄膜。
将疏水性玻璃基板平行固定在设备上。将设备连接到对齐台并垂直移动。用转移装置水平提起基材，并在干燥器中干燥一天。
为了制备细胞悬液，在 37 摄氏度下，在 5% CO2 和 95% 空气中培养牛颈动脉内皮细胞 （BAEC） 至 1/3 汇合，在含有 FBS 和青霉素的 DMEM 组织培养聚苯乙烯上。达到汇合点后，在 37 摄氏度下，在 5% CO2 和 95% 空气中用 3 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 处理 BAEC 3 分钟。通过添加 10 毫升含有 10% FBS 的 DMEM 来灭活胰蛋白酶 EDTA。
并将细胞悬液收集在 50 毫升锥形管中。以 120 x g 离心 5 分钟后，吸出上清液，并将细胞重悬于 10 mL DMEM 中。将回收的细胞以每平方厘米 10， 000 个细胞的浓度接种在 St-IPAAm 表面上，用一次性血细胞计数器计数。
通过配备有 37 摄氏度培养箱、5% CO2 和 95% 空气的显微镜观察表面上的细胞。接下来，通过配备在洁净工作台上的紫外线对 St-IPAAm 表面进行消毒。使用放大倍率为 10 倍的相差显微镜在 37 摄氏度下记录贴壁 BAEC 的延时图像约 24.5 小时。
BAEC 粘附后，记录 BAEC 在 20 摄氏度下从 St-IPAAm 表面分离约 3.5 小时。在 Langmuir 膜转移表面上优化细胞粘附和分离后，像以前一样首先培养 BAEC 来制造细胞片。在 St-IPAAm 表面上每平方厘米接种总共 100， 000 个细胞。
并在 37 摄氏度的 5% CO2 中孵育三天。汇合的 BAEC 在 20 摄氏度时自发分离。这里显示了温度响应 Langmuir 薄膜转移表面的制备。
将合成的 St-IPAAm 氯仿溶液轻轻滴入空气、水界面上。使用两个屏障压缩界面上的 St-IPAAm 分子，直到达到 50 平方厘米的目标区域。在压缩过程中测量表面压力以检测 Langmuir 薄膜中的任何缺陷。
压缩后，将疏水改性的盖玻片基板水平放置在带有对准台的界面上。将基材水平提起并干燥一天。完成此步骤后，St-IPAAm 表面即可用于细胞培养实验。
此处显示了 St-IPAAm 表面的原子力微观形貌图像的代表性结果。在两个 St-IPAAm 表面上都观察到纳米结构。纳米结构的大小和形状在很大程度上取决于 AM 和 St-IPAAm 的组成。
在这里，显示了使用 St-IPAAm 480 转移表面的 Langmuir 薄膜上回收的细胞片的宏观图像，以及每个分子 40 平方纳米的 AM。细胞在 37 摄氏度下在 St-IPAAm 170 和 St-IPAAm 480 表面培养 3 天后达到汇合。将温度从 37 摄氏度降低到 20 摄氏度后，细胞片被迅速恢复。
看完这个视频，你应该对如何制造、如何设计聚合物的分子组成、制造和转移 Langmuir 薄膜、控制细胞粘附和分离以及恢复细胞片有一个很好的了解。开发后，该技术为生物材料和组织工程领域的研究人员探索细胞与表面之间的相互作用以及用于退行性医学的细胞培养策略铺平了道路。该技术的含义延伸到细胞移植治疗，因为该技术有可能制造由患者提供的各种细胞类型的细胞片。
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概览
本研究展示了使用热响应性阻断共聚物通过Langmuir-Schaefer方法制造纳米级海岛表面。这些表面被设计用于控制细胞在温度变化时的粘附和脱离。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物材料
- 细胞培养
- 表面工程
背景
- 热响应性材料可以随温度改变其性质。
- 控制细胞粘附对于组织工程至关重要。
- Langmuir-Schaefer方法允许精确的表面制造。
- 理解细胞-表面相互作用是生物材料研究的关键。
研究目的
- 制造具有可控粘附性质的细胞片。
- 探索温度对细胞粘附和脱离的影响。
- 优化细胞片恢复的条件。
使用的方法
- 在1,4-二氧六环中溶解苯乙烯、ECT和ACVA。
- 使用液氮冷冻溶液并移除反应物。
- 采用Langmuir-Schaefer方法进行表面制造。
- 观察细胞在制造的表面上的粘附和脱离。
主要结果
- 成功制造热响应性表面。
- 展示了对细胞粘附和脱离的控制。
- 洞察细胞与温度响应性表面之间的相互作用。
- 在生物分离和生物膜研究中的潜在应用。
结论
- Langmuir-Schaefer方法对于创建功能性生物材料表面是有效的。
- 温度响应性表面可以针对各种应用进行优化。
- 这种方法为细胞-表面相互作用提供了宝贵的洞察。
常见问题
Executive Industry Relevance
Thermoresponsive nanostructured surfaces enable precise control over cell adhesion and detachment, supporting reproducible cell sheet fabrication for tissue engineering applications. This approach addresses key challenges in biomaterials development by providing tunable interfaces that modulate biological responses through temperature shifts. The method enhances predictive confidence in preclinical models by standardizing cell-culture substrates and improving reproducibility in regenerative medicine workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cell-surface interactions under defined physicochemical conditions to validate mechanistic hypotheses in biomaterials.
- Operational Value: Provides a standardized platform for assessing biocompatibility and cell adhesion strength across experimental variables.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, temperature-dependent readouts of cell adhesion and detachment for assay standardization.
- Operational Value: Supports scalable fabrication of reproducible surfaces for high-throughput screening of biomaterial candidates.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates recovery of intact cell sheets, enabling preclinical evaluation of tissue-like constructs without enzymatic dissociation.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical stages by providing a consistent substrate for longitudinal cell culture studies.
Pipeline & Workflow Integration
The Langmuir-Schaefer fabrication of thermoresponsive surfaces integrates into early discovery workflows to generate standardized cell-culture platforms that support lead identification and preclinical validation through controlled cell-sheet recovery.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell adhesion mechanisms by enabling precise modulation of surface properties via temperature.
- Screening: Delivers assay-ready surfaces with nanoscale topography and reproducible physicochemical properties for compound or material evaluation.
- Analytics: Provides quantitative measurements of adhesion strength and detachment kinetics as functional readouts for material screening.
- Translational Research: Enables continuity from cell culture to tissue-like construct generation, supporting preclinical validation of engineered tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating consistent cell sheets across multiple experimental campaigns and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation by reducing variability in cell adhesion assays through surface standardization.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability of cell sheet production for regenerative medicine applications.
- Strategic Value: De-risks translational advancement by enabling reliable recovery of functional cell sheets without compromising cell viability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of biomaterial candidates through predictable, temperature-controlled performance.
Implementation Considerations
- Expertise in polymer synthesis, Langmuir-blodgett techniques, and surface characterization is required.
- Instrumentation includes Langmuir trough, Wilhelmy plate, AFM, and controlled environment cell culture systems.
- Standardization across teams necessitates protocol harmonization for substrate preparation, film transfer, and temperature cycling.
- Adaptation to different cell types may require optimization of seeding density, culture duration, and temperature transition protocols.
- Practical limitations include sensitivity to subphase purity, barrier speed control, and substrate hydrophobicity for successful film transfer.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Synthesis of Polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide) by Two-step Reversible Addition-fragmentation Chain Transfer (RAFT) Radical Polymerization
2:42
Preparation of Silanized Hydrophobic Modified Glass Substrates
3:49
Preparation of Langmuir Films and Film-transferred Surface
6:59
Culturing Cells and Optimizing Cell Adhesion and Detachment on the Langmuir Film Transferred Surface
9:32
Results: Fabrication of Langmuir Film-transferred Surface and Evaluation of Cell Adhesion, Detachment, and Cell Sheet Recovery
11:20
Conclusion
