Name: 幕式柱:效率和灵敏度的优化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 学习优化幕式柱流动比率以提高高效液相色谱的分离效率和灵敏度。该方法适用于环境科学、法医鉴定及痕量样品分析领域，为研究人员提供经济高效的分析手段。

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其中一位作者（DK）感谢获得澳大利亚研究生奖学金。

注意：请在使用所有材料和试剂前查阅其材料安全数据表（MSDS）即， 甲醇的安全数据表（MSDS）。处理溶剂和高效液相色谱（HPLC）流动相时，应遵守所有适当的安全操作规程。确保正确使用HPLC的工程控制装置、分析天平和检测器仪器，并佩戴适当的个人防护装备（安全眼镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋履）。
注意：本方案包含如何在配备紫外-可见光检测器的高效液相色谱系统上使用CF柱的说明。编写本方案时假定读者已具备色谱分析的基本知识和实践经验。
1. 高效液相色谱仪的设置
注意：本部分可根据分析人员的需求进行调整， 即， 溶剂选择、检测波长和流速设置，需与目标样品相适应。
<ol>
	<li>使用100%超纯水对高效液相色谱仪进行准备例如，A通道使用Milli-Q水作为流动相，B通道使用100%甲醇作为流动相，并根据仪器制造商的要求冲洗泵。</li>
	<li>将紫外-可见光检测器设置为254 nm。</li>
	<li>选择预注射分流模式或双泵流动模式进行设置。若采用分流模式，请进入步骤2；若采用双泵模式，请进入步骤3。</li>
</ol>
2. 分流系统设置
<ol>
	<li>断开自动进样器的进样阀与泵管之间的连接。</li>
	<li>将三通接头连接至泵管。</li>
	<li>将一段15 cm长、内径为0.13 mm的管路连接至T型接头的每个接口。</li>
	<li>将一根管路从T型接头连接至自动进样器的进样阀。</li>
	<li>将泵设置为 1.0 ml/min-1.</li>
	<li>在将泵管路连接至CF柱入口之前，按照步骤2.7将流路的分段比例调节至40%:60%（中心管路：外围管路）。</li>
	<li>分流系统中CF进样比例的调节
	<ol>
		<li>使用分析天平称量两个空的收集容器的质量，并将其中一个容器标记为“中央”，另一个标记为“外周”（分别用于自动进样器至中心端口的管路和T型接头至外周端口的管路）。</li>
		<li>在1.0分钟内，将从进样器流出的流动相（即即将连接色谱柱的管路）收集至收集容器中，该容器的质量已在2.7.1中测定。</li>
		<li>将收集容器重新置于分析天平上称重，确定所收集流动相的质量。</li>
		<li>重复步骤 2.7.2 至 2.7.3，针对从 T 型接头流出并连接至外周端口的洗脱液进行操作。</li>
		<li>确定流速百分比（ml min-1）根据以下公式计算每条流速线的数值： 
		<img alt="静力平衡方程：中央端口与外周端口重量百分比公式示意图" src="/files/ftp_upload/53471/53471eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 1"></li>
		<li>调节流速比例至40%:60%（±2%）（进样器至 中央 三通管到导管的连接线 外周 端口）。如果从注射器到 中央 端口流量百分比超过40%时，可通过减小管路内径或增加其长度来提高压力降。若从进样器到 中央 当端口流量百分比低于40%时，应增大管路的内径或缩短管子的长度。</li>
		<li>调节好流速比后，关闭泵流。</li>
		<li>将进样器的管线连接至色谱柱进样口的中心端口，将T型接头的管线连接至色谱柱进样口的侧端口。</li>
		<li>缓慢将流速升至1.0 ml/min-1 在100% B相条件下。</li>
		<li>用1.0 ml/min的流速使100%甲醇（B通道）流动相流经色谱柱（内径4.6 mm，长度100 mm），以平衡色谱柱-1 10分钟。此时间可根据用户使用的其他柱子的尺寸进行相应调整。</li>
		<li>对于CF出口的调节，请进入第4步“CF出口流量调节”。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 双泵系统设置
<ol>
	<li>将HPLC系统泵连接至进样器，然后将进样器的管线连接至色谱柱的中心入口端口。</li>
	<li>将额外的泵直接连接至色谱柱的外周入口端口。注意，第二个泵绕过进样器。</li>
	<li>将连接至中心端口的系统泵流速升至0.4 ml min-1（代表总流速1.0 ml min-1的40%），流动相为100%甲醇（B管线）。</li>
	<li>与步骤3.3同时，将外周泵的流速升至0.6 ml min-1（代表总流速1.0 ml min-1的60%），流动相为100%甲醇（B管线）。</li>
	<li>使用100%甲醇（B管线）流动相，以1.0 ml min-1的流速冲洗色谱柱（4.6 mm内径 × 100 mm长度）10分钟，以平衡色谱柱。此时间可根据用户使用的其他规格色谱柱的尺寸按比例调整。</li>
	<li>如需调节CF出口，请进入第4步“CF出口流路的调节”。</li>
</ol>
4. CF 出口流量的调节
<ol>
	<li>使用一段15 cm长、内径为0.13 mm的管路将中心出口端口连接至紫外-可见检测器。</li>
	<li>将一段15 cm长、内径为0.13 mm的管路连接至CF柱的侧端出口。</li>
	<li>在分析天平上称量两个空收集容器的质量，并将其中一个标记为中央，另一个标记为外周。</li>
	<li>持续1.0分钟，将紫外-可见光检测器（中心流路）流出的流动相收集至标记为“central”的收集容器中，该容器的质量已在步骤4.2中测定。</li>
	<li>在分析天平上重新称量装有收集洗脱液的收集容器，并确定所收集流动相的质量。</li>
	<li>重复步骤 4.4 至 4.5，针对从外周出口端口流出的洗脱液进行操作。</li>
	<li>根据以下公式确定每条流路的流量百分比： 
	<img alt="出口端口重量计算；中心端口与外周端口百分比的计算公式。" src="/files/ftp_upload/53471/53471eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 2"></li>
	<li>调节流速比例至21%:79%（±2%）（紫外-可见光中心出口流速：侧边出口流速） ). 如果紫外-可见光谱仪测得的中心流速百分比高于21%，则通过减小连接在紫外-可见光谱检测器出口处管路的内径或增加其长度来提高压降。如果紫外-可见光谱仪测得的中心流速百分比低于21%，则增大连接在紫外-可见光谱检测器出口处管路的内径或缩短管路长度。每次改变管路长度后，均需重复步骤4.3至4.7。 
	注意：在“虚拟”2.1 mm 内径模式下，CF 列已准备就绪，可供分析。</li>
</ol>

<ol><li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+parallel+segmented+outlet+flow+columns+for+enhanced+mass+spectral+sensitivity+at+high+chromatographic+flow+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">The use of parallel segmented outlet flow columns for enhanced mass spectral sensitivity at high chromatographic flow rates.</a> Rapid Commun. Mass Sp. 26 (8), 943-949 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology%3A+Parallel+segmented+outlet+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr. A. 1232 (0), 47-51 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology%3A+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr. A. 1270 (0), 204-211 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111 (0), 3-7 (2013).</li>
<li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803 (0), 154-159 (2013).</li>
<li>Kocic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+through-put+and+highly+sensitive+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+separations+of+essential+amino+acids+using+active+flow+technology+chromatography+columns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">High through-put and highly sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry separations of essential amino acids using active flow technology chromatography columns.</a> J. Chromatogr. A. 1305 (0), 102-108 (2013).</li>
<li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography%3A+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr. A. 1335 (0), 122-135 (2014).</li>
<li>Shellie, R., Haddad, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+two-dimensional+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comprehensive two-dimensional liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 386 (3), 405-415 (2006).</li>
<li>Abia, J. A., Mriziq, K. S., Guiochon, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+heterogeneity+of+some+analytical+columns+used+in+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Radial heterogeneity of some analytical columns used in high-performance liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 1216 (15), 3185-3191 (2009).</li>
<li>Knox, J. H., Laird, G. R., Raven, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+radial+and+axial+dispersion+in+liquid+chromatography+in+relation+to+the+%26%2334%3Binfinite+diameter+effect%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Interaction of radial and axial dispersion in liquid chromatography in relation to the &#34;infinite diameter effect&#34.</a> J. Chromatogr. A. 122 (0), 129-145 (1976).</li>
<li>Miyabe, K., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+column+radial+heterogeneity+from+an+analysis+of+the+characteristics+of+tailing+peaks+in+linear+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Estimation of the column radial heterogeneity from an analysis of the characteristics of tailing peaks in linear chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 830 (1), 29-39 (1999).</li>
<li>Shalliker, R. A., Scott Broyles, B., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+and+radial+diffusion+coefficients+in+a+liquid+chromatography+column+and+bed+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Axial and radial diffusion coefficients in a liquid chromatography column and bed heterogeneity.</a> J. Chromatogr. A. 994 (1-2), 1-12 (2003).</li>
<li>Gritti, F., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+thermal+heterogeneity+of+the+column+on+chromatographic+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of the thermal heterogeneity of the column on chromatographic results.</a> J. Chromatogr. A. 1131 (1-2), 151-165 (2006).</li>
<li>Shalliker, R. A., Wong, V., Broyles, B. S., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+bed+compression+in+an+axial+compression+liquid+chromatography+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Visualization of bed compression in an axial compression liquid chromatography column.</a> J. Chromatogr. A. 977 (2), 213-223 (2002).</li>
<li>Tallarek, U., Albert, K., Bayer, E., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+transverse+and+axial+apparent+dispersion+coefficients+in+packed+beds%5BTitle%5D)+AND+%22AICHE+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of transverse and axial apparent dispersion coefficients in packed beds.</a> AICHE J. 42 (11), 3041-3054 (1996).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations%3A+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> J. Sep. Sci. 35 (3), 410-415 (2012).</li>
<li>Shalliker, R. A., Broyles, B. S., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+evidence+of+two+wall+effects+in+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Physical evidence of two wall effects in liquid chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 888 (1-2), 1-12 (2000).</li>
<li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+segmented+flow+chromatography+columns%3A+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+%27virtual%27+narrow+bore+column%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr. A. 1262 (0), 64-69 (2012).</li>
<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+a+new+concept+chromatography+column%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li>
<li>Foley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+and+Reliability%3A+an+Intercontinental+Study+of+Curtain+Flow+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Thermo+Scientific%22%5BJournal%5D)">Precision and Reliability: an Intercontinental Study of Curtain Flow Chromatography.</a> Thermo Scientific. , (2013).</li>
<li>Pravadali-Cekic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+Approaches+for+the+Analysis+of+Complex+Samples+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22University+of+Western+Sydney%22%5BJournal%5D)">Multidimensional Approaches for the Analysis of Complex Samples using HPLC.</a> University of Western Sydney. , PhD thesis (2014).</li>
<li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116 (0), 230-234 (2014).</li>
<li>Foley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curtain+flow+chromatography+%28%27the+infinite+diameter+column%27%29+with+automated+injection+and+high+sample+through-put%3A+The+results+of+an+inter-laboratory+study%5BTitle%5D)+AND+%22Microchem.+J%22%5BJournal%5D)">Curtain flow chromatography ('the infinite diameter column') with automated injection and high sample through-put: The results of an inter-laboratory study.</a> Microchem. J. 110 (0), 127-132 (2013).</li>
</ol>

本工作由 UWS 和 ThermoFisher Scientific 资助。

本研究对CF色谱柱进行了实验室间分析，以检测其在效率和灵敏度方面的分析性能。CF色谱柱采用双泵系统，如“3. 双泵系统设置”部分所述，在CF色谱柱入口处实现40:60（中心:外围）的流速比。通过将每台泵的流速分别设置为总流速的40%和60%，达到40:60（中心:外围）的流速比。CF色谱柱出口通过“4. CF出口流速调节”部分所述的步骤，调节至内径为2.1 mm的“虚拟”色谱柱。使用含有苯乙醚、丁基苯和戊基苯的混合样品作为测试标准品，比较内径为4.6 mm的CF色谱柱（22:78）与传统的4.6 mm和2.1 mm内径色谱柱的分离性能。图4展示了使用三种色谱柱分别对测试混合物进行色谱分离的叠加图。该图中观察到的主要差异是，使用CF色谱柱获得的分离信号响应显著增强。如预期，由于色谱条件已按色谱柱横截面积进行比例缩放，4.6 mm和2.1 mm内径传统色谱柱的信号响应几乎完全相同。
线性关系和检测限也在CF模式与常规操作模式之间进行了评估，其中在不同的高效液相色谱系统上，以不同的流速制备并分析了一系列标准品的重复样品。无论使用哪种高效液相色谱系统或何种...

近年来，高效液相色谱（HPLC）的色谱柱技术取得了显著进展；由于采用了更小的颗粒尺寸以及更高效的核壳型颗粒，色谱峰容量已大幅提升。由于分离效率普遍提高，随之而来的效应是检测灵敏度的提升，因为色谱峰变得更尖锐，因而更高1-8。
然而，径向床层非均一性仍然是所有色谱柱性能的限制因素，但这并非新问题，因为色谱工作者多年来早已认识到这一点。色谱柱床层在径向9-12和沿柱轴方向10,12-15均存在非均一性。其中，壁面效应尤其显著，是导致分离性能下降的重要原因7,16-18。Shalliker 和 Ritchie7 近期已综述了色谱柱床层非均一性的相关方面，因此此处不再进一步讨论。但需指出的是，柱床填充密度的差异以及壁面效应会导致溶质塞的变形，使得溶质带在通过色谱柱时以类似部分中空的汤碗形状的塞状物出峰，而非基础教学资料中通常描绘的薄而平整的实心圆盘状7。当通过实验对溶质在床层中的迁移过程进行可视化观察时，发现柱内溶质塞的剖面呈部分中空状，且谱带拖尾部分主要来源于样品塞在柱壁区域的组分。最终结果是，分离这些“部分中空”的溶质塞所需的理论塔板数，远高于若溶质塞为实心且平整时所需的数量12,14,17。为克服与壁面效应及径向填充密度变化相关的谱带展宽问题，一种名为主动流体技术（Active Flow Technology, AFT）的新型色谱柱技术被设计出来7,19。该设计的目的是通过物理方式分离沿柱壁区域流动的流动相与柱体径向中心区域流动的流动相，从而消除壁面效应19。AFT 柱主要有两种类型：平行分段流（Parallel Segmented Flow, PSF）柱和帘流（Curtain Flow, CF）柱7。由于本实验方案旨在介绍 CF 柱的使用与优化，因此不再进一步讨论 PSF 柱。
帘式流（CF）
帘流（Curtain Flow, CF）色谱柱结构在色谱柱的入口和出口均采用AFT端接头。AFT端接头由位于多通道接头内部的环形烧结片组成。该烧结片由三部分构成：一个多孔的径向中心区域，与端接头的中心通道对齐；一个多孔的外周区域，与端接头的外围通道对齐；以及一个不透性的环形隔层，用于分隔上述两个多孔区域，防止烧结片的径向中心区域与外周区域之间发生交叉流动19。图1展示了AFT烧结片的结构设计，图2展示了CF色谱柱的结构形式。在此操作模式（CF）下，样品通过入口端接头的径向中心通道注入，同时额外的流动相通过入口端接头的外围通道引入，以“帘流”方式包覆溶质在色谱柱径向中心区域的迁移过程。因此，样品仅从色谱柱床层的径向中心区域进入，而色谱柱的外周区域仅有流动相通过。研究表明，对于内径为4.6 mm的色谱柱，其入口端接头中心通道与外围通道的体积流速比约为40:60时效果最佳6,7,16。CF色谱柱的AFT出口端接头可调节中心通道与外围通道的流速比例，通过压力调控可实现几乎任意所需的比例。优化CF色谱柱可显著提升该技术在分离效率或检测灵敏度等方面的多种功能性能。通过这种方式，可构建一种“无壁”、“无限直径”或“虚拟”色谱柱6,10,18,20。CF色谱柱的设计目的在于主动调控样品在色谱柱内的迁移路径，防止样品扩散至柱壁区域。因此，当样品流出至检测器时，其溶质浓度达到最大化，与传统色谱柱结构相比，使用紫外（Ultraviolet, UV）检测时灵敏度可提高约2.5倍16，而使用质谱检测时提升更为显著6。
CF色谱柱非常适合低浓度样品，因为其检测灵敏度更高。此外，当与流速受限的检测器（如质谱仪（MS））联用时，CF色谱柱尤为理想6。例如，一个内径为4.6 mm的AFT色谱柱，通过将出口中心流速调节至21%，在相同线性流速下运行时，可向检测器输送与标准内径2.1 mm色谱柱相同体积的溶剂。同样，通过将出口中心流速调节至43%，该AFT色谱柱也可被调节为向检测器输送与内径3.0 mm色谱柱相同体积的载样量。事实上，可通过调节实现任意“虚拟”色谱柱规格，以满足特定的分析需求6,18,22。使用这些专门设计的进出口端接头，可确保形成真正的无壁色谱柱结构。
将溶剂输送系统连接到进样口的中心端口和侧端口有两种方式：分流系统6和双泵系统6,7。图3展示了这两种CF系统的配置方式。
分流系统
在分流系统中（图3A泵流在进入进样器之前，使用无死体积的T型接头进行分流，其中一路流动相流路连接至进样器，随后连接至色谱柱入口端接头的中心端口；另一路流动相流路则绕过进样器，直接连接至色谱柱入口的外周端口。在分流过程中，需在管路连接至色谱柱前，将两路流速比例调节为40:60（中心:外周）。 即从进样器到中心，泵到外周。
双泵系统
CF 柱在柱入口接头处需要两股流动相流路。根据高效液相色谱仪自动进样器/进样阀的类型，可能无法实现分流配置，因此可通过两台泵实现 CF（图 3B21）。每台泵分别分配并连接至中心端口或外周端口，流速设定为中心端口占总流速的 40%，外周端口占 60%。例如，若总流速为 1.0 ml min-1，则中心泵的流速设定为 0.4 ml min-1，外周泵的流速设定为 0.6 ml min-1。
选择何种操作模式在很大程度上取决于高效液相色谱（HPLC）仪器配置和色谱操作模式。例如，在某些自动进样器中，样品加载位置与样品注入位置之间可能发生压力变化，从而破坏分流比例，因此在这种情况下，建议采用双泵系统以实现毛细管分流（CF）的最佳性能。无论为CF色谱柱入口选择何种溶剂输送系统配置，CF出口的优化原则均保持不变。CF色谱柱的出口中心端口应使用尽可能小体积的管路连接至紫外-可见光（UV-Vis）检测器，以最大限度地减少柱后死体积的影响。由于CF色谱柱模拟的是窄径色谱柱，柱出口与检测器之间的死体积会严重损害CF色谱柱的分离性能。因此，必须确保中心端口与UV-Vis检测器之间的管路体积最小，以降低死体积带来的不利影响，如谱带展宽、柱效和灵敏度下降。为此，建议使用窄径管路（内径0.1 mm），以便在不引入额外死体积的前提下灵活调节压力。同时，外周端口也需连接管路并导向废液。在CF色谱柱出口处，可根据分析人员的具体需求调节分流比例。例如，当使用内径为4.6 mm的CF色谱柱时，通常可将分流比例设置为43:57或21:79（中心:外周），分别模拟“虚拟”内径3.0 mm或2.1 mm的色谱柱，从而便于直接对标分离性能。分流比例可通过称量在一定时间内从中心端口连接的检测器出口流出的液体量以及从外周端口流出的液体量来测定。随后可计算出各端口的流量百分比，并通过调整所连接管路的长度或使用不同内径（i.d.）的管路来调节分流比例。
本视频方案详细介绍了CF色谱柱的操作与优化步骤，以提升色谱性能。

<table><tbody><tr><td>高效液相色谱仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>附加泵</td><td></td><td></td><td>若使用双泵 Curtain Flow 系统配置，则必须配备。</td></tr><tr><td>Curtain Flow 高效液相色谱柱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>未定义</td><td>即将商业化</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>任意品牌</td><td></td><td>色谱纯级</td></tr><tr><td>PEEK 管路</td><td>任意品牌</td><td></td><td>多种长度和内径&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK 管切割器</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析天平</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>秒表</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗脱液收集容器</td><td>任意品牌</td><td></td><td>可使用 1–2 ml 样品瓶作为洗脱液收集容器</td></tr><tr><td>三通接头</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

帘流柱：效率与灵敏度的优化

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

主动流技术（Active Flow Technology，AFT）是一种色谱柱技术，通过使用专门设计的多端口端盖装置，提升高效液相色谱柱的分离性能。幕流（Curtain Flow，CF）色谱柱属于AFT系列色谱柱，其设计特点是将样品注入色谱柱填料的径向中心区域，同时在溶质注入区域周围引入一层流动相的“幕流”，以阻止样品向柱壁发生径向扩散。该色谱柱可发挥“无限直径”色谱柱的功能。该设计旨在克服色谱柱填料的径向非均一性，同时最大化将样品载入色谱柱填料的径向中心区域，从而提高检测灵敏度。本文所述方案详细说明了系统与CF色谱柱的安装步骤，以及优化“无限直径”虚拟色谱柱性能的调节过程。

AFT 色谱柱采用专用的烧结设计制备（图1) 以克服色谱柱床的不均匀性并提高分离性能。关于CF色谱柱分离性能的实验室间研究（图2采用双泵系统进行图3B如本方案第3节所述23通过“虚拟”2.1 mm 内径条件对三组分测试混合物进行了分析，其中CF柱中央出口流的21%被导向检测器。三组分测试混合物的分离结果表明，相较于标准色谱柱，CF柱在柱效和灵敏度方面性能更优。该三组分测试混合物包含苯乙醚、丁苯和戊苯，在常规4.6 mm和2.1 mm内径色谱柱，以及分段比为22:78（中心:外围）的4.6 mm内径CF柱上进行分析，以模拟2.1 mm内径条件图4）。分离效率以理论塔板数（N）和灵敏度进行评价。采用CF柱进行分析时，检测限较低（图5）以及敏感性的提高（图4 和 6相较于传统的柱分析方法，无论使用何种实验室或HPLC系统，...

本文介绍了一种在帘流（CF）模式下操作和优化活性流技术（AFT）色谱柱以提高分离性能的实验方案。

主动流技术（Active Flow Technology，AFT）是一种色谱柱技术，通过采用特殊设计的…来提升高效液相色谱柱的分离性能。

本方法的总体目标是通过优化帘流柱，提高分离过程的效率和灵敏度。该方法有助于解决环境科学、法医学以及需要痕量样品分析领域中的关键问题，这些领域均要求采用高效且高灵敏度的分离技术。该技术的主要优势在于，与传统的高效液相色谱（HPLC）分离方法相比，能够显著提高分离效率和分析灵敏度。该方法能够以经济且省时的方式提高分离能力，从而提升分析速度和通量。帘流色谱柱对于高效液相色谱（HPLC）的实际操作者而言是一个新概念，但其使用并不复杂，仅需优化适当的流速比例即可。首先，准备用于高效液相色谱仪流动相 A 和 B 的 100% 超纯水和 100% 甲醇试剂瓶。根据仪器制造商的要求对泵进行排气操作。排气完成后，将泵管路从自动进样器的进样阀上断开。将一个三通接头连接到断开的管线上。在三通接头的每个接口上，分别连接内径为0.13毫米、长度为15厘米的管路。将其中一根管路从三通接头连接至自动进样器的进样阀。最后，将泵的流速设置为每分钟一毫升。将两个空的收集容器去皮，并标记为“中央”和“外周”。用标记为“中央”的容器收集来自进样器管路中流出的流动相，收集时间为60秒。重新称量中心容器，并确定所收集的流动相的质量。通过使用标记为外周的容器收集外周端口的流出液，重复此过程。使用所示公式计算每条管路的流速百分比或毫升每分钟。中央端口流量应约为40%，外周端口流量约为60%。若两者差异超过2%，则需调整管路长度或直径以校正流速比例，随后重复采集与计算步骤。接下来，关闭泵流，将进样器管路连接至色谱柱入口的中央端口。同时，将T型接头的管路连接至色谱柱入口的外周端口。缓慢将流速升至每分钟1毫升，流动相B为100%。为完成系统调谐，以每分钟1毫升的流速流过100%甲醇，持续10分钟，以平衡色谱柱。首先，使用管路将中心出口端口连接至紫外-可见检测器。将相同类型和长度的管路连接到CF柱的侧端出口端口。然后，将泵设置为每分钟一毫升的流速。称量两个空的收集容器，并再次标记其中一个用于中心收集，另一个用于外周收集。使用标记为中心的容器，收集从紫外-可见检测器流出的流动相，持续60秒。重新称量收集容器，以确定流出溶液的质量。使用外周出口端口和标记好的收集容器重复此过程。现在按照之前测量入口流量的方法，确定每条管路的流量百分比。紫外-可见光谱（UV-Vis）管路应为21%，外周出口流量应为79%。如果流速比例偏差显著，可通过调整连接在紫外-可见光检测器出口处的管路尺寸来改变中心流路的百分比。确保色谱柱入口和出口处中心流路与外周流路之间的流速比例符合本方案，对于保障帘流色谱柱的最佳性能至关重要。活性流技术色谱柱采用多通道柱端接头中的特殊筛板设计，旨在克服色谱床层的不均一性，从而提升分离性能。采用常规的4.6毫米和2.1毫米内径色谱柱以及一种4.6毫米内径的帘流色谱柱，对含有苯乙醚、丁苯和戊苯的测试混合物进行了分析。该混合物的分离结果表明，与标准色谱柱相比，帘流色谱柱在分离效率和灵敏度方面具有更优的性能。尽管丁苯的峰体积减小，但使用帘流色谱柱仍使其信号增强。一旦掌握，若操作得当，该技术可在不到半小时内完成建立。帘流柱装置可反复使用，但必须定期检查流速比例。在进行此操作时，务必尽可能接近规定的流速比例。帘流色谱柱为高效液相色谱（HPLC）领域的研究人员开辟了新途径，使其能够突破色谱柱和超高效液相色谱（UPLC）仪器的性能极限，实现更快的样品分析，同时不牺牲分离效果。观看本视频后，您应理解帘流色谱柱的重要性，因为它们能够提供优于传统HPLC色谱柱的分离性能。

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