Name: 温敏纳米结构表面的组织工程准备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: 了解利用Langmuir-Schaefer方法制备温敏纳米结构表面以控制细胞黏附与脱附的技术。该方法可用于组织工程中的细胞片层回收，为生物材料研究提供可控的细胞-表面相互作用平台。

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本研究由日本文部科学省（MEXT）“先进跨学科研究计划创新中心创建项目”资助，项目名称为“细胞片组织工程中心（CSTEC）”。

1. 通过两步可逆加成-断裂链转移（RAFT）自由基聚合合成聚苯乙烯-嵌段-聚(N-异丙基丙烯酰胺)
<ol>
	<li>将苯乙烯（153.6 mmol）、4-氰基-4-(乙基硫代羰基)硫代戊酸（ECT；0.2 mmol）和4,4'-偶氮二(4-氰基戊酸)（ACVA；0.04 mmol）溶于40 ml 1,4-二氧六环中。在真空条件下将溶液置于液氮中冷冻15–20分钟以去除活性物质，随后在室温下缓慢解冻。确保溶液完全解冻后，重复此冷冻-抽真空-解冻除气循环三次。</li>
	<li>在油浴中于 70 °C 下聚合 15 小时，制备分子量（Mw）为 13,500 的聚苯乙烯（PSt）作为大分子 RAFT 试剂。</li>
	<li>用800 ml乙醚沉淀PSt大分子RAFT试剂，并干燥 在真空中.</li>
	<li>将IPAAm单体（4.32 mmol）、PSt大分子RAFT试剂（0.022 mmol）和ACVA（0.004 mmol）溶解于4 ml 1,4-二氧六环中。</li>
	<li>按照步骤1.1中所述，通过冷冻-抽气-解冻脱气循环去除溶液中的氧气。</li>
	<li>在脱气后，于油浴中70 °C条件下进行15小时聚合反应。以与合成PSt大分子RAFT试剂相同的方法获得合成的St-IPAAm分子（Mw: 32,800）。</li>
</ol>
2. 硅烷化疏水改性玻璃基底的制备
<ol>
	<li>用过量的丙酮和乙醇清洗玻璃基底（24 mm × 50 mm），并超声处理5分钟，以去除表面污染物。</li>
	<li>将基底在65 °C的烘箱中干燥30分钟。然后在室温下使用氧气等离子体（400 W，3分钟）活化基底表面。</li>
	<li>将基底浸入含有1%己基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中，在室温下过夜，以实现基底的硅烷化。</li>
	<li>用甲苯清洗硅烷化后的基底，并将其浸入丙酮中30分钟，以去除未反应的试剂。</li>
	<li>在110 °C下退火处理基底2小时，以充分固定表面。</li>
	<li>使用玻璃切割刀将硅烷化基底切割为25 mm × 24 mm，以适配细胞培养皿（培养皿尺寸：φ35 mm）。</li>
</ol>
3. 朗缪尔膜及膜转移表面的制备
<ol>
	<li>将朗缪尔膜天平仪器置于柜子中，以防止灰尘积聚。</li>
	<li>用蒸馏水和乙醇清洗朗缪尔槽（尺寸：580 mm × 145 mm）及挡板，以去除污染物。</li>
	<li>用无绒布擦拭槽体和挡板使其干燥。然后向槽中加入约110 ml蒸馏水，并将挡板置于槽的两侧。注意，在后续步骤3.5至3.13中添加蒸馏水时应避免洒出。</li>
	<li>用气体燃烧器加热用于监测表面张力的铂金威尔赫米板（周长：39.24 mm），直至其变红，随后用蒸馏水清洗以去除污染物。将威尔赫米板悬挂在连接至表面压力测量仪器的金属丝上。</li>
	<li>根据制造商的操作规程将表面压力测量仪器归零。通过槽体两侧的挡板压缩空气-水界面，使界面面积压缩至约50 cm2，此时不加入任何聚合物液滴。</li>
	<li>吸除少量污染物，直至表面压力接近0 mN/m。</li>
	<li>重新调整两侧挡板的位置，并添加蒸馏水以补偿步骤3.6中损失的水量。</li>
	<li>将5 mg合成的St-IPAAm分子溶解于5 ml氯仿显影液中。 
	注意：二氯甲烷或甲苯也可作为溶剂使用。</li>
	<li>使用微量注射器或移液枪，将27 µl溶于氯仿的St-IPAAm溶液轻轻滴加到槽面上。</li>
	<li>静置5分钟，使氯仿完全蒸发后，水平移动两侧挡板以压缩界面处的St-IPAAm分子。保持挡板压缩速率为0.5 mm/sec，直至达到目标面积50 cm2。 
	注意：过快的压缩速率会导致朗缪尔膜出现缺陷。</li>
	<li>在压缩过程中，根据制造商的操作规程，使用连接在表面压力测量仪器上的铂金威尔赫米板测量表面压力（π）-Am等温线。</li>
	<li>达到目标面积后，保持界面稳定5分钟，使St-IPAAm分子得以松弛；分子在压缩后不会立即达到平衡状态。</li>
	<li>使用转移装置将朗缪尔膜转移至疏水改性的玻璃基底上，持续5分钟，以牢固吸附成膜。将疏水性玻璃基底平行固定在装置上。将装置连接至对准平台并垂直移动。</li>
	<li>用转移装置将基底水平提起，并在干燥器中干燥1天。</li>
</ol>
4. 在朗缪尔膜转移表面上培养细胞并优化细胞黏附与解离
<ol>
	<li>制备细胞悬液时，将牛颈动脉内皮细胞（BAECs）在含10%胎牛血清（FBS）和100 U/ml青霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2和95%空气条件下，在组织培养用聚苯乙烯（TCPS）表面培养至约三分之一汇合度。</li>
	<li>当细胞达到汇合状态后，在37 °C、5% CO2和95%空气条件下，用3 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA处理BAECs 3分钟。</li>
	<li>加入10 ml含10% FBS的DMEM以终止胰蛋白酶-EDTA的消化作用，并将细胞悬液收集至50 ml锥形管中。</li>
	<li>以120 × g离心5分钟，吸除上清液，再用10 ml DMEM重悬细胞。</li>
	<li>将St-IPAAm表面置于洁净台内的紫外灯下照射5分钟，进行灭菌处理。</li>
	<li>使用一次性血细胞计数板计数，以1.0 × 104 cells/cm2的浓度将回收的细胞接种到St-IPAAm表面，并在配备培养箱的显微镜下于37 °C、5% CO2和95%空气条件下观察细胞在表面的生长情况。 
	注意：使用洁净台配备的紫外灯对St-IPAAm表面进行灭菌。</li>
	<li>在37 °C条件下，使用10倍放大倍率的相差显微镜连续拍摄贴壁BAECs的延时图像约24.5小时；BAEC贴壁后，再于20 °C条件下记录BAECs从St-IPAAm表面脱落的过程，持续约3.5小时。</li>
</ol>
5. 在朗格缪尔膜转移表面上制备细胞片
<ol>
	<li>以第4节所述相同方式培养BAECs。</li>
	<li>在St-IPAAm表面接种总量为1.0 × 105 cells/cm2的细胞，并在37 °C、5% CO2条件下培养3天。当温度降至20 °C时，融合的BAECs自发脱落。</li>
</ol>

<ol><li>Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+release+of+macromolecules+from+electrical+and+chemical+stimuli-responsive+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Makromol.+Chem.%2C+Macromol.+Symp%22%5BJournal%5D)">Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels.</a> Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).</li>
<li>Fu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+control+of+free+energy+and+topography+of+nanostructured+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).</li>
<li>Nykanen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+behavior+and+temperature-responsive+molecular+filters+based+on+self-assembly+of+polystyrene-block-poly%28N-isopropylacrylamide%29-block-polystyrene%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene.</a> Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).</li>
<li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+switching+between+superhydrophilicity+and+superhydrophobicity%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).</li>
<li>Shuler, R. L., Zisman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+the+behavior+of+Polyoxyethylene+at+the+air-water+interface+by+wave+damping+and+other+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods.</a> J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).</li>
<li>Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+monolayer+dynamics+at+the+air%2Fwater+interface+by+surface+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering.</a> Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).</li>
<li>Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+solvent+and+temperature+effects+on+interfacial+properties+of+Poly+%28N-isopropylacrylamide%29+films+at+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface.</a> Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).</li>
<li>Jheng, K. T., Hsu, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+effect+of+PMMA+on+its+miscibility+with+PS-b-PEO+at+the+air%2Fwater+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Polym.+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface.</a> J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).</li>
<li>Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+on+a+polymerized+peptide-amphiphile+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer.</a> Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).</li>
<li>Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsiveness+of+poly%28N%2CN-diethylacrylamide%29+polymers+at+the+air-water+interface%3A+The+effect+of+a+hydrophobic+block%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+colloid+interface+sci%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block.</a> Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).</li>
<li>Wang, S. Q., Zhu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+method+to+prepare+smooth+and+homogeneous+polymer+brush+surfaces+of+varied+brush+thickness+and+grafting+density%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density.</a> Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).</li>
<li>Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Langmuir%E2%88%92Schaefer+%28LS%29+macroinitiator+film+control+on+the+grafting+of+a+thermosensitive+polymer+brush+via+surface+initiated-ATRP%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP.</a> Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).</li>
<li>Seo, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanowire+and+mesh+conformations+of+diblock+copolymer+blends+at+the+air%2Fwater+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface.</a> Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).</li>
<li>Lu, Q., Bazuin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-assisted+formation+of+nanostrand+networks+from+supramolecular+diblock+copolymer%2Fsurfactant+complexes+at+the+air%2Fwater+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+lett%22%5BJournal%5D)">Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface.</a> Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).</li>
<li>Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+highly+ordered+dot+array+of+surface+micelles+of+a+block+copolymer+via+liquid+crystal-hybridized+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly.</a> Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).</li>
<li>Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+order+transition+in+nanodot-forming+diblock%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).</li>
<li>Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+behavior+of+polystyrene-b-poly%28acrylicacid%29+at+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface.</a> Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).</li>
<li>Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Today%22%5BJournal%5D)">Cell sheet engineering.</a> Mater. Today. 7 (5), 42-47 (2004).</li>
<li>Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+report+on+cell+culture+on+a+thermally+reversible+copolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer.</a> Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).</li>
<li>Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeation+control+through+porous+membranes+immobilized+with+thermosensitive+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer.</a> Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).</li>
<li>Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+cell+sheet+recovery+by+co-grafting+of+PEG+with+PIPAAm+onto+porous+cell+culture+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes.</a> Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).</li>
<li>Kikuchi, A., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructured+designs+of+biomedical+materials%3A+applications+of+cell+sheet+engineering+to+functional+regenerative+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs.</a> J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).</li>
<li>Fukumori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ultra-thin+temperature-responsive+polymer+layer+and+its+polymer+thickness+dependency+on+cell+attachment%2Fdetachment+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+biosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties.</a> Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).</li>
<li>Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+chain+length+and+graft+density+of+thermoresponsive+polymer+brushes+for+optimizing+cell+sheet+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest.</a> Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).</li>
<li>Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+poly%28N-isopropylacrylamide%29-based+block+copolymer+coating+for+optimizing+cell+sheet+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication.</a> Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).</li>
<li>Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakuma%2C+M+%22J.+Biomater.+Sci.%2C+Polym.+Ed%22">J. Biomater. Sci., Polym. Ed</a>. 25 (5), 431-443 (2014).</li>
<li>Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+nanostructured+surfaces+generated+by+the+Langmuir-Schaefer+method+are+suitable+for+cell+sheet+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication.</a> Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).</li>
<li>Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+RAFT+polymerization%3A+the+synthesis+of+polymers+with+defined+end-groups%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups.</a> Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).</li>
<li>Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNishida%2C+K+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 351 (12), 1187-1196 (2004).</li>
<li>Ohki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+esophageal+stricture+after+endoscopic+submucosal+dissection+using+tissue-engineered+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets.</a> Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).</li>
<li>Sawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+myoblast+sheets+improved+cardiac+function+sufficiently+to+discontinue+LVAS+in+a+patient+with+DCM%3A+report+of+a+case%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Today%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case.</a> Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).</li>
</ol>

所有作者均同等程度地参与了论文的撰写，并已批准最终版本。作者声明不存在任何竞争性财务利益。

通过朗格缪尔-许弗尔（Langmuir-Schaefer）方法制备了一种温度响应性表面，并对细胞黏附/脱附及细胞片层回收的表面性能进行了优化。采用该方法制备表面时，多个步骤至关重要。St-IPAAm 分子的分子组成对表面结构、表面稳定性以及细胞黏附与脱附行为具有显著影响。特别是，St-IPAAm 分子应具有较窄的分子量分布。在本方法中，通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合法合成了两种具有不同 PIPAAm 链长的 St-IPAAm 分子，从而实现了对分子量及分子量分布的精确调控。
在制备 St-IPAAm 表面时，应采取措施防止气-水界面受到污染，以避免纳米结构出现缺陷。在将聚合物分子滴加到界面前，应抽吸污染物，直至表面压力降至约 0 mN/m。污染物容易在槽体边缘和威尔赫尔米（Wilhelmy）板周围积聚。由于威尔赫尔米板表面存在部分污染，已对其进行退火处理。当使用滤纸制成的威尔赫尔米板时，应在界面处重复抽吸步骤至少两次。π-Am 等温线曲线也受气-水界面污染状况的影响。我们建议在成膜前至少重复测量一次等温线曲线。由于疏水性修饰的玻璃基底也可能被污染，应...

纳米结构表面由于其在图案化、细胞培养、清洁和表面切换等方面的多种潜在应用，近年来受到了广泛关注。例如，受荷叶纳米结构及其他响应性表面启发的超疏水表面能够对外部刺激产生响应1-4。
朗缪尔膜（Langmuir film）是研究最广泛的聚合物涂层之一。通过将两亲性分子滴加到气-水界面，可形成朗缪尔膜5-8。随后可通过物理或化学吸附的方式将该膜转移到固体表面，并利用垂直或水平转移方法调控分子在固体表面的构象9-12。通过压缩气-水界面，可精确调控朗缪尔膜的密度。近年来，该方法已被证明在利用两亲性嵌段共聚物制备纳米尺度的“海-岛”结构方面同样有效。这些纳米结构被认为由疏水链段构成的内核和亲水链段构成的外壳组成13-17。此外，通过调控嵌段共聚物在界面处的分子占据面积（Am），可控制表面纳米结构的数量。
我们专注于一种原创且独特的无支架组织工程技术——细胞片工程技术，该技术利用温度响应性培养表面。该开发技术已应用于多种器官的再生治疗18。温度响应性培养表面是通过将一种温度响应性分子——聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PIPAAm）接枝到表面而制备的19-27。PIPAAm及其共聚物在水性介质中表现出约32 °C的低临界溶解温度（LCST）。该培养表面也表现出在疏水性和亲水性之间随温度变化的可逆转换。在37 °C时，接枝了PIPAAm的表面呈疏水性，细胞能够像在传统组织培养用聚苯乙烯表面一样，顺利贴附并在其上增殖。当温度降低至20 °C时，表面变为亲水性，细胞则会自发地从表面脱离。因此，通过改变温度，即可将培养至融合状态的细胞以完整细胞片的形式收获。这种随温度变化的细胞贴附与脱离特性，也可通过朗缪尔膜涂覆法制备的表面在实验室演示中实现26, 27。研究人员制备了由聚苯乙烯（P(St)）和PIPAAm组成的嵌段共聚物的朗缪尔膜（St-IPAAm）。具有特定Am值的朗缪尔膜可水平转移至经疏水化修饰的玻璃基底上。此外，还评估了细胞在所制备表面上随温度变化的贴附与脱离行为。
本文描述了一种在玻璃基底上制备由热响应性两亲嵌段共聚物组成的纳米结构朗缪尔膜的实验方案。该方法可能为表面科学多个领域中的有机纳米薄膜制备提供一种有效的技术手段，并有助于更有效地调控细胞在表面的黏附以及从表面的自发脱离。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-异丙基丙烯酰胺</td><td>Kohjin</td><td></td><td>无目录编号</td></tr><tr><td>偶氮二(4-氰基戊酸)</td><td>和光纯药工业</td><td>016-19332</td><td></td></tr><tr><td>苯乙烯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4972</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5-三氧六环</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T81108</td><td></td></tr><tr><td>1,4-二氧六环</td><td>和光纯药工业</td><td>045-24491</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>中野</td><td>11482-15</td><td></td></tr><tr><td>链霉素</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>青霉素</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>日本生物血清公司</td><td>JBS-11501</td><td></td></tr><tr><td>BAECs</td><td>健康科学研究中心资源库</td><td>JCRB0099</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>松内玻璃工业</td><td>C024501</td><td></td></tr><tr><td>AFM NanoScope V</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H NMR INOVA 400</td><td>Varian, Palo Alto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATR/FT-IR NICOLET 6700</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPC HLC-8320GPC</td><td>东曹</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000</td><td>东曹</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Langmuir-Blodgett 沉积槽&amp;nbsp;</td><td>KSV Instruments</td><td>KN 2002</td><td>KSV NIWA 中型槽</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE TE2000-U</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于组织工程的温敏型纳米结构表面的制备

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

通过朗缪尔-施弗特（Langmuir-Schaefer）法制备了固定有温敏性聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PIPAAm）的表面，用于调控细胞的黏附与脱离。采用可逆加成-断裂链转移（RAFT）自由基聚合方法合成了由聚苯乙烯和PIPAAm组成的两亲性嵌段共聚物（St-IPAAms）。将St-IPAAm分子的氯仿溶液轻轻滴加至朗缪尔槽装置中，并水平移动装置的两侧挡板以压缩薄膜，调节其密度。随后，利用表面固定装置将St-IPAAm朗缪尔膜水平转移至经疏水化修饰的玻璃基底上。原子力显微镜图像清晰显示了表面存在纳米级的“海-岛”结构。通过改变温度至PIPAAm分子的低临界溶解温度范围，可调控细胞在所制备表面上黏附与脱离的强度、速率及质量。此外，在优化后的表面上成功回收了二维细胞结构（细胞片）。这些独特的PIPAAm表面在调控细胞黏附与脱离强度方面具有潜在应用价值。

通过RAFT自由基聚合方法合成了由聚苯乙烯和聚(N-异丙基丙烯酰胺)（St-IPAAm）组成的嵌段共聚物，其具有特定的分子量。如Moad et al.28所述，采用ECT作为链转移剂。合成了两种具有不同PIPAAm链长度的St-IPAAm分子，并通过1H核磁共振（NMR）和凝胶渗透色谱（GPC）对所得嵌段聚合物进行了表征。St-IPAAm的分子量分别为32,800和67,900，分子量分布较窄（1.31和1.50）。聚苯乙烯大分子RAFT试剂和PIPAAm的单体转化率分别为17.4%和超过85.0%。所合成的St-IPAAm分别命名为St-IPAAm170和St-IPAAm480。
通过将溶于氯仿溶液中的St-IPAAm分子滴加到气-水界面，制备了具有不同分子面积（Am）的Langmuir膜（图1A）。滴加St-IPA...

采用朗缪尔-舍弗法（Langmuir-Schaefer method）制备了由热响应性嵌段共聚物组成的纳米级海-岛结构表面，用于调控细胞的自发黏附与脱离。该表面的制备过程以及细胞在其表面的黏附与脱离行为均实现了可视化观察。

温敏性聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PIPAAm）固定化表面的制备及其对细胞黏附与脱附的调控

本研究采用嵌段共聚物的朗缪尔-许弗方法，其总体目标是通过调控细胞黏附力和附着状态，在不同条件下于温度响应性表面制备细胞片层。该方法有助于解答生物材料领域中的关键问题，例如生物相容性材料、细胞培养表面以及生物分离技术。该技术的主要优势在于能够调控温度响应性表面与细胞之间的相互作用，并可优化细胞片层回收的修饰条件。尽管该方法可用于研究细胞与表面之间的相互作用，但也同样适用于生物分离和生物膜等其他系统。首先，将苯乙烯、ECT 和 ACVA 溶解于 40 毫升 1,4-二氧六环中。在真空条件下，用液氮冷冻溶液 15 至 20 分钟，以去除反应性物质。将溶液在室温下缓慢解冻后，重复此冷冻、抽真空、解冻、脱气循环三次。将反应体系置于油浴中，在70摄氏度下聚合15小时，得到作为大分子RAFT试剂的聚苯乙烯。用800毫升乙醚沉淀聚苯乙烯大分子RAFT试剂，并在真空条件下干燥。接下来，将IPAAm单体、聚苯乙烯大分子RAFT试剂和ACVA溶解于4毫升1,4-二氧六环中。采用与之前相同的冷冻-抽气-解冻脱气循环方法去除溶液中的氧气。脱气完成后，在油浴中于70摄氏度条件下进行聚合反应，持续15小时。最后，以与聚苯乙烯大分子RAFT试剂相同的方法获得合成的St-IPAAm分子。用过量的丙酮和乙醇清洗玻璃基底，并超声处理五分钟以去除表面污染物。将基底置于65摄氏度的烘箱中干燥30分钟。然后，在室温下使用氧气等离子体活化基底表面。将基底浸入含有1%六甲基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中，在室温下过夜，以对基底进行硅烷化处理。随后，用甲苯清洗硅烷化后的基底，并将其浸入丙酮中30分钟，以去除未反应的试剂。将基底在 110 摄氏度下退火两小时，以充分固定表面。最后，使用玻璃刀将硅烷化基底切割成 25 毫米 × 24 毫米，以适配细胞培养皿。将朗格缪尔膜仪放置于柜子中，防止灰尘积聚。用蒸馏水和乙醇清洗表面张力仪的挡板，以去除污染物。用无绒布擦拭槽体和挡板使其干燥。然后向槽中加入约 110 毫升的蒸馏水，并将挡板置于槽的两侧。接着，用燃气喷灯加热用于监测表面张力的铂金威尔赫米板，直至板体变红。然后用蒸馏水清洗该板，以去除污染物。将威尔赫米板悬挂在连接于表面压力测量仪器的金属丝上。根据制造商的方案将表面压力测量仪器归零。通过槽体两侧的屏障压缩槽内空气与水的界面，直至界面面积缩小至约50平方厘米，且无聚合物液滴存在。吸取任何微小污染物，直至表面压力接近0毫牛顿每米。调整两侧的屏障，并添加蒸馏水以补偿蒸馏水的减少量。接下来，将五毫克合成的 St-IPAAm 分子溶解于五毫升氯仿显影液中。然后，使用微量注射器或微量移液器，将 27 微升溶于氯仿中的 St-IPAAm 缓慢滴加至水槽中。等待五分钟，使氯仿完全蒸发后，将两侧屏障水平移动，以压缩表面的 St-IPAAm 分子。保持屏障压缩速率为每秒 0.5 毫米，直至达到目标面积 50 平方厘米。在压缩过程中，根据仪器制造商的操作说明，使用连接在表面压力测量仪器上的铂金威尔赫米板测定表面压力 π-A 等温线。达到目标面积后，保持表面五分钟，使 St-IPAAm 分子松弛。分子在压缩后不会立即达到平衡状态。随后，使用转移装置将 Langmuir 膜转移至疏水化修饰的玻璃基底上，持续五分钟，以牢固吸附薄膜。将疏水性玻璃基底平行固定在装置上。将装置连接至对准平台并垂直移动。使用转移装置水平抬起基底，并在干燥器中干燥一天。为制备细胞悬液，将牛颈动脉内皮细胞（BAECs）在含胎牛血清（FBS）和青霉素的DMEM培养基中，于37摄氏度、5%CO2和95%空气条件下，在组织培养级聚苯乙烯培养器皿中培养至30%汇合度。达到汇合度后，在37摄氏度、5%CO2和95%空气条件下，用3毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液处理BAECs 3分钟，随后加入10毫升含10%FBS的DMEM培养基以终止胰蛋白酶-EDTA的消化作用。将细胞悬液收集到50毫升的锥形离心管中。在120 × g条件下离心5分钟，吸除上清液，并将细胞重悬于10毫升DMEM培养基中。使用一次性血细胞计数板计数后，以每平方厘米10,000个细胞的浓度将回收的细胞接种至St-IPAAm表面。在37摄氏度、5% CO2和95%空气条件下，使用配备培养箱的显微镜观察表面的细胞。接着，使用洁净台中配备的紫外灯对St-IPAAm表面进行灭菌。在37摄氏度下，利用10倍放大倍率的相差显微镜，记录贴壁BAECs的延时图像，持续约24.5小时。BAEC 细胞黏附后，在 20 摄氏度下记录 BAECs 从 St-IPAAm 表面脱落的过程，持续约 3.5 小时。在优化了Langmuir膜转移表面的细胞黏附与脱落条件后，首先按照前述方法培养 BAECs 以制备细胞片。在 St-IPAAm 表面上接种密度为每平方厘米 100,000 个细胞。在37摄氏度、5%CO2条件下孵育三天。在20摄氏度时，汇合的BAECs自发脱落。此处展示了温度响应性Langmuir膜转移表面的制备过程。将合成的St-IPAAm氯仿溶液轻轻滴加至空气-水界面。利用两个屏障在界面上压缩St-IPAAm分子，直至达到目标面积50平方厘米。在压缩过程中测量表面压力，以检测Langmuir膜是否存在任何缺陷。压缩后，将经疏水性修饰的盖玻片基底通过定位台水平放置于界面处。将基底水平提起并干燥一天。此步骤完成后，St-IPAAm 表面即可用于细胞培养实验。此处展示了苯乙烯-异丙基丙烯酰胺（St-IPAAm）表面原子力显微镜地形图像的代表性结果。在两种St-IPAAm表面上均观察到了纳米结构。纳米结构的尺寸和形状强烈依赖于AM以及St-IPAAm的组成。图中显示了在接枝有 St-IPAAm 480 且分子面积为 40 平方纳米每分子的 Langmuir 膜转移表面上回收得到的细胞片的宏观图像。细胞在 37 摄氏度下于 St-IPAAm 170 和 St-IPAAm 480 表面培养三天后达到汇合状态。当温度从 37 摄氏度降至 20 摄氏度时，细胞片得以快速回收。观看本视频后，您应充分理解如何制备聚合物、如何设计聚合物的分子组成、如何制备与转移朗缪尔膜、如何控制细胞的黏附与脱附，以及如何回收细胞片层。该技术的发展为生物材料与组织工程领域的研究人员探索细胞与表面之间的相互作用，以及退行性疾病治疗中所用的细胞培养策略，开辟了新的途径。该技术的应用前景还延伸至细胞移植治疗领域，因其具备制备来源于患者多种细胞类型的细胞片层的潜力。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

温敏纳米结构表面的组织工程准备

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基于Janus基纳米管与纤连蛋白的仿生纳米基质的制备及其用于干细胞黏附

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用于组织工程的温敏型纳米结构表面的制备

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